Chestnut Studying
摘要
Metabolic reprogramming is crucial for activating innate immunity in macrophages, and the accumulation of immunometabolites is essential for effective defense against infection. The NAD+/NADH (ratio of nicotinamide adenine dinucleotide and its reduced counterpart) redox couple serves as a critical node that integrates metabolic pathways and signaling events, but how this metabolite couple engages macrophage activation remains unclear. Here, we show that the NAD+/NADH ratio serves as a molecular signal that regulates proinflammatory responses and type I interferon (IFN) responses divergently. Salmonella Typhimurium infection leads to a decreased NAD+/NADH ratio by inducing the accumulation of NADH. Further investigation shows that an increased NAD+/NADH ratio correlates with attenuated proinflammatory responses and enhanced type I IFN responses. Conversely, a decreased NAD+/NADH ratio is linked to intensified proinflammatory responses and restrained type I IFN responses. These results show that the NAD+/NADH ratio is an essential cell-intrinsic factor that orchestrates innate immunity, which enhances our understanding of how metabolites fine-tune innate immunity.
代谢重编程对于激活巨噬细胞中的先天免疫至关重要,而免疫代谢产物的积累对于有效防御感染也必不可少。NAD+/NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其还原型对应物的比率)氧化还原对作为整合代谢途径和信号事件的关键节点,但该代谢对如何参与巨噬细胞活化仍不清楚。在这里,我们表明NAD+/NADH比值作为一种分子信号,可以分别调节促炎反应和I型干扰素(IFN)反应。沙门氏菌感染导致NADH积累,从而降低NAD+/NADH比值。进一步的研究表明,NAD+/NADH比值升高与促炎反应减弱和I型IFN反应增强相关。相反,NAD+/NADH比值降低则与炎症反应增强和I型干扰素反应抑制有关。这些结果表明,NAD+/NADH比值是协调先天免疫的重要细胞内因子,有助于我们进一步了解代谢产物如何调节先天免疫。
实验结果1
沙门氏菌感染会导致巨噬细胞的新陈代谢重新编程,从而改变NAD+/NADH的比例
为了研究宿主葡萄糖代谢与细菌感染之间的生理相互作用,研究人员对感染了鼠伤寒沙门氏菌的C57BL/6小鼠的血糖水平进行了随时间变化的测量(图1A)。血清葡萄糖水平在感染鼠伤寒沙门氏菌后急剧下降(图1B),这与病毒感染小鼠的观察结果一致。血糖下降迅速,从感染后5小时开始。然而,此时小鼠仍处于禁食状态,这表明沙门氏菌感染引起的低血糖是感染的直接结果,而不是食物摄入减少的结果,这与耶尔森菌感染在短时间内引起小鼠血糖耗竭(与厌食无关)的观察结果一致。在感染后期,血糖降至极低水平(低于5 mM)。此外,鼠伤寒沙门氏菌感染还导致巨噬细胞培养基中的葡萄糖水平下降(图1C)。葡萄糖水平的下降表明,在感染期间,宿主或巨噬细胞加速消耗葡萄糖,因为鼠伤寒沙门氏菌细胞仅占代谢物总浓度的一小部分。为了支持这一观点,LPS和热灭活的鼠伤寒沙门氏菌处理也导致葡萄糖消耗增加。
小鼠腹膜巨噬细胞(PM)的RNA测序(RNA-seq)显示,在感染伤寒沙门氏菌后,糖酵解基因上调(图1D)。值得注意的是,与TCA循环(克雷布斯循环)和氧化磷酸化相关的基因下调(图1D)。此外,鼠伤寒沙门氏菌感染可诱导Glut1(葡萄糖转运蛋白)、Hk2(己糖激酶2)和Pfkfb3(关键糖酵解酶)以及其他糖酵解基因的表达(图1E)。相比之下,线粒体呼吸相关基因的表达则受到抑制(图1F)。此外,LPS和热灭活的S. Typhimurium也诱导了糖酵解基因,但抑制了巨噬细胞中的线粒体呼吸相关基因。这与之前的研究结果一致,即炎症性巨噬细胞中的氧化磷酸化过程受到抑制。作者还进一步检测了感染了S. Typhimurium的小鼠肝脏中糖酵解基因的上调和线粒体呼吸相关基因的下调(图1G、1H)。感染或LPS或热灭活的S. Typhimurium后,小鼠血清(图1I)或PM(图1J)中乳酸增加,支持了激活的糖酵解。此外,感染后检测到细胞ATP水平升高(图1K)。相反,感染严重抑制了耗氧率(OCR)(图1L),表明线粒体呼吸功能异常。这些结果表明,沙门氏菌感染导致宿主葡萄糖代谢重新编程,从线粒体呼吸转变为类似于沃堡效应的糖酵解。
能量代谢物的代谢组学分析进一步证实了糖酵解通量的激活和TCA循环中关键代谢物的积累。具体来说,糖酵解中间产物二羟基丙酮磷酸(DHAP)、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和乳酸的积累。此外,一些TCA循环中间产物,包括富马酸、琥珀酸、L-苹果酸和异柠檬酸,也增加了(图1M)。作者还注意到,感染期间,细胞中间代谢的关键因子NAD水平下降(图S1I)。此外,作者检测到感染鼠伤寒沙门氏菌的肺泡上皮细胞中NADH水平升高,NAD+/NADH比值下降(图1N)。这可以解释为感染后产生NADH的糖酵解激活和 消耗NADH的ETC。总之,作者发现细菌感染会导致宿主葡萄糖代谢重新编程,其特点是糖酵解激活和线粒体呼吸抑制,这与NAD+/NADH比值降低有关。
实验结果2
激活糖酵解通量对促炎反应和I型干扰素反应产生不同的影响
作者已经证明,鼠伤寒沙门氏菌感染会导致血糖水平降低和葡萄糖消耗增加(图1B和1C)。为了满足葡萄糖利用增加的需求,作者建立了高血糖(HG)小鼠模型(链脲佐菌素诱导的糖尿病前期小鼠),该模型具有更高的血糖和糖酵解水平。该HG小鼠模型被用于进一步探索葡萄糖代谢与鼠伤寒沙门氏菌感染之间的相互作用,因为血糖水平对于抗菌先天免疫至关重要。随着时间的推移,HG小鼠在感染鼠伤寒沙门氏菌后血糖水平也会下降(图2A),这表明葡萄糖利用增加。鼠伤寒沙门氏菌感染,因为血糖水平对于抗菌先天免疫至关重要。随着时间的推移,在鼠伤寒沙门氏菌感染后,高血糖小鼠的血糖水平也出现下降(图2A),表明葡萄糖利用率增加。此外,腹腔注射LPS(15 mg/kg)也会导致对照组和饥饿组小鼠的血糖水平下降,且无需补充食物。值得注意的是,与正常小鼠相比,高血糖小鼠在LPS刺激后乳酸水平升高。此外,与正常血糖水平的小鼠相比,高血糖小鼠的细菌负荷更高,表明其抗菌免疫受损。与先前的研究一致,高血糖水平抑制了cGAS(环鸟苷酸[GMP]-腺苷酸[AMP] [cGAMP]合成酶)激活诱导的I型干扰素反应。作者还发现,与正常小鼠相比,高血糖小鼠血清中由鼠伤寒沙门氏菌诱导的干扰素β水平降低(图2B)。 磷酸[cGAMP]合成酶)激活诱导的I型干扰素反应。作者还发现,与正常小鼠相比,HG小鼠血清中由鼠伤寒沙门氏菌诱导的干扰素β水平降低(图2B)。令人惊讶的是,高血糖小鼠的血清IL-1β水平显著升高(图2C),表明感染后葡萄糖水平升高会激活IL-1β的产生。总之,这些结果表明高血糖对促炎反应和I型IFN反应的影响是不同的。
作者进一步检测了感染后高血糖小鼠脾脏中天然免疫的mRNA表达。与对照组小鼠相比,细菌感染诱发的高血糖小鼠中Il1b的表达增强,而Nlrp3的表达没有显著增强(图2D)。相反,HG小鼠中Tnfa、Cxcl2、Cxcl1和Ccl5(Rantes)等与I型IFN反应相关的基因被下调(图2E)。培养基中葡萄糖含量过高会下调ISG15蛋白水平(图2F),以及Ifnb1、Tnfa、Ifit2和Isg15 mRNA的表达(图2G)。相反,高血糖会导致Il1b和Nlrp3 mRNA表达增强(图2H)。总之,作者的研究结果表明,高血糖水平激活糖酵解通量,在体内和体外对促炎反应和I型IFN反应产生不同的调节作用,但具体机制尚不清楚。
实验结果3
感染期间,糖酵解通量的中断会减弱炎症反应,增强I型干扰素反应
为了深入研究感染期间宿主葡萄糖稳态如何影响先天免疫反应,作者使用葡萄糖类似物2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)抑制宿主糖酵解,而不影响细菌在巨噬细胞中的入侵和生长。作者发现2-DG抑制了沙门氏菌诱导的乳酸生成(图3A),证实了糖酵解的抑制作用。代谢组学分析也证实了2-DG对糖酵解的抑制作用。接下来,作者使用RNA-seq检测了感染后2-DG处理巨噬细胞中差异表达基因(DEGs)。与感染沙门氏菌的巨噬细胞相比,感染沙门氏菌后2-DG处理巨噬细胞中的免疫系统和先天免疫反应更丰富。先前的研究表明,2-DG可特异性抑制LPS诱导的Il1b表达,但不影响Tnfa或Il6的表达。火山图还显示了2-DG在调节先天免疫反应方面的不同影响,表现为Il1b的下调和Ifnb1的上调(图3B)。此外,热图结果显示,2-DG处理可上调Ifnb1和若干IFN刺激基因(ISG),如Isg15、Isg20、Irf9和Mov10(图3C),这与先前的研究结果一致 这证实了之前的研究,即2-DG可增强病毒诱导的ISG表达。相反,许多促炎基因,如ll1b、Nlrp3、Il12b和Caspase1,在2-DG的作用下被下调(图3C)。这些结果表明,抑制糖酵解可增强感染期间的第一型干扰素反应并减弱促炎反应。
作者进一步发现,2-DG抑制了鼠伤寒沙门氏菌诱导的巨噬细胞IL-1β释放(图3D)。然而,2-DG诱导了TANK结合激酶1(TBK1)的磷酸化(I型干扰素反应激活的标志)和ISG15的表达(图3E)。同样,2-DG处理显著增强了S. Typhimurium诱导的Ifnb1、Isg15和Cxcl10的表达(图3F),而Il1b和Nlrp3 mRNA则被下调(图3G)。作者在小鼠骨髓间充质干细胞、人巨噬细胞(THP1)和小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)中获得了相似的基因表达谱(图3H、3I)。此外,2-DG也抑制了LPS诱导的Il1b和Nlrp3 mRNA,而Ifnb1和Isg15的表达则得到增强。此外,2-DG还以不同的方式调节不同革兰氏阴性细菌引起的先天免疫激活。
为了更广泛地研究,作者使用D-半乳糖来干扰巨噬细胞的糖酵解。作者发现,与用葡萄糖培养的巨噬细胞相比,D-半乳糖抑制了巨噬细胞在感染鼠伤寒沙门氏菌期间释放IL-1β(图3J)。相反,在D-半乳糖培养的巨噬细胞中,IFNβ的释放量显著增加(图3K)。D-半乳糖还降低了Il1b的基因表达(图3L)。相反,D-半乳糖增强了由S. Typhimurium诱导的Ifnb1、Isg15和Cxcl10 mRNA(图3M)以及由LPS诱导的TBK1磷酸化(图3N)。此外,D-半乳糖减弱了由LPS诱导的促炎反应,但增强了I型IFN反应。此外,作者还发现,用紫草素靶向PKM2(丙酮酸激酶同工酶M2)对糖酵解进行药理抑制,可强烈抑制S. Typhimurium诱导的Il1b和Nlrp3,但不会抑制Ifnb1的表达。总之,抑制糖酵解可抑制S. Typhimurium和LPS诱导的促炎反应,而I型IFN反应则被上调。
实验结果4
在刺激下,糖酵解通量的操纵会影响NAD+/NADH氧化还原循环
先前的研究和作者的结果表明,沙门氏菌感染会影响宿主的代谢途径(图1)。为了进一步研究,作者分析了巨噬细胞中详细的代谢途径激活情况。除了脂肪酸代谢和碳代谢等一些中心代谢途径外,烟酸和烟酰胺代谢途径在沙门氏菌感染期间也得到增强(图4A)。这证实了上述观察结果,即伤寒沙门氏菌感染会影响NAD+/NADH比值(图1N)。
为了进一步研究抑制糖酵解是否会影响NAD+/NADH氧化还原循环,作者分析了40个编码参与烟酸和烟酰胺代谢的酶的基因。热图显示,这些基因在感染S. Typhimurium后发生了改变,并进一步受到2-DG处理的影响(图4B)。作者表明,LPS转染可以降低巨噬细胞中的NAD+/NADH比值(图4C)。重要的是,LPS引起的NAD+/NADH比值降低可通过2-DG处理逆转(图4D)。这些结果表明,2-DG抑制糖酵解会改变NAD+/NADH氧化还原循环。同样,D-半乳糖也会提高NAD+/NADH比率(图4E)。
作者已经证明,2-DG和D-半乳糖在感染期间会抑制促炎反应并促进I型干扰素反应(图3)。因此,NAD+/NADH比值的改变似乎反映了2-DG或半乳糖对先天免疫反应的不同调节,其中NAD+/NADH比值增加与激活I型干扰素反应和减弱促炎反应有关。相反,NAD+/NADH比值降低可能与激活促炎反应和减弱I型干扰素反应有关。接下来,作者在糖酵解通量激活的条件下检测了NAD+/NADH氧化还原循环。在LPS刺激下,高糖处理导致NAD+/NADH比值降低(图4F)。这些观察结果与高糖状态下Il1b表达增加和Ifnb1表达减少(图2)相呼应,进一步支持了作者前面提到的假设,即NAD+/NADH比值的改变与不同调节的先天免疫反应有关。总之,作者证明了激活糖酵解会降低NAD+/NADH比值,而抑制糖酵解则会起到相反的作用。受通过改变糖酵解通量来调节先天免疫反应的启发,作者大胆推测NAD+/NADH比值与先天免疫激活之间存在紧密联系。
实验结果5
NADH在感染沙门氏菌时调节促炎反应和I型干扰素反应
根据上述结果,作者提出了先天免疫反应与NAD+/NADH比率之间的关系。大量研究进一步证实,NAD+/NADH氧化还原平衡受病毒或细菌感染的影响,因此作者推测细胞NAD+/NADH比值是影响炎症小体活化和I型干扰素反应的信号。为了探索这一点,作者在培养基中添加了NADH,以降低细胞NAD+/NADH比值。火山图显示,NADH处理可增强伤寒沙门氏菌感染诱导的促炎反应,而I型干扰素反应则减弱(图5A)。热图结果显示,许多促炎基因(如Il1b、Nlrp3、Il12b和Il27)在感染后因NADH处理而诱导(图5B)。相反,NADH抑制了Ifnb1和ISGs(包括Ifi205、Irf7、Ifitm3和Irf9)的表达(图5C)。作者进一步发现,NADH增强了S. Typhimurium诱导的IL-1β释放(图5D)。同样,NADH处理也增强了S. Typhimurium诱导的Il1b和Nlrp3 mRNA(图5E)。相反,S. Typhimurium诱导的IFNβ释放以及Ifnb1、Isg15和Cxcl10 mRNA表达则被NADH抑制(图5F、5G)。同样,TBK1和ISG15蛋白的磷酸化也因NADH处理而减弱(图5H)。这些结果表明,向巨噬细胞补充NADH可以增强促炎反应,减弱I型IFN反应。
为了进一步调节细胞中的NAD+/NADH比例,作者使用了表达产生NADH的EcSTH(大肠杆菌可溶性吡啶核苷酸转氢酶)和消耗NADH的LbNOX(短乳杆菌形成水的NADH氧化酶)的HeLa细胞。Tet-on EcSTH细胞在强力霉素(Dox)诱导后表现出NADH产生增加和 在强力霉素诱导后,NADH的产生增加,NAD+/NADH比率降低,而LbNOX和EcSTH融合恢复了EcSTH诱导的NADH/NAD+比率。作者测量了对照细胞、Tet-on EcSTH细胞和Tet-on EcSTH-LbNOX细胞在强力霉素诱导后的促炎和I型IFN相关基因。在EcSTH细胞中,Dox诱导后,IL1B、IL8和NLRP3等促炎基因上调(图5I),而CXCL10和TNFA的表达受到抑制(图5J)。不出所料,这些基因在EcSTH-LbNOX细胞和对照细胞中的表达不受影响(图5I、5J)。值得注意的是,IFNB1的表达没有受到显著影响,这可能是因为在EcSTH过表达后,其低表达无法进一步降低。此外,有报道称,在线粒体中特异性表达的LbNOX(mitoLbNOX)会增加NAD+/NADH的总比率,而细胞质LbNOX(cytoLbNOX)则没有显著影响。具有Tet-on系统的HepG2细胞通过Dox诱导表达EcSTH、mitoLbNOX或cytoLbNOX。在EcSTH细胞中,促炎基因上调,而在mitoLbNOX细胞中则下调。相反,在EcSTH细胞中,与I型干扰素相关的基因下调,而在mitoLbNOX细胞中则上调。作为对照,细胞内LbNOX的过度表达不能显著改变这些基因的表达。虽然HeLa和HepG2细胞不是巨噬细胞,但它们具有功能性先天免疫反应,并且都可以用来支持作者的发现。接下来,作者在2-DG处理过的S. Typhimurium感染的巨噬细胞中提供NADH。正如预期的那样,2-DG处理条件下减少的Il1b表达可以通过NADH增强(图5K)。相反,NADH可以抑制2-DG处理条件下增强的Ifnb1、Ccl5、Isg15和Ifit2的表达(图5L)。总之,作者的结果表明,在沙门氏菌感染期间,NAD+/NADH比值是影响先天免疫的真正因素。
实验结果6
通过缩短TCA循环来改变NAD+/NADH比例,从而影响促炎反应和I型干扰素反应
TCA循环是细胞产生能量的关键途径,也是线粒体NADH的主要来源,其断裂可能会导致严重的生物能量问题。在小鼠巨噬细胞中,富马酸被确定为在LPS和S. Typhimurium刺激下主要上调的代谢产物之一 (图1M)。此外,在体内和体外,S. Typhimurium感染抑制了Fh1基因的表达,该基因在小鼠体内编码催化富马酸水合的富马酸水合酶(FH)，抑制FH活性以截断TCA循环可能会导致NAD+/NADH比率增加。正如预期的那样,一种成熟的药理学抑制剂FHIN1对FH的药理学抑制导致NAD+/NADH比率增加(图6A)。此外,作者还注意到FHIN1处理后,S. Typhimurium感染细胞的NAD+/NADH比率增加(图6B)。转录组分析表明,FHIN1处理可减弱伤寒沙门氏菌诱导的促炎反应,而激活I型干扰素反应(图6C)。最近的两项研究还表明,在FHIN1处理过的细胞中,Fh1基因敲除小鼠组织中的ISG上调17,IFNβ和肿瘤坏死因子(TNF)升高,但IL-10释放并未减少。作者的热图结果显示表明在沙门氏菌感染后,FHIN1处理可增强Ifnb1和许多ISG(如Tnfa、Trim56、Stat6和Oasl1)的表达(图6D)。相比之下,FHIN1处理可下调许多促炎基因(如ll1b、Nlrp3、Il23a和Il33)(图6E)。FHIN1治疗持续抑制了LPS诱导的IL-1β释放(图6F)。相比之下,FHIN1也抑制了S. Typhimurium诱导的促炎反应基因(如Il1b和Nlrp3)(图6G)和Ifnb1,并诱导了许多ISGs(图6H)。这些结果表明,Fh1的化学抑制可触发以下调促炎反应和上调ISGs为特征的先天免疫反应,同时伴随NAD+/NADH比值的升高。
为了进一步研究FHIN1通过改变NAD+/NADH比值来调节先天免疫,作者在FHIN1处理过的细胞中添加NADH,以重新平衡比值。火山图显示,使用NADH-FHIN1处理过的S. Typhimurium感染细胞和FHIN1处理过的S. Typhimurium感染细胞中的DEGs,NADH处理再次激活了FHIN1抑制的促炎反应(图6I)。热图结果显示,Ifnb1和许多ISGs受FHIN1调控,但NADH的添加会减弱它们的表达(图6D)。相比之下,许多促炎基因(如ll1b和Nlrp3)在FHIN1处理下被下调,而NADH的添加可恢复这种抑制作用(图6E)。作者进一步发现,FHIN1抑制了鼠伤寒沙门氏菌诱导的ll1b基因表达,但补充NADH则增强了这种表达(图6J)。相比之下,补充NADH抑制了FHIN1增强的Ifnb1和Ifit2 mRNA(图6K)。同样,FHIN1抑制了LPS诱导的Il1b表达,但补充NADH后恢复,这种恢复也适用于Ifnb1表达。总之,作者发现FHIN1截断了TCA循环,导致NAD+/NADH比值升高,从而对先天免疫产生不同的调节作用。
接下来,作者使用小干扰RNA(siRNA)方法来下调FH(编码人类富马酸水合酶)的表达。通过检测FH基因的表达,作者证实了敲除的效率。正如预期的那样,FH的下调导致IL1B和IL8在LPS刺激下的表达降低。然而,IFNB1的表达没有受到显著影响。
衣康酸是LPS处理的人巨噬细胞中最丰富的代谢产物之一,衣康酸的抗炎作用和诱导IFNβ的作用也有报道。鉴于衣康酸抑制TCA循环中琥珀酸脱氢酶介导的琥珀酸转化从而影响巨噬细胞代谢, 作者推测衣康酸也可能改变NAD+/NADH比值和先天免疫反应。作者使用衣康酸衍生物4-辛基衣康酸(4-OI)对细胞进行预处理,然后感染它们与鼠伤寒沙门氏菌。正如预期的那样,4-OI预处理细胞中的NAD+/NADH比率增加。相应地,4-OI抑制了S. Typhimurium诱导的Il1b,而4-OI增强了Ifnb1、Ccl5、Isg15和Ifit2的表达,这与之前的研究结果一致。综上所述,作者的研究结果表明,通过药物和遗传学手段阻断TCA循环,可以以依赖NAD+/NADH比值的方式,对促炎反应和I型干扰素反应产生不同的调节作用。
实验结果7
细胞免疫受损会导致NAD+/NADH比值降低,从而影响先天免疫反应
作为ETC中最大的复合体,NADH脱氢酶复合体I的主要功能是将电子从NADH转移到辅酶Q,并将质子泵过线粒体内膜。因此,复合体I受损会导致NADH水平升高(图7A)。作者已经证明,与线粒体呼吸相关的基因在很大程度上受到鼠伤寒沙门氏菌感染的抑制(图1F和1H)。作者还发现,CI到V的核心成分的表达受到鼠伤寒沙门氏菌感染的抑制(图7B)。值得注意的是,巨噬细胞中的线粒体CI活性在感染后也受到强烈抑制(图7C),这与感染后CI亚基编码基因的表达受到抑制(图7D)和NAD+/NADH比值降低(图1N)同时发生。鉴于CI功能障碍会促进炎症反应,作者推测NAD+/NADH比值降低会影响炎症反应。作者使用siRNA方法下调NDUFS4,NDUFS4是线粒体CI的关键亚基。在模拟和LPS转染条件下,NDUFS4的敲除导致NADH的产生增加,而在LPS组中未观察到NAD+/NADH比值的降低(图7E)。作者还注意到,在LPS处理或S. Typhimurium感染条件下,NDUFS4的表达下调(图7F)。重要的是,作者表明,在LPS或S. Typhimurium刺激下,NDUFS4敲除条件下IL1B和IL8的表达增加(图7G)。
使用罗丹明实现了对CI活性的药理抑制。罗丹明处理对沙门氏菌引起的碳代谢变化有很大影响。罗丹明处理增强了LPS诱导的THP1细胞中IL1B和IL8基因的表达(图7H),而ISG15基因的表达则降低(图7I)。然而,罗丹明处理导致巨噬细胞中Il1b表达降低，这证实了之前的研究,即Il1b表达的线粒体CI依赖性机制。然而,罗丹明处理过的细胞显示出减弱的第一型干扰素反应。总之,作者的结果表明,CI受损会导致炎症反应激活。
