Science子刊丨在非酒精性脂肪性肝炎中，HIF-2α 驱动肝Kupffer 细胞死亡和促炎性招募的巨噬细胞活化

肝巨噬细胞中表达 HIF-2α

    为了评估肝巨噬细胞是否表达 HIF-2α，作者对非酒精性脂肪肝患者不同阶段的肝活检样本进行了免疫组化（IHC）分析。TIMD4只在常驻 KC 中表达，而不在 RHM 中表达，而AIF1（编码 IBA1）则在大多数肝巨噬细胞群中广泛表达。用抗 HIF-2α、抗 TIMD4 和抗 IBA1 抗体对人肝脏切片进行染色时，大多数 TIMD4+细胞都是 IBA1+ 细胞，这表明 TIMD4+细胞大多是 KCs。值得注意的是，HIF-2α在NASH肝脏不同阶段的TIMD4+肝KC中均有表达（图1A）。同样，在小鼠中，HIF-2α也在正常饮食（NCD）健康小鼠的部分（尽管不是全部）KC中表达，在正常饮食中，KC占肝巨噬细胞的大部分（图 1B）。在 NASH 饮食中，HIF-2α+KCs 的比例增加了（图 1，B 和 C）。此外，HIF-2α 也在TIMD4-  IBA1+RHMs 中表达，而后者在 NASH 中增加（图 1，B 和 C）。健康小鼠肝脏间质氧（O2）的生理浓度为 2.2% 至 4.4%，平均值为 3.18%，肥胖时略有下降：高脂饮食（HFD）/肥胖野生型（WT）小鼠的O2浓度为 1.2% 至 4.4%，平均值为 3.0%。为了检测肥胖是否会导致巨噬细胞 HIF-2α 的表达增加，作者将原代 KCs 和骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）培养在不同的氧气浓度下，并通过 Western 印迹检测 HIF-2α 的表达。在 <3%氧气条件下，BMDMs 和 KCs 中的 HIF-2α 表达明显增加（图 1D）。此外，用肥胖者血浆或肝脏中增加的细胞因子、激素和营养物质（如瘦素、胰岛素和高血糖）进行24小时处理，都会增加KCs和BMDMs中HIF-2α的表达（图1E）。与 KCs 相比，BMDMs 对增加 HIF-2α 表达的代谢和炎症信号更敏感，尤其是在单独处理时。例如，TGFβ和TGFβ+棕榈酸（PA）处理足以诱导BMDMs中的HIF-2α，而在KCs中则不然（图1E）。此外，单用胰岛素处理可增加 BMDMs 中 HIF-2α 的表达，但在 KCs 中却不能。这些变化与调节 HIFα 表达或活性的蛋白质在 KCs 和 BMDMs 中的不同表达有关。为了评估肝巨噬细胞中 NASH 诱导的 HIF-2α 表达是否与Hif2amRNA 表达增加有关，作者分析了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据。在 NCD 和 NASH 两种饮食中，Hif2a在所有肝巨噬细胞群中都有表达，但与 RHMs 相比，Hif2a在 KCs 中的表达更为丰富（图 1F）。与此相一致，KCs 中Hif2a的表达高于 BMDMs（图 1G）。与蛋白表达不同的是，与健康 KCs 相比，NASH KCs 中Hif2amRNA 的表达适度降低（图 1F）。此外，将 KCs 或 BMDMs 培养在高葡萄糖+高 PA 培养基中并不会增加Hif2a的表达（图 1G），这表明 NASH 肝巨噬细胞中 HIF-2α 表达的增加并不是由于Hif2amRNA 表达的增加。总之，这些结果表明，HIF-2α在肝巨噬细胞中表达，而肥胖/NASH中表达HIF-2α的巨噬细胞数量增加是由于间质O2浓度的集体变化以及循环中葡萄糖、脂肪酸、胰岛素和瘦素的增加。

髓系 HIF-2α 可促进 NASH 的发展

    为了评估巨噬细胞HIF-2α对NASH发展的影响，作者通过Lyz2-cre小鼠与Hif2a-floxed小鼠杂交，产生了髓系特异性HIF-2α基因敲除（KO）（H2MKO）小鼠。KCs和BMDMs中Hif2a的mRNA表达下降了>99%，而Hif1a的表达没有变化（图2A）。在 NCD 条件下，体重、肝脏和附睾脂肪组织质量、炎症基因表达和葡萄糖耐量均无变化。Cre+:Hif2afl/fl（H2MKO）和 Cre-:Hif2afl/fl（WT）同胎对照小鼠的体重、炎症基因表达和葡萄糖耐量相当，这表明髓系 HIF-2α 的耗竭不会影响肝脏或脂肪组织的发育或这些组织的炎症反应。在NASH饮食中，WT小鼠和H2MKO小鼠的体重和附睾内脏脂肪组织质量仍然相当（图2，B和C）。然而，与 WT 对照组相比，H2MKO 小鼠的肝脏质量和肝脏甘油三酯（TG）含量（图 2，C 和 D）以及血浆 TG 和胆固醇浓度（图 2E）明显下降。组织学分析表明，与 WT 相比，H2MKO 小鼠的肝脏炎症和纤维化得到了改善（图 2，F 和 G），血清转氨酶浓度也得到了改善（图 2H），这表明髓系 HIF-2α 的消耗减轻了 NASH 的肝损伤。与这些结果一致的是，与 WT 对照组小鼠相比，H2MKO 小鼠肝脏中纤维化基因（Timp1和Tgfb）、促炎基因（Ccl2）和致脂基因（Srebp1、Fasn 和Scd2）的 mRNA 表达均有所下降（图 2I）。此外，编码脂肪酸氧化限速酶的Cpt1 的表达也增加了，尽管 H2MKO 小鼠肝脏脂肪酸氧化的增加并无统计学意义（P= 0.0538）（图 2，I 和 J）。这些变化与葡萄糖耐量和脂肪组织炎症的变化无关。

    在肥胖症中，肠道菌群失调和肠道通透性增加会诱发代谢性内毒素血症并增强 NASH 表型。肠道巨噬细胞调节屏障功能，肠道巨噬细胞功能的改变与 NASH 和肝纤维化的发生有关。因此，作者评估了巨噬细胞 HIF-2α 的耗竭是否会减少内毒素的门静脉进入。与 NASH WT 对照组相比，NASH H2MKO 小鼠门静脉血浆和肝脏中的内毒素浓度相当。此外，将原代小鼠肝细胞培养在含有 10% NASH 饮食 H2MKO 小鼠门静脉血清的培养基中，与培养在含有 10% NASH 饮食 WT 小鼠门静脉血清的培养基中的肝细胞相比，脂肪生成基因、炎症基因和纤维化基因的表达量并没有减少。这些结果表明，髓系 HIF-2α 并不主要通过改变进入肝脏的肠源性信号量来促进 NASH。因此，作者重点研究了删除 KC 特异性 HIF-2α 是否足以改善 NASH 表型的问题。作者生成了含有 WT 肝细胞、WT 肝星状细胞和 WT 或 HIF-2α KO KC 的 WT 和 KC 特异性 HIF-2α KO 肝球，并将其置于正常培养基或含有 PA、油酸、果糖和脂多糖（LPS）的培养基中培养。在这种 NASH 培养基中孵育会增加 WT 球形细胞中Tnf、Ccl2、Acta2、Tgfb1 和Srebp1 的表达，而在 KC 特异性 HIF-2α KO 球形细胞中这种表达会减弱（图 2K）。相反，与 WT 对照组相比，KC 特异性 HIF-2α KO 小球中Cpt1和Bambi[静止肝星状细胞的标记物] 的表达增加。为了在体内验证这一点，作者通过将Hif2a -floxed小鼠与Clec4f-Cre 小鼠杂交，产生了 KC 特异性 HIF-2α KO 小鼠（图 2L），并给它们喂食诱发 NASH 的饮食。KC 特异性 HIF-2α KO 小鼠的血清转氨酶浓度降低（图 2M）。此外，与 NASH WT 小鼠相比，NASH HIF-2α KC KO 小鼠中 NASH 相关基因（如Tnf、Ccl2、Acta2、Tgfb1 和Srebp1）的 mRNA 表达减少，而肝脏Cpt1和Bambi mRNA表达增加（图 2N）。与此相一致的是，与 NASH WT 小鼠相比，NASH HIF-2α KC KO 小鼠的肝脏 TG 含量降低（图 2O）。为了评估抑制 HIF-2α 是否会改善人类系统中的 NASH 表型，作者生成了含有肝细胞、肝星状细胞和其他非实质性细胞（NPC，包括巨噬细胞）的人肝球，并在有或没有 HIF-2α 特异性抑制剂 PT-2385 的情况下将它们培养在 NASH 培养基中。1 周后，与对照培养基相比，在 NASH 培养基中培养的人肝球形细胞中涉及 NASH 病理的基因，如COL1A1、ACTA2、TNF 、TGFB 和TIMP1 的表达增加了（图 2P）。值得注意的是，PT-2385 治疗抑制了这些变化，表明 HIF-2α 是 NASH 发生的必要条件（图 2P）。总之，这些结果表明，HIF-2α 会促进小鼠和人类 NASH 的发展。

HIF-2α 在 NASH 中诱导 KC 死亡

    为了了解髓系 HIF-2α 如何增强 NASH 病理学，作者对从 H2MKO 和 WT 小鼠肝脏中分拣出的 CD45+白细胞进行了 scRNA-seq 分析。结果表明，NASH饮食WT小鼠肝脏免疫细胞中大部分（约40%）是巨噬细胞，这些巨噬细胞分为Clec4f+ Timd4+ Cx3cr1-KCs、Trem2 +Clec4f- Timd4-  Cx3cr1+KC样募集巨噬细胞（KLRMs）以及Ly6chigh和Ly6clow募集巨噬细胞（RMs）（图3， A和B）。与之前的报告相似。与 WT 小鼠相比，H2MKO 小鼠所有肝巨噬细胞亚型中参与炎症通路（如通过核因子 κB 和 TGFβ 信号转导的 TNFα 信号转导）的基因表达均下降（图 3C）。在 NASH 发育过程中，KC 自我更新受损，KC 死亡增加，促进了胚胎 KC 被促炎性血液单核细胞衍生的 RHMs 取代，这是 NASH 病理的重要病因组成部分。IHC 分析显示，与 WT 小鼠相比，H2MKO 小鼠中活性/裂解的 caspase3+KCs 比例下降（图 3D）。此外，与 NASH WT 小鼠相比，NASH H2MKO 小鼠分选的 KC 中的 caspase-3/7 活性更高，这表明 HIF-2α 会诱导 NASH 中 KC 的死亡。当使用 Ki67 或mki67阳性作为巨噬细胞增殖的测量指标时，IHC 和 scRNA-seq 分析显示，与 WT 对照组相比，NASH H2MKO 小鼠中增殖的 KC 在 KC 总数中所占的比例增加了（图 3，E 和 F）。与此相一致的是，与 NASH WT 小鼠相比，NASH H2MKO 小鼠 KCs 中mki67（增殖细胞的标记物）的表达也增加了。因此，与 WT 小鼠相比，H2MKO 小鼠的 KC 在 NPC 或肝巨噬细胞总数中所占比例（图 3，G 和 H）以及 KC 与 KLRM 的比例（图 3I）均有所增加。除了单核细胞衍生的 1 型树突状细胞、Xcl +自然杀伤细胞和 T 细胞外，非巨噬细胞免疫细胞类型在肝脏 NPCs 总数中的比例基本保持不变。

    在 NASH 中，KC 死亡的增加促进了 RHMs 的龛特异性重编程。因此，作者使用诸如 RNA Velocity、Pseudotime 和 CytoTrace 等硅系追踪方法评估了 H2MKO 小鼠中 KC 死亡的减少是否会影响 RHM 的分化。这些方法通过计算未剪接转录本与剪接转录本的比例来估计基因表达状态的时间导数，从而提供每种细胞类型表型转换的快照。在 WT 小鼠和 H2MKO 小鼠中，RHMs 都来自 Ly6c2+RMs，它们经历了向 KLRMs 或更成熟形式的 Ly6c2+RMs 的双向变化（图 3，J 和 K）。与 WT 小鼠相比，H2MKO 小鼠向这两个方向变化的幅度大大降低（图 3K），而 H2MKO 小鼠的变化轨迹和 RHMs 的成熟程度与 WT 小鼠基本相同（图 3，J 至 L）。另一方面，与 WT 小鼠相比，H2MKO 小鼠中分化的 KLRMs 向 KC 样表型的转录运动更强（图 3K）。总之，这些结果表明，HIF-2α 在 NASH 发展过程中介导了 KC 死亡增加和 KC 被 RHMs 替代。

HIF-2α 可增强 NASH 中 KC 的溶酶体应激反应并抑制胞葬

    为了了解 HIF-2α 如何抑制 KC 的生长和功能，作者分析了 WT 与 KO KC 之间以及健康与 NASH WT KC 之间的差异表达（DE）基因。与健康对照组相比，共有 396 个基因在 NASH WT KC 中上调或下调（图 4，A 和 B）。其中，24%由NASH诱导的基因表达变化因HIF-2α缺乏而逆转。在KCs中发现的HIF-2α靶基因中，只有44%与在KLRMs中一样受HIF-2α调控，其余56%在KCs中的HIF-2α靶基因不受KLRMs中HIF-2α的调控（图4，A和B）。在这些 KC 特异性 HIF-2α 靶基因中，13%（52 个基因）在 KCs 中特异表达（而在 RHMs 中不表达），大多数 KC 特异性 HIF-2α 靶基因（87%）在 KCs 和 RHMs 中均表达，但在 KCs 中受 HIF-2α 调节，而在 RHMs 中不受 HIF-2α 调节（图 4C）。这些结果表明，虽然HIF-2α通常调控KCs和RHMs中的促炎基因表达，但HIF-2α也调控NASH肝脏中巨噬细胞亚型特异性基因的表达。

    为了了解HIF-2α对KC功能的影响，作者重点研究了KC和KLRMs中常见的HIF-2α靶基因，它们表现出相对相似的表型。HIF-2α 抑制了参与吞噬和吞噬体/溶酶体活性的基因的表达（图 4D），这些基因对 KCs 清除血源性病原体和死细胞（胞葬）非常重要。为了评估 HIF-2α 在何种条件下调节溶酶体活性，作者将 WT 和 HIF-2α KO KCs 在正常或高葡萄糖+PA（代谢应激）培养基中培养 48 小时。与 WT KCs 相比，在高葡萄糖+PA 条件下，HIF-2α KO 的相对溶酶体质量和溶酶体活性（图 4，E 和 F）以及流出细胞活性（图 4G）更高。这些变化与溶酶体/吞噬体基因（如Marco、Ctsa、Ctsb、Atp6v1c1 和Cd68）的表达增加有关（图 4H）。与这些结果一致的是，与 WT 小鼠相比，从 H2MKO 小鼠分离的 NASH KCs 的流出细胞活性增加了（图 4I）。这些结果表明，HIF-2α 会增强 NASH KCs 的溶酶体应激反应并降低胞葬。

HIF-2α 可诱导 NASH KC 溶酶体细胞死亡

    此前有研究表明，代谢应激可通过引起内质网（ER）应激诱导 KC 死亡。因此，作者评估了 HIF-2α 是否会通过增强 NASH 的 ER 应激而诱导 KC 死亡。用ER应激诱导剂硫司加精（thapsigargin）处理WT KCs可增加其凋亡的caspase-3/7活性。这种效应在 HIF-2α KO KCs 中减弱，表明 HIF-2α 参与了 ER 应激诱导的 KC 死亡。然而，在 NASH HIF-2α MKO 与 NASH WT 小鼠的 KC 中，ER 应激基因表达没有变化。这表明，在 NASH KCs 中，HIF-2α 是介导 ER 应激诱导的 KC 死亡的下游效应物，而不是 ER 应激的上游调节物。ER应激会破坏溶酶体的稳态，而溶酶体在较高的吞噬/吞噬或自噬负担下活性降低会增强溶酶体应激，导致活性氧（ROS）产生增加和NASH KCs溶酶体细胞死亡。因此，作者评估了 HIF-2α 是否会影响溶酶体的完整性。与作者的假设一致的是，与分离自 NASH 小鼠的 WT KCs 相比，HIF-2α KO KCs 中的细胞膜溶酶体溶酶体蛋白酶 D 减少了，但 KO KCs 中的溶酶体溶酶体蛋白酶 D 增加了（图 4，J 和 K）。这些结果表明，HIF-2α的缺乏改善了KCs溶酶体膜的完整性。此外，与 WT 相比，HIF-2α KO KCs 中代谢应激诱导的线粒体 ROS（mtROS）和脂质过氧化物[丙二醛（MDA）]减少，同时细胞凋亡减少（图 4，L 至 N）。用 cathepsin B 抑制剂 CA-74-ME 处理或敲除Ctsb或Ctsd可减少代谢压力诱导的 WT HIF-2α KO KC 细胞凋亡，从而消除 HIF-2α KO 对减少 KC 细胞凋亡的影响（图 4O）。虽然已知 HIF-2α 能诱导 BMDMs 中抗氧化基因的表达，但 HIF-2α KO 并没有降低 KCs 中抗氧化基因的表达。总之，这些结果表明，HIF-2α会增强KCs中的溶酶体应激，导致氧化应激增加和溶酶体细胞死亡。

HIF-2α 通过诱导 KCs 中依赖于 mTOR 和 ERK 的 TFEB 磷酸化/抑制，抑制溶酶体基因的表达

    虽然 HIF-2α 是一种可直接与 DNA 结合的转录因子，但在吞噬细胞和溶酶体基因启动子中进行的序列基元分析并未在启动子区域发现推定的缺氧反应元件。因此，作者将注意力转向了 HIF-2α 诱导的细胞信号传导变化，这种变化会影响溶酶体基因的表达。作者对分离自 NASH 小鼠的 WT 和 HIF-2α KO KC 中表达的全蛋白组和磷酸蛋白组进行了定量蛋白质组学分析，发现 HIF-2α 缺失的 KC 磷酸蛋白组发生了明显变化（图 5A）。通路分析表明，HIF-2α 促进了增加细胞死亡和抑制细胞增殖的信号（图 5B），这与作者从 scRNA-seq、IHC、mki67表达测定和 caspase-3/7 活性测定中得出的结果一致。最显著的变化包括哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）信号转导的减少（图 5B）。mTOR 的激活通过磷酸化和抑制溶酶体主转录因子 EB（TFEB）来阻止溶酶体基因的表达。此外，利用磷酸蛋白组学数据进行的差异激酶组预测显示，HIF-2α 可刺激丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（图 5C），而 MAPK 也可诱导抑制性 TFEB 磷酸化。为了检测 HIF-2α 是否诱导抑制性 TFEB 磷酸化，作者测量了 NASH WT 小鼠和 H2MKO 小鼠 KC 中磷酸化 TFEB（Ser142）的丰度。与 WT 相比，NASH H2MKO 小鼠 KCs 中 TFEB 和 mTOR 的磷酸化程度降低（图 5D）。与这些结果一致的是，将来自 NCD/healthy WT 小鼠的原代 KCs 培养在高葡萄糖+PA 培养基中会增加 mTOR 和 TFEB 的磷酸化（Ser142），这在 HIF-2α KO KCs 中有所减轻（图 5E）。此外，磷酸化的 mTOR 和细胞外信号调节激酶（ERK）丰度也因 HIF-2α 的耗竭而降低（图 5F），与 ERK 特异性抑制剂 U0126 或 mTOR 抑制剂雷帕霉素的效果相似（图 5G）。这证实了 HIF-2α KO 降低了 ERK 和 mTOR 依赖的 TFEB 磷酸化。相反，组成型活性 HIF-2α 的过表达减少了 TFEB 靶基因如Marco和Ctsb的表达（图 5H）。HIF-2α 可通过增加氨基酸载体（如 SLC7A5 和 SLC7A11）的表达来刺激 mTOR 的活性，还可刺激ErkmRNA 的表达。与此相一致的是，HIF-2α KO KCs 中 mTOR 丰度的降低与Slc7a5、Slc7a11 和参与 MAPK 信号转导的基因表达的降低有关（图 4D 和 5，H 和 I）。

    依赖于 mTOR 的 TFEB 磷酸化/抑制由蓇葖蛋白（由Flcn 编码）介导，缺失Flcn会导致培养的巨噬细胞中依赖于 TFEB 的吞噬作用增强。反义寡核苷酸（ASO）是与互补 RNA 序列结合以抑制其表达或功能的短合成寡核苷酸。为了评估依赖于 mTOR 的 TFEB 磷酸化/抑制是否介导了 KC 死亡的增加，作者在 WT 或 CA-HIF-2α 表达过高的 KC 中转染了Flcn 特异性（Flcn-ASO）或乱码 ASO 对照，并将这些 KC 培养在低或高葡萄糖+PA 培养基中。根据 caspase-3/7 活性评估，Flcn-ASO可减少代谢应激诱导的 KC 死亡（图 5J）。为了评估抑制依赖于 mTOR 的 TFEB 磷酸化是否会改善 NASH，作者用Flcn 特异性 ASOs（Flcn-ASOs）或乱码对照处理 WT 或 KC特异性 CA-HIF-2α 表达的小鼠肝球体，并将这些球体培养在对照或 NASH 培养基中。Flcn-ASO处理减轻了在 NASH 培养基中培养的 WT 小鼠肝球体中 NASH 相关基因的表达，如Tnf、Acta2、Tgfb1、Col1a1 和Srebp1（图 5K）。Flcn-ASO 对 KC 死亡和 NASH 表型的这些影响不受 CA-HIF-2α 过表达的影响（图 5，J 和 K），这表明 mTOR - 绒毛膜-TFEB 是 HIF-2α 的下游。为了在体内验证这一点，作者给喂食NASH诱导饮食的WT小鼠注射了Flcn特异性或加扰对照ASO。注射到小鼠体内后，大多数 ASO 会在肝脏中蓄积，巨噬细胞吸收 ASO 的效率是肝细胞的 4 倍。施用Flcn-ASO 可降低血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的浓度（图 5L），从而减少肝损伤。此外，用Flcn 特异性 ASOs 治疗的小鼠与加扰对照组相比，NASH 相关的组织学变化减少，肝脏 TGs 下降（图 5，M 和 N）。与这些结果一致的是，Flcn-ASO 处理可减少致脂、炎症和纤维化基因的 mRNA 表达（图 5O）。这些结果表明，HIF-2α 诱导的依赖于 mTOR 的 TFEB 磷酸化/抑制有助于 NASH 的发展。

在 NASH 中，HIF-2α 通过增加 ANT2 依赖性的 mtPTP 开放驱动促炎巨噬细胞活化

    为了了解 HIF-2α 如何驱动 NASH 中 Ly6C+RMs（最促炎的 RHM 群体）的促炎活化，作者对来自 NASH 小鼠的分选 WT 和 HIF-2α KO Ly6C+RMs 进行了无偏见的定量蛋白质组学分析（图 6A）。与作者的 scRNA-seq 分析结果一致，在 HIF-2α KO Ly6C+RMs 中，许多参与应激反应和炎症的蛋白质表达量减少（图 6B）。相反，与来自 NASH 小鼠的 WT Ly6C+RMs 相比，HIF-2α KO Ly6C+RMs 中参与氧化磷酸化和脂肪酸代谢（抗炎巨噬细胞的特征）的蛋白质表达增加（图 6，A 和 B）。与 KCs 不同，NASH H2MKO 的 Ly6C+RMs 与 WT 小鼠相比，mTOR1 信号相关蛋白表达增加。此外，与在高葡萄糖+PA 培养基中培养的 WT BMDMs 相比，HIF-2α KO BMDMs 中磷酸化 TFEB 丰度增加，而相对于 WT，HIF-2α KO BMDMs 中 TFEB 靶基因的表达没有增加。这些结果表明，HIF-2α-mTOR-TFEB 通路是 KCs 的特异性通路，不会发生在骨髓来源的 Ly6C+RMs 中。

    在肥胖症中，游离脂肪酸会刺激线粒体通透性转换孔（mtPTP）的瞬时开放，推动脂肪组织巨噬细胞的促炎激活。腺嘌呤核苷酸转运酶-2（ANT2）在脂肪酸诱导的 mtPTP 开放中起着关键作用。值得注意的是，与 WT 相比，NASH H2MKO 小鼠分选的 Ly6C+RMs 中 mtPTP 成分（如 ANT2 和电压依赖性阴离子通道（VDACs））的蛋白表达量减少，而其他线粒体蛋白的表达量增加（图 6，A 和 B）。ScRNA-seq 数据分析显示，Ant2在包括 Ly6c2+RMs 在内的所有肝巨噬细胞亚型中均有表达（图 6C），其表达量是Ant1 的约 3 倍。然而，HIF-2α KO Ly6C+RMs 中 ANT2 表达的降低并非由于Ant2转录本丰度的降低（图 6D）。将 BMDMs 培养在高葡萄糖+PA 培养基中，ANT2 在 3 小时内增加，12 至 24 小时后下降。与 NASH Ly6C+RMs 相似，HIF-2α 缺乏导致代谢应激下培养的 BMDMs 中 ANT2 表达减少（图 6E），而Ant2mRNA 表达未发生变化（图 6F）。与 ANT2 表达减少一致的是，与 WT BMDMs 相比，HIF-2α KO BMDMs 中代谢应激诱导的 mtPTP 开放和 mtROS 生成明显减少，这与 mtPTP 抑制剂[环孢素 A（CsA）或 Tro19622]的效果相似（图 6，G 和 H）。根据柠檬酸合成酶（CS）活性测定，线粒体质量并没有减少。此外，与 WT 相比，HIF-2α KO BMDMs 中促炎细胞因子基因（如Tnf、Ccl2、Il1b 和Il6）的表达量减少（图 6I），与 CsA 处理的效果类似。与 WT BMDMs 相比，过表达 ANT2 会增加 HIF-2α KO BMDMs 中的 mtROS（图 6J，泳道 3 与泳道 6），这表明 HIF-2α 至少部分是通过增强 ANT2 表达和代谢应激诱导的 mtPTP 开放来促进 RHMs 的促炎激活的。与这些结果一致的是，与来自 NASH WT 小鼠的 Ly6C+RMs 相比，来自 NASH 饮食 HIF-2α MKO 小鼠的 Ly6C+RMs 表达较低量的促炎细胞因子基因，如Tnf、Ccl2 和Tgfb；释放较少的 TNFα、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1 和 TGFβ；并显示 ANT2 表达减少（图 6，K 至 M）。这些变化与氧化应激减少和线粒体质量增加有关，分别通过过氧化脂质浓度和 CS 活性来衡量。用 mtPTP 抑制剂 CsA 治疗可减少 NASH WT 小鼠 Ly6C+RMs 中促炎基因的表达，并消除 HIF-2α 缺乏对促炎基因表达的影响（图 6K）。总之，这些结果表明，HIF-2α 通过增加 ANT2 表达和 mtPTP 开放，增强了 Ly6C+RMs 的促炎激活。
    值得注意的是，在 KCs 中，HIF-2α 的缺乏并没有降低 ANT2 在 mRNA 或蛋白水平上的表达。此外，在 KCs 中，ANT2 的缺失并没有增加溶酶体或其他 KC 特异性 HIF-2α 靶基因的表达，这表明 HIF-2α 对溶酶体基因表达和 KC 死亡的影响并不是由于 ANT2 表达/活性的变化所致。
    TNFα、MCP-1 和 TGFβ 等炎性细胞因子会抑制肝细胞脂肪酸氧化，从而加剧肝脏脂肪变性，而巨噬细胞是 NASH 肝脏中这些炎性细胞因子的主要来源。因此，作者评估了 HIF-2α 的耗竭是否会减弱 NASH Ly6C+RMs 在肝细胞中的抗脂肪酸氧化效应。从 NASH WT 和 H2MKO 小鼠体内分离出 Ly6C+RMs，并收获 Ly6C+RM 条件培养基（CM）。将健康小鼠的原代小鼠肝细胞在 NASH WT 或 NASH HIF-2α KO Ly6C+RM-CM 中培养 24 小时，并测定脂肪酸氧化。与 WT RM-CM 相比，HIF-2α KO Ly6C+RM-CM 培养的肝细胞脂肪酸氧化和Cpt1表达更高（图 6，N 和 O）。这些结果表明，HIF-2α 依赖性诱导 Ly6C+RMs 中 ANT2 的表达和促炎细胞因子的产生，通过抑制 NASH 中肝细胞的脂肪酸氧化促进肝脏脂肪变性。