Chestnut Studying
摘要
Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common cause of low back pain and disability. Recent studies have highlighted the critical role of mitochondrial dysfunction in the progression of IDD. In this study, we investigated the therapeutic potential of taurine in delaying IDD through the activation of mitophagy via the PINK1/Parkin pathway. Our in vitro and in vivo experiments demonstrate that taurine treatment significantly enhances mitophagy, reduces oxidative stress, delays cell senescence, and promotes the removal of damaged mitochondria in nucleus pulposus cells (NPC). Additionally, taurine-mediated activation of the PINK1/Parkin pathway leads to improved mitochondrial homeostasis and slows the progression of disc degeneration. These findings provide new insights into the protective effects of taurine and highlight its potential as a therapeutic agent for IDD.
椎间盘退变(IDD)是导致腰背疼痛和残疾的常见原因。最近的研究强调了线粒体功能障碍在IDD进展中的关键作用。在这项研究中,我们研究了牛磺酸通过激活线粒体自噬来延缓IDD的治疗潜力。我们的体外和体内实验表明,牛磺酸治疗可显著增强线粒体自噬,减少氧化应激,延缓细胞衰老,促进髓核细胞(NPC)中受损线粒体的清除。此外,牛磺酸介导的PINK1/Parkin通路激活可改善线粒体稳态,减缓椎间盘退化的进程。这些发现为牛磺酸的保护作用提供了新的见解,并凸显了其作为IDD治疗药物的潜力。
实验结果1
牛磺酸可缓解TNF-α诱导的大鼠IDD
牛磺酸的化学结构如图1a所示。用TNF-α(20 ng/mL)和牛磺酸(0.3 mM)干预SD大鼠尾椎,4周后收集大鼠尾椎(图1b)。MRI结果显示,TNF-α组大鼠模型椎间盘节段出现明显退变。具体表现为T2信号减弱,模型部位的椎间盘变暗,椎间盘高度指数(DHI)低于对照组(图1c和d)。这意味着模型部位的椎间盘高度降低。然而,在同时服用牛磺酸后,建模部位的T2信号和椎间高度的降低程度有所降低(图1c和d)。这表明牛磺酸可以有效缓解大鼠的IDD。
实验结果2
牛磺酸可修复大鼠椎间盘的合成代谢和分解代谢
通过H&E染色和Safranine O-fast green染色对干预后大鼠的椎间盘进行了鉴定。图像结果显示,TNF-α组大鼠的NP组织细胞数量减少,细胞外基质出现褶皱,NPC中胶原纤维的表达减少,而牛磺酸处理可恢复细胞数量减少和NPC中胶原纤维的表达(图2a)。根据H&E染色法的专业IDD评分,牛磺酸干预有效缓解了TNF-α引起的IDD(图2b)。随后,对大鼠椎间盘组织切片进行免疫荧光染色和蛋白质印迹分析,以分析椎间盘(IVD)分解代谢的代表性蛋白MMP3、IVD的主要胶原成分COL2A以及衰老生物标志物P16、P21和P53的表达变化。结果表明,牛磺酸可有效缓解TNF-α诱导的MMP3、P16、P21和P53表达上调以及COL2A合成减少(图2c-f)。这些进一步证明了牛磺酸可调节退行性椎间盘的新陈代谢,抵抗NPC衰老,从而治疗IDD。
实验结果3
牛磺酸可减轻氧化应激,并提高NPC的活力
从大鼠尾椎间盘提取大鼠NPC,并随后进行体外实验。CCK-8检测显示,在TNF-α(10 ng/mL)干预后第1、3和7天,NPC的活性逐渐减弱,而牛磺酸(0.3 mM)治疗组则缓解了活性最初急剧下降的趋势,并在随后一周内促进了细胞活性的恢复(图3a)。Tunel染色也表明,牛磺酸治疗可减少TNF-α引起的NPC凋亡(图3b和c)。SA-β-gal染色结果表明,TNF-α显著增加了SA-β-gal阳性细胞的比率,并提高了NPC的衰老水平,而同时使用牛磺酸可减弱其毒性(图3d和e)。
衰老过程通常伴随着氧化应激水平的增加,因此作者测试了干预后NPC的ROS水平。实验结果表明,TNF-α干预后NPC的ROS含量显著增加,而牛磺酸治疗组在TNF-α干预后有效降低了氧化应激水平(图3f和g)。此外,作者随后对衰老标记蛋白(P16、P21和P53)和氧化应激生物标志蛋白(BCL2和BAX)进行了WB检测。结果表明,TNF-α干预显著提高了P16、P21、P53和BAX蛋白的表达水平,但下调了BCL2蛋白的表达,但牛磺酸处理后这些蛋白的表达被逆转(图3h和i)。这些结果表明,牛磺酸通过抑制氧化应激来恢复NPC的活性。
实验结果4
牛磺酸可促进NPC线粒体的稳态
为了探究肿瘤坏死因子-α引起的NPC氧化应激水平升高是否是由线粒体功能障碍引起的,作者评估了NPC的线粒体膜电位、线粒体Ca2+浓度和ATP生产能力。JC-1检测显示,肿瘤坏死因子-α诱导大鼠NPC中单体/聚集JC-1减少,这意味着线粒体膜电位丧失,而牛磺酸治疗缓解了这一趋势(图4a和b)。正常细胞线粒体储存大量游离钙,因此线粒体中钙离子浓度也是其功能完整性的指标之一。Rhod-2/AM追踪剂用于检测NPC中的钙离子浓度。实验结果表明,TNF-α组NPC中钙离子浓度降低,但在牛磺酸处理后回升(图4c和d)。线粒体是细胞内ATP合成的主要场所,但实验结果表明,TNF-α的干预导致细胞内ATP含量显著下降,而牛磺酸治疗后NPC的ATP含量得以恢复(图4e)。上述结果表明,牛磺酸具有促进NPC线粒体功能恢复和维持线粒体稳态的作用。
实验结果5
牛磺酸激活PINK1/Parkin通路,诱导线粒体自噬
线粒体吞噬是细胞清除内部受损、退化或异常线粒体的重要方式之一,而PINK1/Parkin途径是大多数细胞因子激活的线粒体吞噬途径。通过WB检测确定了线粒体吞噬激活信号蛋白(PINK1和Parkin)和自噬体结合蛋白(LC3B)的表达水平。结果表明,在TNF-α干预后,这些蛋白的表达水平显著降低,而牛磺酸可有效提高这三种蛋白的表达水平(图5a和b)。
为了进一步探讨牛磺酸对退行性NPC的治疗效果是否与线粒体自噬有关,作者设计了一项后续补充研究,使用线粒体自噬抑制剂布雷非德菌素A(BFA)。CCK-8检测和Tunel染色结果表明,BFA可有效降低牛磺酸对TNF-α诱导的NPC的治疗效果(图5c-e)。SA-β-gal染色结果表明,BFA干预可抑制牛磺酸对TNF-α引起的衰老的抵抗(图5f和g)。P16、P21、P53、MMP3和COL2A蛋白的WB检测结果表明,BFA加剧了TNF-α引起的NPC合成减少和分解增加的代谢失衡,以及髓核细胞的衰老,并显著降低了牛磺酸对此现象的治疗效果(图5h和i)。总之,牛磺酸通过PINK1/Parkin途径激活NPC的线粒体自噬,清除功能失调的线粒体,维持线粒体稳态,从而治疗IDD。
