Chestnut Studying
摘要
Trained immunity is characterized by epigenetic and metabolic reprogramming in response to specific stimuli. This rewiring can result in increased cytokine and effector responses to pathogenic challenges, providing nonspecific protection against disease. It may also improve immune responses to established immunotherapeutics and vaccines. Despite its promise for next-generation therapeutic design, most current understanding and experimentation is conducted with complex and heterogeneous biologically derived molecules, such as β-glucan or the Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccine. This limited collection of training compounds also limits the study of the genes most involved in training responses as each molecule has both training and nontraining effects. Small molecules with tunable pharmacokinetics and delivery modalities would both assist in the study of trained immunity and its future applications. To identify small molecule inducers of trained immunity, we screened a library of 2,000 drugs and drug-like compounds. Identification of well-defined compounds can improve our understanding of innate immune memory and broaden the scope of its clinical applications. We identified over two dozen small molecules in several chemical classes that induce a training phenotype in the absence of initial immune activation—a current limitation of reported inducers of training. A surprising result was the identification of glucocorticoids, traditionally considered immunosuppressive, providing an unprecedented link between glucocorticoids and trained innate immunity. We chose seven of these top candidates to characterize and establish training activity in vivo. In this work, we expand the number of compounds known to induce trained immunity, creating alternative avenues for studying and applying innate immune training.
训练免疫的特征是，在特定刺激下，表观遗传和代谢重新编程。这种重新编程可增加细胞因子和效应子对病原体挑战的反应，从而提供非特异性保护，抵御疾病。它还可以提高对现有免疫治疗药物和疫苗的免疫反应。尽管它有望成为下一代治疗手段，但目前大多数理解和实验都是针对复杂且异质的生物衍生分子进行的，例如β-葡聚糖或卡介苗（BCG）疫苗。由于每个分子都具有训练和非训练效应，训练复合物的有限集合也限制了对训练反应中涉及最多的基因的研究。具有可调节药代动力学和给药方式的小分子将有助于训练免疫及其未来应用的研究。为了鉴定训练免疫的小分子诱导剂，我们筛选了2000种药物和类药物化合物。明确化合物的鉴定可以提高我们对先天免疫记忆的理解，并扩大其临床应用范围。我们发现了二十多种不同化学类别的小分子，它们能够在初始免疫激活缺失的情况下诱导训练表型——这是目前所报道的训练诱导剂的一个局限性。一个令人惊讶的结果是，我们发现了传统上被认为具有免疫抑制作用的糖皮质激素，从而在糖皮质激素和训练后的先天免疫之间建立了前所未有的联系。我们选择了其中七个最佳候选物，以表征并建立体内训练活动。在这项工作中，我们增加了已知可诱导训练免疫的化合物数量，为先天免疫训练的研究和应用开辟了新的途径。
实验结果1
高通量筛选训练免疫的小分子诱导剂
为了筛选训练免疫，作者必须克服当前筛选方法中的几个挑战。筛选研究通常针对单一蛋白靶标而非更广泛的表型反应来探测化合物的活性，而测量训练免疫则需要更广泛的表型反应。此外，大多数筛选只需要细胞存活1天，并使用永生化细胞系。为了确定训练免疫，典型的检测需要持续7天才能诱导训练，并且需要使用原代小鼠骨髓间充质干细胞，这给筛选带来了额外的挑战。图1A展示了完整的筛选方案。与未接受化合物处理的细胞（作为“未经训练”的对照）相比，“训练后表型”反应的主要读数是第7天肿瘤坏死因子α（TNF-α）的倍数增加。作者之前在高通量筛选中识别免疫调节剂的经验为我们提供了优化所需点的见解。为了弥补原代细胞存活率和分化方面的挑战，作者在筛选实验中使用了多种质量控制测试，以确保实验在不同重复中的准确性和一致性。为了确保BMDMs能够训练且方案能够产生一致的结果，作者使用标准浓度为100μg/mL的β-葡聚糖对另一组相同的BMDMs进行了基准测试。在第5天，作者使用IncuCyte对细胞活力进行了量化，并与未经训练的对照组进行了比较。训练免疫效果与先天免疫激活不同，因此作者检查了细胞在Toll样受体（TLR）刺激前是否保持静止表型，在实验第6天收集并冷冻三个筛选重复中的每个重复的上清液，以测量实验完成后TNF-α的浓度。通过这些技术和生物学对照，作者可重复确认β-葡聚糖训练的有效性，并应用该筛选方法来鉴定可诱导与β-葡聚糖训练（类似于体外训练）产生的表型相匹配的化合物。
经过优化后，作者开始从MicroSource Spectrum Library中筛选2000个小分子。对于每次重复的筛选，作者使用标准7天训练试验的改良版。在人类胚胎肾（HEK）-Blue TNF-α细胞中，使用Quanti-Blue试验测量TNF-α浓度。为了测试上清液中的TNF-α浓度，将HEK-Blue TNF-α细胞以每孔25000个细胞的数量接种到384孔板中，并加入5μL上清液。将细胞与上清液孵育24小时后，向孔板中加入20μL浓缩的QuantiBlue试剂。15分钟后，在628nm处测量吸光度。作者将TNF-α的产生量比未受刺激的对照组增加1.6倍或以上的化合物定义为“苗头化合物”。作者选择这个阈值是因为它与所有化合物库中化合物的平均值相差2.5个标准差。在筛选优化过程中，β-葡聚糖的TNF-α产生量比未受刺激的对照组增加1.7倍，这与作者之前的工作一致。作者为筛选验证选择了稍低的阈值，因为1 μM的初始库浓度可能不是每种测试化合物的最佳浓度。有32种化合物超过了1.6倍的增加阈值，占测试化合物的1.5%（图1B）。这些化合物具有一些共同特征，因此作者将它们分为7组。
在排名前24位的化合物中，糖皮质激素占13种。虽然一种内源性盐皮质激素已被证明可以诱导训练免疫，但糖皮质激素诱导先天免疫训练既独特又令人惊讶。然而，已有文献证明糖皮质激素在先天免疫细胞中产生的复杂影响。有趣的是，在文献研究中，1993年的一项研究确定，内毒素（LPS）刺激前6天，人类体内合成的高皮质醇血症会导致血清细胞因子水平升高，但并未指出可能的原因。作者假设训练免疫可能有助于解释这一观察结果。其余的命中化合物包括肾上腺素能激动剂、农药和抗肿瘤药物（图1C）。为了捕捉各种可能的训练途径，作者选择了七种表现最佳的化合物（包括每个类别中的代表性化合物），用于进一步的体外和体内研究（图1D和E）。
实验结果2
非免疫原性小分子可抑制急性炎症，但以剂量依赖性方式诱导训练表型
在确定了TLR刺激后增加TNF-α分泌的一组化合物后，作者希望通过进一步的体外研究来验证它们是否具有与其他已知训练剂相似的训练活性。为了确保作者选择了最佳的浓度和激动剂配对，作者首先进行了一系列酶联免疫吸附测定（ELISA）来验证训练效果。在第0天，每孔96孔板中总共接种了100,000个BMDM。在第1天，用多种浓度（100 nM至10 μM）的命中化合物训练BMDM，以确定不引起毒性的最有效浓度（图2A）。其余的实验步骤与之前描述的相同，在第7天收集上清液。使用ELISA法测量上清液中的TNF-α浓度。大多数化合物均产生了显著的、剂量依赖性的阳性训练反应，在大多数有效化合物中，10 μM是诱导TNF-α上调的最有效剂量。因此，所有后续的体外实验均选择10 μM。更高浓度的细胞毒性可能会削弱体外训练的效果。在每个实验中，使用七种化合物训练的BMDM中均观察到TNF-α和白细胞介素-6（IL-6）的升高。训练免疫的一个标志是对异质挑战的细胞因子反应增加，这有助于其提供针对多种病原体的广泛保护。为了证明有效的训练反应与多种TLR激动剂兼容，用氢化可的松训练的BMDM分别用LPS（TLR4激动剂）或Pam3CSK4（TLR1/2激动剂）刺激（图2B）。与未经训练的BMDM相比，训练后的BMDM在每种TLR激动剂的作用下，TNF-α的产生量都增加了约30%。
作者感兴趣的是确定作者的候选化合物与已知训练化合物之间的异同。与β-葡聚糖和BCG不同，这些候选化合物在BMDM孵育的前24小时内不会诱导促炎细胞因子产生。事实上，有些化合物在LPS刺激前1小时给予时，可显著抑制急性炎症（图2C）。作者还收集了第6天TLR刺激前后的上清液。第6天收集的上清液中几乎没有促炎细胞因子产生，这表明反应并不依赖于固有细胞的细胞因子激活。与已知的训练诱导剂不同，这些化合物在炎症特征方面具有独特性，因此我们试图找出已知代谢和表观遗传特征可能涉及的途径。
实验结果3
糖皮质激素的调节依赖于糖酵解
糖酵解上调通常被认为是训练免疫诱导的潜在机制之一。作者使用标准糖酵解抑制剂测试了代表性的高性能化合物，在给药前1小时给予小分子。与未经训练的对照组相比，细胞因子升高减少表明糖酵解参与其中。在糖皮质激素、氟尼缩松和氢化可的松中，作者观察到抑制糖酵解（2-脱氧-D-葡萄糖）后训练反应显著减弱（图3A）。然而，除糖皮质激素外的所有其他化合物在实验中均未对抑制糖酵解训练途径产生反应（图3B）。正如预期的那样，未经训练的对照组对抑制剂治疗没有反应。此外，氟尼缩松对5′-脱氧-5′-(甲基硫代)腺苷（MTA）抑制有显著反应，但并不受表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）抑制，EGCG是一种组蛋白乙酰化酶抑制剂。这些结果表明，糖皮质激素通过糖酵解和表观遗传途径诱导训练免疫，而其他化合物可能通过不同的途径进行训练。
实验结果4
ATAC-seq揭示了小分子诱导的BMDM之间的差异染色质可及性
作者假设，使用不同的小分子进行训练会导致染色质可及性的改变，而这些变化可能会因每种训练化合物的特定刺激而有所不同。为了评估这一假设，作者在BMDMs暴露于前七种有效化合物后4天从其核中分离出核，并进行了ATAC-seq实验（图4A）。随后，作者确定了开放染色质峰的区域，这些区域在响应不同处理时表现出可及性水平的显着变化。为了提高统计能力和精确度，以评估这些“差异可及性（DA）峰”的效果大小，作者采用了一种称为“mash”的多变量自适应收缩方法，该方法利用了不同处理效果大小之间的相关结构。
β-葡聚糖处理巨噬细胞时观察到的DA峰数量最多[包括36235个峰值，在误报率（FDR）=5%时归类为DA]，其次是氟尼缩松（n = 11683个DA峰）（图4B）。相反，其他所有处理方法产生的DA峰数量较少，其中对对苯二酚的反应变化最少（n = 7316 DA峰）。对不同处理方法的效果大小进行相关性分析后，发现了三个不同的簇：簇1包括β-葡聚糖，簇2包括糖皮质激素，簇3包括所有其他处理方法（图4C）。这一观察结果表明，与功能性训练相关的染色质改变模式因特定刺激而异。作者对差异可及性的分析揭示了糖皮质激素、病原体相关β-葡聚糖和其他小分子训练所特有的表观遗传学特征。
为了进一步了解这些化合物如何影响转录反应，作者检查了单个分子和包括β-葡聚糖在内的所有化合物共同具有的最大可及性基因。在所测试的所有化合物中，染色质可及性增加的两个在统计学上最显著的峰值位于SH3GLB1和SCARB1转录起始位点附近。SH3GLB1影响线粒体动力学、自噬和细胞凋亡，而SCARB1是一种参与胆固醇摄取和代谢的清除受体。基因集过度富集分析发现，在测试的每种处理中，被认为对训练免疫很重要的几个通路中，基因附近的染色质开放性显著增加（FDR = 10%）。这些通路包括白细胞介素信号传导、TLR信号传导、吞噬作用、染色质修饰和碳水化合物代谢（图4D）。当仅分析在所有处理中改变可及性水平的峰值时，作者发现与IL-4和IL-13信号通路以及粒细胞生成的转录调控相关的基因附近的可及性富集。有趣的是，作者发现糖皮质激素训练的骨髓间充质干细胞中G蛋白偶联受体（GPCR）配体结合和视紫红质样受体活性特别丰富。这一结果表明，糖皮质激素诱导的变化与常见的训练途径不同。
接下来，作者试图了解哪些转录因子（TF）可能与接受不同分子治疗的骨髓间充质干细胞表观遗传学景观的变化有关。在所有治疗中，NF-κB、Jun、Fos和CEBP结合位点在获得染色质可及性的区域中富集，这表明这些转录因子的激活可能是所发现的表观遗传学变化的驱动因素。先前在训练免疫方面的工作已经确定Jun和Fos是训练的关键转录调节因子。此外，作者注意到在所有治疗中，除了糖皮质激素外，与细胞增殖和分化相关的Krüppel样因子（KLF）和特异性蛋白（Sp）家族转录因子（TF）的富集增加。值得注意的是，在非甾体类药物治疗中富集的KLF14已被证明可调节巨噬细胞的糖酵解。然后，作者进行了足迹分析，以确定训练分子在训练后未受刺激状态下结合的TF是否存在差异。虽然这并不能确定TF在训练细胞中应对炎症挑战时的表现，但它可能有助于深入了解TF在诱导训练状态中的作用。在糖皮质激素训练的BMDM中，活跃结合的TF数量减少，而使用其他小分子或β-葡聚糖训练的BMDM中，结合的TF数量相对于PBS处理的BMDM有所增加。在足迹分析中发现了许多KLF和Sp家族的转录因子，它们具有共同的保守序列，尽管其中许多转录因子竞争相同的结合位点，并具有抑制和激活功能（图4E）。不出所料，在足迹分析中，NF-κB及其亚基均未显示出占位迹象，这表明训练后未受刺激的BMDM不会促进炎症的固有激活。这些发现共同表明，使用不同的小分子进行训练可以诱导所有治疗中启动训练所需的基本染色质重塑，以及足迹分析所暗示的由不同TF组激活可能介导的独特表观遗传变化。糖皮质激素和其他训练诱导剂所表现出的训练免疫激活的独特模式值得进一步研究其机制。
实验结果5
非炎症性小分子可诱导体内训练免疫反应
接下来，作者试图确定在体外鉴定和验证的小分子是否能在体内诱发训练反应。为了验证这个问题，每隔一天对6周大的雌性C57Bl/6 J小鼠进行三次腹膜内（IP）训练注射。每种化合物以50微升注射液的形式配制，溶于10%二甲基亚砜（DMSO）和90%玉米油中。氢化可的松和5-氟吲哚-2-羧酸的注射剂量为2微摩尔，因为它们不如其余化合物有效，其余化合物的注射剂量为1.5微摩尔。对于未经训练的对照组，小鼠只接受不含化合物的载体溶液。经过7天的休息期后，小鼠接受了1微克LPS IP的刺激（图5A）。刺激1小时后，通过下颌静脉采集血清，并使用ELISA检测促炎细胞因子TNF-α和IL-6。与未经训练的对照组相比，作者选择的七种化合物均能提高血清中TNF-α和IL-6细胞因子的水平，其中氢溴酸非诺特罗的细胞因子生成量增加1.6倍，氟尼缩松增加4倍（图5B）。这一差异表明，使用我们的小分子化合物进行训练可显著增强对炎症挑战的先天免疫反应。
作者想要确定哪些细胞和细胞类型在小分子训练中导致血清细胞因子增加。作者选择了三种最有前景的化合物：氟尼缩松、杨梅素和氢醌，以研究细胞反应。为了确定哪些细胞参与其中，作者给小鼠注射训练剂，并按照之前描述的方式对其施加刺激。然后，在刺激后2小时处死小鼠，并通过灌洗收集腹膜细胞。对细胞进行固定和染色，以检测细胞内TNF-α和IL-6以及表面共刺激标记物CD40、CD86和MHCII。我们还纳入了包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞在内的先天免疫细胞的谱系标记物。然后通过光谱流式细胞仪对染色后的细胞进行分析。作者最初观察到，与未训练或β-葡聚糖训练的对照组相比，使用氟尼缩松或杨梅素训练的小鼠腹膜灌洗液中的细胞数量增加（图5C）。每种训练化合物所增加的细胞数量各不相同。氟尼缩松和杨梅素训练的小鼠TNF-α+和IL-6+嗜酸性粒细胞的数量显著增加（图5D）。接受对苯二酚训练的小鼠表现出不同的表型。虽然TNF-α+和IL-6+细胞的数量没有增加，但接受对苯二酚训练的小鼠中TNF-α+中性粒细胞和IL-6+嗜酸性粒细胞的细胞因子中位荧光强度（MFIs）显著增加（图5E）。这些结果表明，氟尼缩松和杨梅素通过增加产生TNF-α和IL-6的嗜酸性粒细胞的数量，促进这两种细胞因子的产生。另一方面，对羟基苯甲酸诱导中性粒细胞产生更多的TNF-α和IL-6，但数量没有显著增加。这与β-葡聚糖形成鲜明对比，β-葡聚糖不会在腹膜空间产生更多的细胞，但仍然导致嗜酸性粒细胞中IL-6的MFI更高。
作者还考虑了这些细胞的激活如何导致共刺激分子发生变化。在考虑刺激表面分子（如CD86和MHCII）时，只有氟尼缩松训练的小鼠与对照组有显著差异。通过测量CD86+细胞的MFI，我们发现氟尼索利特训练的小鼠在嗜酸性粒细胞和小型腹膜巨噬细胞（SPM）上表现出CD86数量增加（图5F）。此外，在氟尼索利特训练的小鼠中，MHCII+ SPM的MFI也增加了（图5G）。β-葡聚糖训练的小鼠中，MHCII+ 嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和大型腹膜巨噬细胞（LPM）的MFI增加。综上所述，这些数据表明，虽然小分子训练的小鼠血清细胞因子水平也有类似增加，但根据训练分子的不同，对LPS刺激作出反应的固有细胞的细胞谱系存在差异。因此，每种小分子在体内诱导训练免疫的细胞机制可能存在差异。
