Science丨TLR3通过调节B2m调节巨噬细胞-造血干细胞的相互作用

与 ROS 相关或不相关的过程都会诱导 Calr 的表达

    HSPC 内与 ROS 相关的应激介导了 “吃我 ”分子 Calr 的表面呈现。HSPCs 中的这种压力与 FoxO 信号相关，已知 FoxO 信号可介导细胞从虚假的 ROS 中解毒。与提出的质量控制机制类似，作者观察到高 ROS 的 HSPC 被巨噬细胞清除（注定要死亡），而低 ROS 的 HSPC 并没有注定要死亡，而是在与巨噬细胞相互作用后继续分裂（图 1A）。作者评估了斑马鱼 HSPCs 中的 ROS 水平，证实 ROS 水平的增加与表面呈现的 “吃我 ”信号 Calr 有关（图 1B）。相反，当作者用ROS清除剂二苯基碘（DPI）和VAS2870（VAS）处理斑马鱼胚胎，减少HSPCs中的ROS时，我们观察到表面Calr水平较低（图1C），巨噬细胞与干细胞的相互作用减少。这表明，ROS水平表明表面Calr较高，并可能与巨噬细胞-干细胞相互作用。

    尽管如此，以不依赖ROS的 ，调节表面Calr的内化机制仍然未知。为了系统评估 HSPC 中触发表面 Calr 呈现的途径，作者通过筛选 1200 种生物活性小分子（图 1D），在人胚肾 293（HEK293）细胞中靶向了大量信号通路。Calr是内质网（ER）中一种丰富的伴侣蛋白。因此，为了只评估细胞表面的 Calr，我们设计了一种 SPLIT-TURBO ID 构建物，以 Calr 和膜蛋白 Cadherin 2 (CDH2) 的结合为目标。我们还利用荧光 Calr 抗体（Zenon-Technology）对 Calr 的表面呈现进行了正交评估。通过这两种独立的方法，作者确定了能有效增加 Calr 表面呈现的化合物。同时，作者还用 CellROX（赛默飞世尔科技公司）--一种普遍存在的 ROS 探针--标记细胞，以确定以 ROS 相关方式诱导表面 Calr 的化合物（图 1D）。作者发现有 93 种化合物能增加细胞表面的 Calr，并产生强烈的剂量依赖性反应（图 1E），以下称为 Calr 诱导剂。在这 93 种 Calr 诱导剂中，54 种与 ROS 的增加有关（ROS 依赖性），而 39 种不影响 ROS 水平（ROS 非依赖性）。二甲基亚砜（DMSO）用作载体对照，DPI 和H2O2分别用作内化阴性和阳性对照。我们使用化学注释工具包分析了 ROS 依赖性化合物的已知生物功能。不出所料，作者发现 ROS 依赖性化合物与细胞应激途径（如细胞色素 P450 氧化和 DNA 损伤）有很强的正相关性，而不依赖 ROS 的化学物质在特定途径中并不富集。
    为了检验 93 种 Calr 诱导剂对巨噬细胞-HSPC 相互作用结果的影响，作者使用了分别在 HSPC 和巨噬细胞中表达荧光报告物的 runx1+23:mCherry; mpeg1.1:EGFP斑马鱼胚胎。受精后 48 小时（hpf），胚胎暴露于 93 种 Calr 诱导剂（图 1F）。暴露 24 小时后，作者通过活细胞成像评估巨噬细胞与 HSPC 的相互作用。93 种 Calr 诱导剂中有 22 种促进了巨噬细胞-HSPC 的相互作用，使其高于基线水平（图 1F）。作者证实这些化合物增加了 Calr 的表面呈现。
    依赖 ROS 和不依赖 ROS 的化合物都以类似的水平增加了巨噬细胞-HSPC 的相互作用比率。作者用 Annexin-V 染色法评估了野生型（WT）72 hpf 胚胎细胞的凋亡情况。与 DMSO 处理的胚胎相比，除了依赖 ROS 的 β-拉帕醌外，其他 22 种化合物都没有改变细胞凋亡的水平（图 1G）。因此，Calr诱导剂触发表面Calr与细胞凋亡和/或细胞死亡途径无关。接下来，为了验证在用 22 种 Calr 诱导剂处理时观察到的巨噬细胞-HSPCs 相互作用的增加是否依赖于Calr（图 1G），作者生成了斑马鱼中一种调控巨噬细胞-HSPC 相互作用的Calr同工型--Calr3b的镶嵌缺失（crispants）。作者发现，22 种 Calr 诱导物以Calr3b 依赖性方式促进了相互作用。总之，这些结果表明，表面 Calr 水平决定了巨噬细胞与 HSPC 的相互作用。依赖 ROS 和不依赖 ROS 的途径都会增加表面 Calr 的呈现，这表明各种应激源都会导致 “吃我 ”信号的呈现。

巨噬细胞的归巢或疏导行为由 HSPC ROS 水平决定

    由于抗氧化剂处理会阻碍暴露于ROS依赖性化合物的人类HSPC的表面Calr水平，作者推断，由于线粒体功能障碍，促进凋亡的化合物会与更高的ROS水平相关。为支持作者的假设，仅促进归巢的 ROS 依赖性化合物（图 2A）也会损害线粒体膜电位，而巨噬细胞-HSPC 相互作用的缺失会诱导线粒体 ROS 的更高积累，从而支持由巨噬细胞确保质量控制。

    相比之下，不依赖 ROS 的化合物会增加 HSPC 的增殖，这与梳理行为的增加是一致的（图 2A）。这些结果表明，HSPC 表面的 Calr 呈递会诱导巨噬细胞相互作用，但这种相互作用的结果也取决于 HSPC 细胞的 ROS 水平。依赖 ROS 的化合物会刺激 HSPC 的归巢行为和 HSPC 的死亡。而不依赖于 ROS 的化合物则会刺激疏导行为和 HSPC 增殖。
    Calr诱导化合物对HSPC的促增殖作用可能是巨噬细胞内在行为受损的间接结果。因此，作者在体外测试了经 ROS 依赖性化合物处理的巨噬细胞的趋化性和吞噬活性。为了评估吞噬作用，作者用 Calr 诱导剂处理 RAW-274 巨噬细胞。暴露 24 小时后，我们在培养基中加入了绿色荧光蛋白（GFP）-rhodo zymosan（一种促进吞噬的病原体颗粒），并通过活细胞成像测量了 zymosan-GFP+巨噬细胞的数量。作者没有观察到处理过的细胞的zymosan吞噬功能受损。脂多糖（LPS）被用作阳性巨噬细胞刺激物。作者用琼脂糖趋化试验评估了巨噬细胞的趋化性。用 DMSO（阴性对照）、LPS（阳性对照）或 ROS 依赖性化合物处理 RAW-274 细胞。用含有 LPS 的培养基填充趋化点，作为巨噬细胞趋化的诱饵，而巨噬细胞的趋化不受该处理的影响。这些结果表明，不依赖 ROS 的 Calr 诱导剂不会改变巨噬细胞的内在功能。因此，ROS 依赖性化合物能驱动巨噬细胞介导的 HSPC 梳理，而不会诱导巨噬细胞自主效应（图 2A）。

Tlr3 在进展过程中诱导表面 Calr

    为了确定独立于 ROS 的化合物如何诱导表面 Calr 呈现以促进巨噬细胞疏导而非归巢，作者进行了全基因组 CRISPR 筛选。作者选择了 ROS 依赖性化合物 DL-PPMP 作为 Calr 诱导剂，因为它能导致高的表面 Calr、巨噬细胞-HSPC 相互作用（图 1F）和 HSPC 增殖，还能增加巨噬细胞梳理比率（图 2A）。为了确定表面 Calr 表达所需的复杂网络，作者使用慢病毒递送基因敲除文库，该文库针对 18,080 个基因，具有 64,751 个独特的引导序列。作者用 DL-PPMP 或 DMSO（对照）处理 K562 人类白血病细胞，并用流式细胞仪对Calr细胞进行分拣（图 2B）。在此，作者通过分选Calr-细胞并富集其中的单导RNA（sgRNA），确定了在 “不要吃我 ”的情况下，哪些基因调控Calr诱导剂的表面Calr呈现。

    作者重点研究了在 DL-PPMP 刺激的细胞中特异性富集的基因（图 2C）。在这些靶标中，作者发现了上调 Calr 表达并与细胞膜 DNA/RNA 传感和病毒免疫反应相关的基因的富集。TLR3是一种双链RNA（dsRNA）传感器；DDX3X是一种RNA螺旋酶；XBP1是一种蛋白质，除其他外，它还能调节主要组织相容性复合体II类（MHC-II）基因，并且是ER应激的关键转录因子调节因子。在验证实验中，TLR3的消耗减少了 K562 细胞表面的 Calr，表明细胞膜 DNA 和/或 RNA 可能介导了表面 Calr 的增加。

    与此同时，作者用一种依赖于 ROS 的化合物--bongkrekic 酸--处理 K562 细胞，对其进行了全基因组 CRISPR-Cas9 筛选。虽然作者发现了 Calr 的富集，证实了作者筛选的靶向效率，但作者在该数据集中没有发现TLR3的富集。这些数据支持了由 TLR3 介导的表面 Calr 呈递前导的假设。

巨噬细胞介导的梳理需要 HSPC 中的 Tlr3 信号传递

    作者试图评估 Tlr3 在 HSPC 中控制巨噬细胞归巢与疏导的生物学相关性。作者用两种正交方法进行了测试。作者通过在单细胞斑马鱼胚胎（“变形体”）中注射吗啉清除了tlr3，或通过用 dsRNA/Tlr3 抑制剂CUCPT4a（iTlr3）处理斑马鱼胚胎来药理抑制 Tlr3。在头 48 hpf HSPCs 从背主动脉腹壁出现或出芽可靠地发生后 48 小时，作者对其进行了处理或耗竭。在这两种方法中，作者通过流式细胞术观察到体内呈现表面 Calr 的 HSPC 数量减少。这些数据证实，Tlr3 是体内 HSPC 表面呈现 Calr 的必要条件。

    然后，作者测试了吗啡诺缺失tlr3或抑制 iTlr3 是否会调节巨噬细胞-HSPC 的相互作用和相互作用的结果。尽管Calr+HSPCs减少了，但通过吗啉或iTlr3去除tlr3会增加归巢和减少疏导（图2D）。为了解决巨噬细胞行为中潜在的细胞自主缺陷，作者进行了同种异体移植实验，将标准或tlr3吗啉注射的 runx1+23mCherry;mpeg1:BFP 胚胎与mpeg.1:EGFPWT 斑马鱼融合（图 2E）。两种来源的巨噬细胞--WT（绿色）和tlr3变形体（蓝色）--都显示出与 HSPCs 的接触增加，随后归巢行为增加。这表明 Tlr3 以 HSPC 自主的方式防止归巢行为（图 2，F 和 G）。为了研究 Tlr3 是否足以促进梳理行为，作者分选了小鼠系-Sca1+cKit+（LSK+）HPSCs，用dsRNA模拟物 poly I:C （Tlr3 激动剂）或 DMSO 对其进行预处理，并将其与自体骨髓衍生巨噬细胞（BMDMs）进行共培养。我们观察到，poly I:C预处理的HSPC表现出更高的梳理比率，这表明HSPC中的Tlr3/dsRNA信号促进了梳理行为。

Tlr3 信号指导 HSPC 表面呈现 B2m

    为了深入了解 “别吃我 ”化合物 DL-PPMP 触发的分子机制，作者分析了以前从经 DL-PPMP 处理的人类癌细胞系获得的大量 RNA 序列（RNA-seq）数据。与作者的数据一致，用 DL-PPMP 处理过的 K562 细胞表达了更高水平的 B2m，B2m 是 MHC-I 稳定在细胞表面所需的分子。虽然 MHC-I 是抗原呈递和 CD8+T 细胞活化所必需的，但它也能发出 “别吃我 ”的信号。例如，MHC-I-B2m 的表达可通过与免疫抑制相关细胞（如耐受性树突状细胞和 M2 型巨噬细胞）中表达的 LILRB1/LILRB2 结合，保护癌细胞免受吞噬。

    在进化过程中，这种机制可能是保守的，因为根据来自翼手目（Actinopterygii）的数据，LILR 系统起源于 4.5 亿年前，而白细胞免疫型受体（LITR）与人类 LILR 受体具有同源关系。作者通过 CRISPR 筛选确定了 “别吃我 ”背景下表面 Calr 诱导因子的分子线索（图 2C），结果表明 Tlr3 可促进梳理，在此基础上，作者假设 HSPC 在响应 Tlr3 信号时会显示更多的 B2m，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用并防止归巢行为。为了验证这一假设，作者评估了tlr3斑马鱼变形体中 HSPC 表面的 B2m 水平。我们发现，在斑马鱼胚胎中耗尽tlr3会导致更少的 B2m+HSPC。考虑到tlr3斑马鱼变形体表现出较高的凋亡事件（图 2D），我们的结果表明，Tlr3 表达较低导致 B2m 表达较低，从而使 HSPCs 被巨噬细胞凋亡。

表面 B2m 决定由 Calr 介导的巨噬细胞-HSPC 相互作用的结果

    作者用不依赖 ROS 的化合物处理 48 hpf 斑马鱼胚胎，并使用荧光激活细胞分拣技术（FACS）评估 HSPC 表面的 B2m。作者发现，不依赖 ROS 的化合物增加了 B2m 水平，而 “eat-me ”或 iTlr3 处理则降低了表面 B2m 水平。为了验证Calr和B2m提供的信号输入对巨噬细胞-HSPC相互作用的结果是否重要，作者使用CRISPR-Cas9生成了b2m镶嵌缺失的斑马鱼脆骨胚胎，并用ROS依赖性Calr诱导剂处理它们。在注射对照 sgRNA 和b2msgRNA 的胚胎中，使用 DMSO 作为载体对照。当b2m消耗殆尽时，ROS 依赖性 Calr 诱导剂促进了归巢而非梳理。总之，这些数据支持这样的假设：不依赖 ROS 的 Calr 诱导剂通过 Calr 和 B2m 的表面呈现促进疏导，Calr 促进巨噬细胞与 HSPC 的相互作用，而 B2m 则提供 “别吃我 ”的信号，阻碍 HSPC 被巨噬细胞完全吞噬。

    马赛克脆片受到编辑效率的限制。因此，为了证实 B2m 在巨噬细胞介导的 HSPC 梳理中的作用，作者生成了b2m 稳定敲除斑马鱼。作者使用CRISPR-Cas9技术在runx1+23:mCherry;mpeg1-EGFP背景斑马鱼的b2m基因的3外显子上造成了一个移帧突变。作者在72 hpf时通过活细胞成像研究了这些同源突变体中巨噬细胞-HSPC相互作用的结果。B2m的耗竭促进了 HSPC 的归巢并减少了 HSPC 的梳理（图 3，A 至 E），这进一步支持了表面 B2m 在 HSPC 上作为 “别吃我 ”信号的作用。归宿的增加与 Calr+HSPC 数量的增加无关。此外，尽管 HSPC 表面的 Calr 很低，但我们在尾部造血组织（CHT）中观察到的 Runx1+细胞较少，这可能表明 HSPC 归巢现象增强了。

    接下来，为了验证 B2m 作为 “别吃我 ”信号的作用，作者用 ROS 依赖性化合物 DL-PPMP 处理了b2m 基因敲除胚胎。作者认为，DL-PPMP 会增加表面 Calr（增加巨噬细胞与 HSPC 的相互作用），但在缺乏 B2m 的情况下，这种相互作用会导致死亡。作者观察到，DL-PPMP 可刺激 WT 胚胎和b2m 基因敲除胚胎中的相互作用。然而，b2m-基因敲除的 HSPC 被毁灭，而 WT HSPC 则被梳理（图 3，F 和 G）。这些结果证明了表面 B2m 在指示巨噬细胞疏导行为方面的重要性。
    然后，作者试图评估 B2m 介导的 “别吃我 ”信号是否在整个进化过程中保持不变。为此，作者分选了 MHC-I+或MHC-I-的小鼠 HSPCs（LSK+），并将它们与 BMDMs 共同培养 4 小时（图 3H）。作者选择对 MHC-I 进行分选，因为它的表面表达依赖于 B2M 的存在。作者发现，小鼠 MHC-I+HSPCs 促进了巨噬细胞的梳理（图 3I）。总之，这些结果表明，B2m 可装饰 HSPC 表面，并在巨噬细胞-HSPC 相互作用过程中促进 “别吃我 ”信号的产生。

需要 B2m 来保护造血干细胞克隆的复杂性

    与哺乳动物的B2M基因突变一样，作者在成年斑马鱼中没有观察到b2m基因敲除后发育的重大变化，除了淋巴细胞的减少，这可能反映了 CD8+分化受损。

    造血干细胞克隆的复杂性对于维持功能性和弹性免疫系统、支持长期造血功能以及降低血液病风险至关重要。由于疏导和归巢调节造血干细胞克隆的复杂性，作者试图确定 B2m 的耗竭是否会影响造血干细胞克隆景观。作者假设，b2m突变体中的归巢增加会减少成年期造血干细胞克隆的数量。为了验证这一点，作者利用组织编辑与可诱导干细胞标记重组（TWISTR）产生了镶嵌缺失，将CRISPR-Cas9介导的基因编辑与Zebrabow（zbow）造血干细胞颜色标记结合起来，使突变干细胞与WT干细胞在体内竞争。Zebrabow-M;draculin:CreERT2胚胎可在24 hpf时对单个造血干细胞克隆进行特异系标记（图3J）。b2m的镶嵌式缺失减少了骨髓和淋巴或祖细胞克隆的数量，并促进了克隆优势（图 3，K 至 M）。此外，在 HSPC 植入 CHT 之前消融巨噬细胞可挽救b2m脆片中的克隆优势（图 3，K 至 M），但不能挽救克隆数量（图 3M）。克隆数量的减少可能反映了 Il-1β 驱动的增殖受损，从而限制了造血干细胞克隆的数量（图 3N）。考虑到 TWISTR 的镶嵌性质，作者假设在b2m突变条件下发现的更多克隆（或优势克隆）是未携带b2m突变的 WT 细胞。因此，作者对优势克隆和非优势克隆进行了分类，并评估了它们的b2m 编辑效率。事实上，显性克隆的b2m是WT的，这表明b2m突变克隆是注定要失败的，并导致抗突变的WT克隆超越了成髓。这些结果表明，B2m能装饰HSPC表面，保护它们不被巨噬细胞清除，从而影响成年期HSPC的克隆性。

    干扰素调节因子3（Irf3）介导了b2m表达上游的Tlr3/Tlr4特异性抗病毒基因程序。因此，作者利用 TWISTR 系统生成TWISTR-irf3突变体，以阐明通过 B2m 调节造血干细胞克隆的分子途径。作者还产生了TWISTR-tlr3突变体，并在 48 hpf 时用 iTlr3 处理斑马鱼胚胎以抑制 Tlr3 和 dsRNA 下游信号传导。与b2m突变体一样，irf3和tlr3 的镶嵌消耗以及 Tlr3 信号的抑制减少了髓系克隆的数量，同时增加了克隆优势。TWISTR-irf3突变体同样表现出WT克隆优势，表明irf3缺失的干细胞在竞争中处于劣势。成像结果显示，B2m突变型造血干细胞和Irf3突变型造血干细胞都会被巨噬细胞清除，因为细胞不再发出 “别吃我 ”的信号。这些数据表明，Tlr3 激活级联的分子网络可促进 Irf3 的激活，从而促进b2m 的转录。

细胞质 dsRNA 促进 B2m 的表达并保护其免受厄运的侵袭

    b2m表达的增加是对病毒感染的典型反应，也是细胞对 I 型 IFN 的反应。为了研究 HSPC 群体的内在异质性，作者使用 IFN 刺激基因 15（isg15）作为 Tlr3 介导的 Irf3 反应的报告物。流式细胞术显示，27% 的 Runx1+HSPCs 对isg15呈阳性（图 4A），并与 B2m 表面呈现呈正相关（图 4B）。Isg15+HSPC 被巨噬细胞消灭的可能性较小（图 4C）。选择性 HSPCs 中Isg15活性和 B2m 的相关富集暗示了这些细胞中的病毒模仿反应。为了验证这一点，作者给 72 hpf 胚胎注射了 Tlr3 激动剂 poly I:C，并测量了 Isg15+HSPC 的比例。作者发现，poly I:C 增加了 Isg15+HSPCs 的比例。总之，这些数据表明，内源性病毒模拟反应可触发 I 型 IFN 通路，导致 HSPC 表面的 B2m 水平升高，从而保护 HSPC 免于死亡。

    包括内源性逆转录病毒（Erv）在内的RE在调节HSPC的形成和再生中发挥作用。因此，作者假设 REs 可能是介导b2m表达的内源性 Tlr3 配体。对 Runx1+Isg15+细胞的定量聚合酶链反应（qPCR）分析表明，内源性逆转录病毒和 B2m 的表达一致增加（图 4D）。这些数据表明，具有较高水平 RE 转录物的 HSPC 也具有较高水平的 B2m。
    为了深入了解与巨噬细胞相互作用的 HSPC 中的 RE 状态，作者重新分析了已发表的来自去巨噬细胞胚胎和对照胚胎的分选 runx1+23:mCherryHSPC 的单细胞 RNA-seq 数据，并修改了图谱以包括单细胞水平的 RE（包括长末端重复序列（LTR））表达。与非周期细胞群相比，细胞周期基因表达丰富的细胞群（细胞群 2）的 RE 表达量较高（图 4，E 和 F）。这表明，处于增殖初期的HSPC具有更高的RE表达。此外，用促进新陈代谢、依赖 B2m 的化合物 DL-PPMP 处理来自胚胎 CHT 的 Runx1+细胞的大量 RNA-seq 显示 REs 上调，包括ltrs的转录本。
    为了评估 B2m 在携带高或低含量Erv转录本的 HSPC 中的表达，作者将斑马鱼 zfERV（LTR5）报告基因系与 runx1+23:mCherry斑马鱼杂交。通过 FACS 检测，LTR5+ HSPCs 表现出更高的 B2m 水平。作者接下来试图确定 RE 水平是否依赖于巨噬细胞-HSPC 的相互作用。为了验证这一点，作者在 48 hpf 时量化了 WT 或巨噬细胞耗竭胚胎中 Runx1+细胞的细胞质 dsRNA 水平。巨噬细胞耗竭并没有改变Runx1+细胞中的dsRNA含量，这表明HSPC中REs的内源性含量与巨噬细胞的相互作用无关。
    总之，这些数据表明，细胞膜REs（包括LTRs）的升高与较高的B2m水平相关，表明病毒模仿程序可以保护HSPC免受巨噬细胞的侵袭。
为了确定诱导造血干细胞表达 RE 是否能调节巨噬细胞的行为，作者用 G9a/DNMT 抑制剂 CM272 处理了 48 hpf 的斑马鱼胚胎。作者推断，抑制 DNA 甲基化会增强 RE（包括Erv）的表达。事实上，24 小时后，经 CM272 处理的胚胎的 HSPCs 显示内源性逆转录病毒和病毒样反应基因的表达增加。此外，CM272 还增加了 Isg15+和 B2m+HSPC 的比例，并提高了 HSPC 上 Calr 的水平。这表明 CM272 能促进巨噬细胞对 HPSC 的梳理。作者用 CM272 处理 72 hpf 胚胎，在活体成像实验中，CM272 增加了 HSPC 的增殖和 Isg15 HSPC 的数量，并减少了 HSPC 的凋亡（图 4，G 至 I）。
    由于 CM272 除了上调 REs 之外，还可能通过一些基因表达变化来调节归巢和梳理，因此作者克隆了斑马鱼 runx1+23增强子 GFP 下游的ltr4，以促进 HSPCs 中 RE 的过表达。我们发现，与过表达runx1+ 23增强子GFP的胚胎相比，过表达ltr4 （ltr4-OE）的胚胎的HSPC表现出更高的增殖率。考虑到巨噬细胞的梳理和较长的相互作用与较高的 HSPC 增殖相关，在ltr4-OE中观察到的增殖增加可能反映了较高的梳理行为。因此，增加全RE表达（通过CM272）或过表达特定RE（Ltr4）可防止巨噬细胞归巢。
    作者研究了RE介导的保护作用对HSPC克隆性的潜在影响。作者选择使用 CM272 处理作为增加 HSPC 上 “别吃我 ”信号的工具，因为它使我们能够关注 HSPC 出芽后的事件（发生在 24 到 48 hpf）。作者推断，逆转录病毒元件的抑制将增加 HSPC 的增殖。事实上，CHT成像证实了HSPCs增殖率的提高，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）掺入也证实了这一点（图4H）。然而，斑马分析显示克隆性几乎没有差异（图 4，J 和 K），这表明 CM272 促进了已建立克隆的扩增。用 CM272 处理TWISTR-b2m突变体时，我们没有观察到克隆优势的恢复，这证实了dsRNA 的感应发生在 B2m 呈递的上游。(图 4，J 和 K）。
这些数据表明，REs 与 B2m+HSPC 呈正相关，上调内源性逆转录病毒水平可防止 HSPC 死亡。

通过内源性逆转录病毒诱导 B2m 在整个进化过程中保持不变

    B2m 的氨基酸序列高度保守。因此，作者研究了ERV驱动的B2M表达在哺乳动物中是否保守。与在斑马鱼中的观察结果一致，作者发现人类 ISG15+HSPCs具有较高的B2M表达，并且与 REs 的表达呈正相关（图 4，L 和 M）。

    作者在 CD34 细胞中过表达人Erv或GFP（作为对照），以验证 B2M 水平与 RE 表达之间的因果关系。过表达ERV 而非对照 GFP 会导致 HSPC 表面的 B2M 增加（图 4N）。相比之下，过表达ERV后 ROS 水平并没有升高。在 CM272-和 poly I:C 处理的人 CD34 细胞中观察到表面 B2m 增加，这可以通过阻断 TLR3 信号转导来消除。作者从人类细胞和斑马鱼获得的数据表明，通过 dsRNA/TLR3 信号调控 B2M 在整个进化过程中是保守的。

    为了了解 “别吃我 ”信号在哺乳动物系统中的功能相关性，作者用DL-PPMP处理骨髓增生异常综合征1（Mds1）GFP+/Flt3Cre（MFG）干细胞报告小鼠，因为DL-PPMP能促进B2M的呈现，而不能促进CD47等其他 “别吃我 ”分子的呈现。作者选择这种报告模型是因为Mds1是能够自我更新的长期造血干细胞中高度富集的基因。作者发现，DL-PPMP 处理增加了 HSPC 的增殖（图 4O），并提高了 MHC-I 的水平（图 4P），这表明 HSPC 受到了保护，不会被巨噬细胞吞噬，并在梳理过程中增殖。

B2m 的表达对 REs 的反应会改变 HSPC 的命运

    内源性逆转录病毒蛋白质和遗传物质已被证明能调节先天性免疫反应。ERV衍生的增强子和启动子似乎会在病原体感染时被激活，这表明在应对病原体时存在合作激活或先天性免疫反应与ERV之间存在训练免疫功能。

    鉴于 RE 和 B2M 的进化保守性，作者试图研究这一发现在病原体感染这一进化保守过程中的相关性。作者评估了 Tlr3 信号在介导 “紧急粒细胞生成 ”中的作用。这是一种独特的保护性程序，即在致命感染时通过扩增祖细胞加速中性粒细胞的新生。因此，为了确定多聚 I:C 能否诱导紧急粒细胞生成，作者用多聚 I:C 处理斑马鱼胚胎，并评估中性粒细胞的数量，以此作为髓系紧急反应的代表。作者发现，受到 poly I:C 刺激后，中性粒细胞数量增加。同样，人源化 NOG 小鼠在感染时显示出更高的粒细胞生成和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子水平。尽管还需要进一步的研究来加强这一现象的相关性，但作者的研究结果表明，病毒刺激可能会通过促进粒细胞分化来更好地抵御机会性病原体。

    除了致病方面，作者还发现急性髓性白血病（AML）恶性 HSPCs 中B2M表达较高，人 AML 爆破细胞中 TE 表达较高。这表明急性髓性白血病细胞可能劫持了 “别吃我 ”信号，以避免被巨噬细胞消灭。

    作者的数据表明，RE-Tlr3的病毒模拟信号介导了HSPCs表面水平的B2m，以促进巨噬细胞介导的疏导，并以进化保守的方式防止巨噬细胞的终结，从而影响造血干细胞的命运决定和克隆增殖（图4Q）。