Chestnut Studying
摘要
The NLRP3 inflammasome promotes inflammation in disease, yet the full repertoire of mechanisms regulating its activity is not well delineated. Among established regulatory mechanisms, covalent modification of NLRP3 has emerged as a common route for the pharmacological inactivation of this protein. Here, we show that inhibition of the glycolytic enzyme phosphoglycerate kinase 1 (PGK1) results in the accumulation of methylglyoxal, a reactive metabolite whose increased levels decrease NLRP3 assembly and inflammatory signaling in cells. We find that methylglyoxal inactivates NLRP3 via a non-enzymatic, covalent-crosslinking-based mechanism, promoting inter- and intraprotein MICA (methyl imidazole crosslink between cysteine and arginine) posttranslational linkages within NLRP3. This work establishes NLRP3 as capable of sensing a host of electrophilic chemicals, both exogenous small molecules and endogenous reactive metabolites, and suggests a mechanism by which glycolytic flux can moderate the activation status of a central inflammatory signaling pathway.
NLRP3炎症小体可促进疾病炎症,但调节其活性的机制尚未完全阐明。在已知的调节机制中,NLRP3的共价修饰已成为该蛋白药理失活的常见途径。在此,我们展示了抑制糖酵解酶磷酸甘油酸激酶1(PGK1)会导致甲基乙二醛的积累,甲基乙二醛是一种活性代谢产物,其水平升高会降低细胞中NLRP3的组装和炎症信号。我们发现,甲基乙二醛通过非酶促、共价交联机制使NLRP3失活,从而促进NLRP3内蛋白质间和蛋白质内的MICA(半胱氨酸和精氨酸之间的甲基咪唑交联)翻译后连接。这项工作证实了NLRP3能够感知一系列亲电化学物质,包括外源性小分子和内源性活性代谢产物,并提出了糖酵解通量可以调节炎症信号传导通路激活状态的机制。
实验结果1
药理PGK1抑制剂可阻断NLRP3炎症小体的组装和活性
NLRP3炎症小体的组装和活性对代谢途径改变产生的反应性代谢物敏感。作者试图确定PGK1抑制剂(如CBR-470-1和CBR-470-2)是否抑制NLRP3炎症小体的组装和活性,这两种化合物都会产生反应性代谢物MGO28。最初,作者监测了在稳定表达GFP标记的ASC(ASC-GFP)的THP1细胞中NLRP3炎症小体的组装。用脂多糖(LPS)处理这些细胞,然后用激活化合物nigericin处理,可触发NLRP3炎症小体的组装,随后形成ASC-GFP斑点。如前所述,ASC-GFP斑点的形成可通过预先用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950处理来抑制,且抑制效果与剂量相关(图1A)。预先用CBR-470-1或CBR-470-2处理2小时,可分别以25和3 μM的IC50(半最大抑制浓度)抑制这些细胞中的ASC-GFP斑点的形成(图1A)。这两种PGK1抑制剂所发挥的抑制作用与MCC950相似,并且当预处理时间超过2小时时,抑制作用仅略有增加(图1A-1C)。
接下来,作者确定了这些化合物抑制NLRP3炎症小体依赖性活性的潜力,包括caspase-1激活、IL-1β分泌和焦亡细胞死亡。用CBR-470-1或CBR-470-2预处理2小时,使用HEK293-Blue-IL-1β报告细胞测量,可抑制THP1细胞和原代树突状细胞分泌IL-1β(图1D和1E),并降低caspase-1活性。CBR-470预处理还能减少NLRC4激活刺激引起的IL-1β分泌,但由于毒性干扰,无法确定对NLRP1激活刺激的抑制作用。CBR-470-1或CBR-470-2在2小时内也阻止了由nigericin诱导的LPS诱导的THP1细胞的焦亡(图1F)。这些结果表明,两种PGK1抑制剂能够阻断NLRP3炎症小体的组装和下游信号传导。由于CBR-470-2比CBR-470-1表现出更强的效力,作者专注于CBR-470-2的进一步机理实验。
实验结果2
CBR-470-2依赖的NLRP3抑制与NRF2激活和NF-κB抑制无关
PGK1抑制剂(包括CBR-470-2)可激活哺乳动物细胞中的NRF2。由于NRF2的激活会抑制NLRP3炎症小体, 作者试图确定该化合物对NLRP3组装和活性的抑制是否归因于NRF2的激活。用CBR-470-2处理2小时,不会诱导THP1细胞中NRF2靶基因NQO1的表达(图2A)。然而,作者确实观察到,用CBR-470-2处理16小时后,NQO1的表达增加。用NRF2抑制剂ML385共同处理,可以阻断NQO1表达的增加。NRF2的另一个靶基因HMOX1也出现了类似的结果。这些结果表明,在2小时的预处理过程中,NRF2并未被激活,而在此期间,作者观察到了CBR-470-2对NLRP3炎症小体组装和激活的抑制作用。
为了进一步研究化合物依赖性NLRP3抑制对NRF2的依赖性,作者监测了ASC-GFP斑点的形成和THP1细胞中的焦亡。这些细胞先经过NRF2抑制剂ML385预处理30分钟,然后经过CBR -470-2处理2小时。在这些实验中,ML385预处理不会影响CBR-470-2依赖性抑制NLRP3炎症小体组装或活性的效力或功效(图2B和2C)。这表明CBR-470-2对NLRP3炎症小体的抑制作用并非通过NRF2激活介导。
接下来,作者确定了CBR-470-2对LPS诱导的NF-κB依赖性NLRP3炎症小体成分表达的潜在影响。与CBR-470-2共同处理3或24小时不会影响LPS诱导的THP1细胞中NLRP3的表达,尽管它会适度降低pro-IL1b的表达(图2D)。然而,在LPS诱导的THP1细胞中,用CBR-470-2处理2小时后,NF-κB靶标(包括NLRP3、ASC和pro-IL-1β)以及其他NLRP3炎症小体成分的蛋白水平并未显著降低(图2E和2F)。这些结果表明,CBR-470-2对LPS诱导的NF-κB靶基因的表达没有影响。
实验结果3
CBR-470-2通过增加PGK1下游的MGO的产生来抑制NLRP3
CBR-470-2对PGK1的抑制作用会导致活性代谢产物MGO的积累。由于NLRP3炎症小体对活性代谢产物的失活很敏感,作者预测CBR-470-2会通过MGO的积累来抑制NLRP3炎症小体的组装和活性。为了验证这一点,作者监测了在THP1细胞中,NLRP3炎症小体的组装(通过ASC-GFP斑点的形成),这些细胞同时接受了CBR-470-2和谷胱甘肽(GSH)的治疗,后者是一种中和活性代谢物的治疗方法。与谷胱甘肽(GSH)联合治疗消除了CBR-470-2对ASC-GFP斑块形成的抑制作用(图3A)。在用CBR-470-1治疗的THP1细胞中观察到了相同的结果。这支持了一种模型,即这些PGK1抑制剂通过一种涉及活性代谢产物(如MGO)积累的机制来抑制炎症小体的组装。
CBR-470-2通过抑制PGK1的酶活性产生MGO。作者预测,PGK1的基因缺失应该会抑制NLRP3炎症小体的组装。作者使用三种不同的siRNA在THP1-ASC-GFP细胞中缺失PGK1,并通过ASC-GFP斑点的形成监测NLRP3炎症小体的组装。作者通过RT-qPCR证实,siRNA处理降低了这些细胞中PGK1的表达(图3B)。三种siRNA均能降低PGK1的表达,从而减少THP1细胞中ASC-GFP斑点的形成(图3C)。这表明,通过基因敲除PGK1,可以重现通过药物抑制PGK1诱导的NLRP3炎症小体组装减少的现象。
接下来,作者确定了直接施用MGO抑制NLRP3炎症小体的可能性。作者用不同浓度的MGO处理THP1细胞,并使用ASC-GFP斑点形成检测法监测NLRP3的组装。用MGO预处理2小时,IC50约为0.52 mM,可抑制NLRP3炎症小体的组装(图3D)。在焦亡细胞死亡方面也观察到了类似的结果,用MGO预处理2小时可提高用LPS和nigericin处理的THP1细胞的存活率。MGO通过共价结合靶向KEAP1来激活NRF2。然而,作者发现,用NRF2抑制剂ML385进行预处理并不能降低MGO处理对ASC-GFP斑块形成的抑制作用,也不能降低其对细胞焦亡的保护作用(图3D)。这些结果表明,MGO依赖性NRF2激活并不影响该代谢物诱导的NLRP3炎症小体组装和活性的降低。作者的结果与MGO通过共价蛋白质修饰的直接机制抑制NLRP3炎症小体组装的模型一致。
接下来,作者研究了CBR-470-2治疗是否能够增加THP1细胞中的MGO水平。作者使用MGO生成的荧光指示剂探针来监测CBR-470-2处理后的THP1细胞中MGO的产生。作者观察到,在用CBR-470-2处理过的THP1细胞中,MGO迅速增加,并在处理后约8小时下降(图3E)。化合物处理产生的细胞内MGO水平与用1mM MGO处理过的THP1细胞中观察到的水平几乎相同,该剂量足以完全抑制NLRP3炎症小体的组装(图3D)。作者还观察到,在用CBR-470-2处理THP1细胞不到1小时后,KEAP1发生交联,这支持了MGO在细胞内快速积累的结论。这表明,用CBR-470-2处理后,细胞内MGO的含量足以抑制NLRP3炎症小体的组装。这些结果表明,CBR-470-2通过抑制PGK1和随后MGO的积累来抑制NLRP3炎症小体的组装。
实验结果4
MGO通过MICA的修饰诱导NLRP3单体的分子间和分子内交联
MGO通过诱导邻近原子的MICA修饰来抑制NRF2抑制剂KEAP1。因此,作者试图确定CBR-470-2治疗产生的MGO是否同样诱导NLRP3分子间交联。用MGO处理2小时,HEK293T细胞中表达的NLRP3-FLAG交联增加,用免疫印迹法测量,高分子量(HMW)NLRP3的积累增加。CBR-470-2还能增加HEK293T细胞中高分子量NLRP3-FLAG的含量。此外,CBR-470-2还能增加THP1细胞中内源性NLRP3的交联,表现为可溶性NLRP3减少,而高分子量NLRP3在不可溶性部分中增加(图4A)。然而,CBR-470-2并未诱导其他炎症小体成分(如NEK7或ASC)的高分子量(HMW)物种的形成,但作者确实观察到HMW CASP1略有增加,尽管其分子量比CASP1二聚体更高。鉴于在用CBR-470预处理的细胞中未观察到ASC斑点的形成,而CBR-470是CASP1募集的上游,因此NLRP3交联可能比CASP1交联更相关。
作者试图确定NLRP3中哪些特定结构域对CBR-470-2或外源性MGO诱导的交联反应最敏感。NLRP3包含多个结构域,包括吡啶(PYN)结构域、核苷酸结合结构域(NBD)和富含亮氨酸的重复结构域(LRR)。作者在HEK293T细胞中表达缺失了每个单独结构域(例如DPYN、DNBD、DLRR)或每个单独结构域(例如PYN、NBD、LRR)的NLRP3-FLAG构建体,并监测了CBR-470-2或MGO处理引起的交联。所有这些构建体在用CBR-470-2或MGO处理过的细胞中都显示出高分子量带增加(图4B)。然而,全长NLRP3-FLAG构建体中PYN域的缺失在两种条件下都强烈抑制了交联。同样,当单独表达时,与其他单独表达的域相比,PYN域在高分子量带中表现出最强有力的增加。重组PYN(残基3-110)在1 mM MGO处理1小时后,也会形成与PYN二聚体和三聚体分子量相对应的高分子量带。因此,作者使用PYN结构域构建体来研究这种修饰的性质。
MICA的修饰是通过将Cys残基与Arg残基交联实现的。作者在HEK293T细胞中过量表达缺失该结构域内所有Cys残基的PYN结构域,并通过免疫印迹监测CBR-470-2处理引起的交联。结果表明,缺失所有Cys残基会阻止CBR-470-2依赖性PYN交联的增加(图4C)。将C108或C130重新引入无半胱氨酸的PYN结构域,部分恢复了CBR-470-2依赖的交联。在MGO细胞中观察到类似的结果,尽管所有构建体都显示出MGO依赖的交联略有增加。这些结果确定了PYN结构域的C108和C130是共价修饰的两个位点。使用两种含炔的探针化合物mCMF859和P207-9175,它们可抑制NLRP3并共价修饰PYN结构域中的C130,作者进一步证实了CBR-470-2处理可减少该半胱氨酸残基的探针标记。这进一步支持了这样一个模型:CBR-470-2抑制PGK1产生的MGO导致该位点的共价修饰。
最后,为了证实MICA修饰发生在NLRP3 PYN结构域内,作者在用CBR-470-2或MGO处理过的HEK293T细胞中过量表达PYN。然后,作者从SDS-PAGE凝胶中切下与PYN二聚体和单聚体结构域相对应的高分子量带,并对这些分离物进行酶切消化。作者通过质谱监测MICA修饰的形成。在C08-R43、C08-R81、C38-R07、C38-R4 3、C108-R89(仅CBR)、C130-R89和C130-R126之间,而在从未经处理的细胞中分离出的PYN单体条带中未观察到(图4D-4G)。C08和C38的交联形成,以及仅包含这些半胱氨酸残基的PYN结构的高分子量带增加幅度极小(图4C),表明这些交联可能发生在分子内。这表明,除了SDS-PAGE观察到的分子间交联(由高分子量带明显显示)外,CBR-470-2处理也会导致分子内交联。这种交联组合表明,NLRP3对糖酵解扰动非常敏感,导致多个位点发生MGO修饰,从而抑制NLRP3炎症小体的组装和活性。
