Chestnut Studying
摘要
Despite advances in antimicrobial and anti-inflammatory treatment, inflammation and its consequences remain a major challenge in the field of medicine. Inflammatory reactions can lead to life-threatening conditions such as septic shock, while chronic inflammation has the potential to worsen the condition of body tissues and ultimately lead to significant impairment of their functionality. Although the central nervous system has long been considered immune privileged to peripheral immune responses, recent research has shown that strong immune responses in the periphery also affect the brain, leading to reactive microglia, which belong to the innate immune system and reside in the brain, and neuroinflammation. The inflammatory response is primarily a protective mechanism to defend against pathogens and tissue damage. However, excessive and chronic inflammation can have negative effects on neuronal structure and function. Neuroinflammation underlies the pathogenesis of many neurological and neurodegenerative diseases and can accelerate their progression. Consequently, targeting inflammatory signaling pathways offers potential therapeutic strategies for various neuropathological conditions, particularly Parkinson’s and Alzheimer’s disease, by curbing inflammation. Here the blood–brain barrier is a major hurdle for potential therapeutic strategies, therefore it would be highly advantageous to foster and utilize brain innate anti-inflammatory mechanisms. The tricarboxylic acid cycle-derived metabolite itaconate is highly upregulated in activated macrophages and has been shown to act as an immunomodulator with anti-inflammatory and antimicrobial functions. Mesaconate, an isomer of itaconate, similarly reduces the inflammatory response in macrophages. Nevertheless, most studies have focused on its esterified forms and its peripheral effects, while its influence on the CNS remained largely unexplored. Therefore, this study investigated the immunomodulatory and therapeutic potential of endogenously synthesized itaconate and its isomer mesaconate in lipopolysaccharide (LPS)-induced neuroinflammatory processes. Our results show that both itaconate and mesaconate reduce LPS-induced neuroinflammation, as evidenced by lower levels of inflammatory mediators, reduced microglial reactivity and a rescue of synaptic plasticity, the cellular correlate of learning and memory processes in the brain. Overall, this study emphasizes that both itaconate and mesaconate have therapeutic potential for neuroinflammatory processes in the brain and are of remarkable importance due to their endogenous origin and production, which usually leads to high tolerance.
尽管抗菌和抗炎治疗取得了进展,炎症及其后果仍然是医学领域的一大挑战。炎症反应可导致脓毒症休克等危及生命的病症,而慢性炎症则有可能导致身体组织状况恶化,最终导致其功能严重受损。尽管长期以来人们认为中枢神经系统对外周免疫反应具有免疫特权,但最近的研究表明,外周的强烈免疫反应也会影响大脑,导致反应性小胶质细胞(属于先天免疫系统,存在于大脑中)和神经炎症。炎症反应主要是抵御病原体和组织损伤的保护机制。然而,过度和慢性炎症会对神经元的结构和功能产生负面影响。神经炎症是许多神经和神经退行性疾病发病机制的基础,并会加速其发展。因此,通过抑制炎症,针对炎症信号通路为各种神经病理状况提供了潜在的治疗策略,特别是帕金森氏症和阿尔茨海默氏症。在此,血脑屏障是潜在治疗策略的主要障碍,因此,促进和利用大脑的先天抗炎机制将具有极大的优势。三羧酸循环衍生的代谢产物衣康酸在活化的巨噬细胞中高度上调,并已被证明具有抗炎和抗菌功能的免疫调节剂。中康酸是衣康酸的异构体,同样可以减少巨噬细胞的炎症反应。然而,大多数研究都集中在其酯化形式及其外围效应上,而其对中枢神经系统的影响在很大程度上仍未得到探索。因此,本研究调查了内源性合成的衣康酸及其异构体中康酸在脂多糖(LPS)诱导的神经炎症过程中的免疫调节和治疗潜力。我们的研究结果表明,衣康酸和中康酸均可减轻LPS引起的神经炎症,具体表现为炎症介质水平降低、小胶质细胞反应性减弱以及突触可塑性恢复,突触可塑性是大脑学习和记忆过程的细胞相关机制。总体而言,这项研究强调,衣康酸和中康酸均具有治疗大脑神经炎症的潜力,并且由于其内源性来源和生产过程通常具有高耐受性,因此具有非常重要的意义。
实验结果1
衣康酸和中康酸预处理可减轻LPS引起的神经炎症
为了研究衣康酸和中康酸对LPS诱导的神经炎症可能具有的免疫调节和预防作用,3个月大的雄性C57BL/6小鼠接受了三次注射,分别注射了这些代谢产物(250毫克/千克)或作为对照溶液的PBS(作为代谢产物的溶剂),注射间隔为24小时。最后一次注射后24小时,小鼠分别接受两次注射,分别注射LPS(0.5 mg/kg)或生理盐水,两次注射间隔24小时。第二次注射LPS后3小时,小鼠被处死,样本被收集(图1A)。
每日体重监测显示,给予衣康酸和中康酸并不能阻止LPS引起的体重减轻,这表明最初的免疫反应并未受到影响(图1B、C)。值得注意的是,注射LPS 24小时后,与注射生理盐水的小鼠相比,所有组别的小鼠体重均显著下降。然而,与注射中康酸的小鼠相比,注射衣康酸的小鼠体重显著下降(图1C)。
考虑到衣康酸和中康酸在生物体内的半衰期较短,作者使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测量了在牺牲时(最后一次注射LPS或生理盐水后3小时)这些代谢产物在血清和脑中的浓度(图1D-F)。在血清中,与各自的对照组相比,所有注射LPS的组中,注射LPS后血液中的衣康酸水平均升高,无论是否预先处理过代谢产物(图1D)。值得注意的是,与未接受代谢物预处理的LPS注射小鼠相比,中康酸预处理可降低注射LPS小鼠的血清衣康酸水平(图1D)。此外,对注射生理盐水的小鼠进行代谢物处理前后对比发现,与另外两组生理盐水处理组相比,衣康酸预处理生理盐水对照组血液中的衣康酸水平有略微上升的趋势,但并不显著(图1D)。然而,血清中的中康酸含量太低,无法通过GC-MS进行可靠定量,且各组之间没有显著差异(图1E)。
为了研究注射的代谢产物是否部分渗透到大脑中,或者是否由LPS诱导大脑中的衣康酸水平,作者从脑组织中提取了代谢产物。值得注意的是,与各自的对照组相比,注射LPS后,用PBS或中康酸预处理的小鼠脑内衣康酸水平显著增加(图1F)。然而,与注射生理盐水的相应小鼠相比,注射衣康酸预处理的小鼠在注射LPS后脑中的衣康酸浓度没有显著变化,表明注射LPS本身不会增加这些小鼠脑中的衣康酸浓度(图1F)。值得注意的是,注射生理盐水后,注射衣康酸预处理的小鼠脑中的衣康酸浓度高于注射PBS或中康酸预处理的小鼠。这可能就是为什么在用衣康酸预处理并注射LPS的小鼠脑中未观察到衣康酸进一步显著增加的原因(图1F)。在脑中检测不到中康酸。总体而言,这些结果表明,注射LPS可增加血液和脑中的衣康酸水平。有趣的是,用衣康酸预处理的小鼠脑中衣康酸水平更高,这表明衣康酸可能到达脑部并被驻留细胞吸收,甚至在最后一次注射后持续超过50小时。
细菌性脂多糖注射会在外周和中枢神经系统引发强烈而短暂的免疫反应,其特点是炎症介质释放增加。为了评估衣康酸和中康酸在此方面的潜在益处,作者使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对血清和脑匀浆中分泌的特异性细胞因子水平进行了定量(图2)。
在缺乏衣康酸和中康酸的情况下,与注射生理盐水的对照组相比,注射LPS会显著增加血清中所有受测炎症介质的水平(图2)。相反,在中康酸预处理的小鼠中,LPS刺激后只有IL-6和TNF-α水平显著增加,而用衣康酸预处理的小鼠在LPS刺激后仅IL-1β水平显著增加(图2)。值得注意的是,与注射了LPS且未进行代谢物预处理的小鼠相比,衣康酸预处理可显著减少LPS诱导的IL-6和TNF-α释放(图2)。
为了评估外周LPS暴露引起的神经炎症反应,测量了全脑匀浆中的炎症介质(图2E-H)。与生理盐水对照组相比,在PBS预处理的小鼠中注射LPS显著增加了脑内IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(图2)。与相应的生理盐水对照组相比,作者发现,在预先使用衣康酸和中康酸处理的小鼠中,炎症介质并未增加。与PBS预处理LPS刺激的小鼠相比,代谢物预处理导致脑内IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低(图2)。海马中IL-1β和IL-6的基因表达分析进一步证实了这些结果,表明与未服用代谢物的LPS注射小鼠相比,衣康酸和中康酸预处理小鼠的IL-1β和IL-6显著降低(图2)。这些结果表明,衣康酸和中康酸预处理可以减轻LPS诱导的炎症反应,尤其是在大脑中,这凸显了它们改善神经炎症过程的潜力。关于抗炎细胞因子IL-10,在没有衣康酸和中康酸的情况下,LPS仅导致血清中的IL-10显著增加,而在其他测试组中作者没有观察到这种情况。各组大脑中的IL-10水平没有显著差异,这可能表明这两种代谢产物通过调节促炎介质而非抗炎介质来缓解炎症。
此外,由于脑源性神经营养因子(BDNF)也可以减轻神经炎症,因此评估了衣康酸和中康酸调节大脑中BDNF水平的能力。为此,作者分析了所有实验组在注射LPS后海马中BDNF基因的表达水平。与注射生理盐水的对照组相比,注射LPS后,无论注射的是PBS还是中康酸,小鼠的BDNF水平均显著降低(图2K)。然而,在注射了LPS后,与生理盐水对照组相比,在注射了衣康酸的小鼠中,BDNF表达的降低并不具有统计学意义(图2K),这表明在注射了LPS的小鼠中,注射了衣康酸的小鼠与注射了生理盐水的小鼠相比没有显著差异。这些发现表明,虽然衣康酸和中康酸减轻了LPS诱导的炎症介质上调,表明它们具有保护作用,但衣康酸仅显示出对LPS诱导的BDNF表达减少的保护作用趋势,这可能是未来研究中值得详细探讨的问题。
实验结果2
衣康酸和中康酸预处理可减轻LPS诱导的小胶质细胞反应性
微胶质细胞是大脑中的固有免疫细胞,对环境变化高度敏感,促炎介质升高会促使细胞向反应性表型转变。研究表明,在接触LPS后,用衣康酸和中康酸进行预处理可以减少外周和大脑中的炎症介质,在接下来的步骤中,作者研究了代谢物预处理是否也能有效减轻LPS诱导的小胶质细胞反应性。小胶质细胞密度增加和IBA1表达增加是神经炎症和小胶质细胞反应性增强的公认生物标志物。因此,作者通过标记小胶质细胞中的电离钙结合适配蛋白(IBA1)来量化小胶质细胞的密度,该蛋白是一种在海马CA1和齿状回(DG)亚区域的小胶质细胞和巨噬细胞中表达的细胞质标记物(CA1和DG的代表性图像分别如图3A、B所示)。与注射生理盐水的对照组相比,注射LPS后,PBS预处理小鼠海马CA1区和DG区的小胶质细胞密度增加,而注射中康酸预处理的小鼠注射LPS后,小胶质细胞密度也增加(图3C、D)。
然而,用衣康酸预处理可防止这种由LPS诱导的微胶质细胞密度增加。值得注意的是,对注射LPS的组进行比较,结果显示,在进行了衣康酸代谢物预处理后,DG亚区域IBA1+细胞的数量显著减少,而中康酸预处理仅使LPS诱导的小胶质细胞密度略有下降(图3D)。
下一步,作者将评估衣康酸和中康酸预处理是否能够减轻LPS诱导的IBA1上调,从而表明小胶质细胞的反应性降低(图3E、F)。注射了LPS的PBS预处理小鼠的IBA1荧光强度相对于盐水对照组显著增加(图3)。有趣的是,在用衣康酸或中康酸预处理的小鼠中,作者并未观察到IBA1表达水平显著高于各自的对照组。与PBS预处理的小鼠相比,中康酸预处理显著降低了海马两个区域中LPS诱导的IBA1荧光强度增加,而衣康酸则仅降低了DG中的IBA1荧光强度(图3E、F)。这些结果综合表明,衣康酸和中康酸能够有效防止LPS诱导的小胶质细胞反应性增加,其中衣康酸还具有降低小胶质细胞密度的功效。
为了阐明衣康酸和中康酸对小胶质细胞反应性的影响,作者研究了它们对激活标记物分化簇68(CD68)的影响。CD68是一种溶酶体蛋白,在炎症期间单核细胞中表达量增加,是一种有效的小胶质细胞激活标记物。首先,对CD68进行了免疫组织化学染色(CA1和DG的代表性图像分别显示在图4A、B中)。CD68荧光强度分析表明,无论是否进行衣康酸或中康酸预处理,注射LPS都不会对CA1亚区域产生显著影响(图4C)。然而,与注射了PBS预处理的小鼠相比,注射了LPS的预处理衣康酸显著降低了DG亚区的CD68强度(图4D),而中康酸仅显示出轻微下降。此外,荧光激活细胞分选(FACS)分析对全脑半球来源的单细胞悬液中的CD68进行了定量,并对其进行了CD11b、CD45和CD68染色。由于仅使用海马时样本量相对较少,且免疫组织化学在海马中可见的影响相对较小,因此FACS分析是在全脑匀浆中进行的。通过CD45中间表达和CD11b阳性表达来鉴定小胶质细胞,将其分为CD68+或CD68-细胞(图4E)。与生理盐水对照组相比,注射LPS后CD68+小胶质细胞的数量增加,但在预先注射衣康酸或中康酸的小鼠中则没有增加(图4F)。与预先注射PBS的小鼠相比,预先注射中康酸的小鼠CD68+小胶质细胞的百分比甚至略有下降,但无统计学意义(图4F)。
虽然小胶质细胞被认为是大脑的主要免疫细胞,但研究也强调了星形胶质细胞在免疫反应和调节中的重要作用,并且这两种胶质细胞似乎相互影响。为了应对神经炎症,星形胶质细胞会发生星形胶质细胞增生,其标志是胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达增加。为了研究用衣康酸和中康酸预处理是否能减轻LPS引发的星形胶质细胞增生,作者对海马内GFAP(一种在星形胶质细胞细胞质中发现的蛋白质)进行了免疫组织化学染色。与注射生理盐水的小鼠相比,注射LPS仅导致DG中GFAP+荧光强度略有增加,但这一变化在统计学上并不显著。与注射生理盐水的小鼠相比,注射PBS的小鼠CA1区域中GFAP荧光强度增加不明显。衣康酸预处理的小鼠也是如此,与注射生理盐水的小鼠相比,其GFAP荧光强度略有增加,但这一变化在统计学上并不显著。然而,注射LPS并未导致中康酸预处理小鼠的GFAP出现类似的小幅增加,甚至CA1区域的GFAP还略有下降。此外,比较所有注射LPS的小组,无论是否进行代谢物预处理,发现与注射LPS的小鼠相比,事先接触中康酸会导致DG中GFAP荧光强度显著降低。这些结果表明,中康酸预处理甚至能够降低LPS注射诱导的DG中GFAP荧光强度的轻微增加。
总体而言,这些结果表明,用衣康酸或中康酸对小鼠进行预处理能够减轻LPS诱导的小胶质细胞反应性增加,从而支持其抗炎特性。这与对星形胶质细胞反应性的影响较小有关。
实验结果3
衣康酸和中康酸预处理可以修复LPS引起的突触可塑性损伤
此前的研究表明,小鼠注射LPS后,长期增强(LTP)这种依赖活动的突触可塑性会受到损害,而LTP是这种可塑性的一种关键形式。因此,在证明了衣康酸和中康酸在大脑中的抗炎潜力后,作者旨在确定用衣康酸和中康酸进行预处理是否可以减轻LPS对海马网络功能的损害。因此,作者按照之前描述的方法在连接CA3和CA1的谢弗侧支通路进行了电生理记录。首先,作者使用输入-输出曲线分析了fEPSP斜率与刺激强度之间的关系。(图5A、E、I)。与注射生理盐水的小鼠相比,无论是否事先进行代谢物处理,注射LPS对小鼠的基底突触传递都没有显著影响。尽管如此,在100μA的刺激强度下,预先用中康酸处理并随后注射LPS的小鼠相对于对照组小鼠表现出略微下降的fEPSP斜率(图5I)。
随后,研究人员通过配对脉冲促进(PPF)测量了LPS注射对CA1神经元短期突触可塑性的潜在影响。无论是否接受代谢物预处理,LPS注射组和生理盐水注射组小鼠的配对脉冲促进(PPF)均未发现显著差异(图5B、F、J)。这些发现表明,注射LPS不会显著影响基础突触传递或突触前功能,而用衣康酸或中康酸进行预处理也不会对这些参数产生重大影响。
此外,在20分钟基线记录后,研究了TBS诱导的夏弗氏旁路CA3至CA1通路中的长期突触可塑性(图5C、G、K)。与之前的研究一致,与注射生理盐水的对照组相比,注射LPS的小鼠海马体在用PBS预处理后(图5C),LTP诱导明显受损,这一现象一直持续到LTP维持阶段(图5D)。值得注意的是,在用衣康酸或中康酸预处理的小鼠的急性海马切片上,LPS诱导的LTP缺陷并不明显(图4G、K)。此外,在用代谢产物预处理的小鼠上,也没有观察到LTP在维持阶段出现明显损害(图5H、L)。这些发现表明,用衣康酸和中康酸预处理可有效防止LPS诱导的LTP损伤,凸显了它们在维护学习和记忆的细胞基础方面的潜力。
除了评估神经元功能外,作者还评估了衣康酸和中康酸对LPS诱导的神经元结构变化的影响。为此,作者使用高尔基-考克斯染色法分析了海马神经元树突棘的密度(代表性图像见图5M)。结果表明,双LPS刺激既没有导致CA1区(图5N)也没有导致DG区(图5O)树突棘密度显著下降。然而,与各自的对照组相比,注射了LPS的小鼠在注射了PBS预处理后,CA1神经元的树突棘密度略有降低。相反,注射了LPS的小鼠在注射了衣康酸预处理后,CA1神经元的树突棘密度明显高于注射了生理盐水的小鼠(图5N)。此外,与注射生理盐水的小鼠相比,注射中康酸的小鼠在注射LPS后,CA1神经元的树突棘密度并未降低,DG神经元的树突棘密度实际上还增加了(图5O)。将注射生理盐水的小鼠与注射生理盐水并接受衣康酸或中康酸预处理的小鼠进行比较,结果表明,仅接受衣康酸预处理会导致CA1神经元树突棘密度降低,而接受PBS预处理和 预处理的小鼠相比(图5N)。此外,与接受Ita-LPS处理的小鼠相比,接受Mesa-LPS处理的小鼠在DG区域的树突棘密度增加(图5O)。这些结果表明,虽然LPS诱导LTP受损,但双重LPS刺激不会导致树突棘大量丢失。
实验结果4
衣康酸和中康酸可减轻小胶质细胞中LPS引起的炎症,但对星形胶质细胞无效
在用衣康酸或中康酸预处理的小鼠身上,作者证明了LPS诱导的神经炎症受到抑制,因此作者旨在确定这两种代谢产物的神经炎症调节作用。因此,作者从新生小鼠身上提取了初级小胶质细胞和初级星形胶质细胞,并用衣康酸或中康酸预处理,然后刺激LPS(图6A)。
用衣康酸或中康酸对原代小胶质细胞进行四小时预处理,结果显示细胞能够有效吸收培养基中的代谢产物(图6,B)。此外,当小胶质细胞额外接受LPS(10 ng/mL)处理时,与仅接受代谢产物处理且未接受LPS刺激的控制细胞相比,衣康酸和中康酸的细胞内代谢物水平增加(图6,B)。值得注意的是,用衣康酸预处理的小胶质细胞细胞内中康酸水平升高,但明显低于直接用中康酸处理的小胶质细胞(图6C)。然而,与未接受代谢物处理的细胞相比,细胞水平略有升高,但未达到统计学意义。只有当细胞用中康酸预处理时,细胞内中康酸水平才会增加。用中康酸预处理的微胶质细胞细胞内衣康酸水平并未增加(图6B),这表明衣康酸和中康酸在单方向上发生了转化,正如在巨噬细胞中报道的那样。考虑到有证据表明衣康酸可能会在小胶质细胞内转化为中康酸,并且根据He等人的发现,即中康酸是由外周巨噬细胞中的衣康酸产生的,作者接下来想知道这种转化是否也发生在原代小胶质细胞中。为了研究LPS刺激原代小胶质细胞中的代谢通量,作者用[U-13C]葡萄糖示踪剂处理这些细胞,然后分析下游代谢产物的质量同位素分布。如果中康酸源自衣康酸,其标记模式应该与衣康酸的标记模式相似,尽管程度较轻,正如He及其同事在外周巨噬细胞研究中证实的那样。在24小时LPS刺激后,发现衣康酸的M1质量同位素峰最高,这是由合成顺式-衣康酸直接产生的分子,而第二高的峰是M3同位素峰,这是由TCA循环第二轮合成的顺式-衣康酸产生的。中康酸也呈现出类似的富集模式,但中康酸的同位素丰度略低于衣康酸,这与He等人的研究结果一致。
He等人进一步证明,在周边巨噬细胞中,中康酸的合成也可以通过TCA循环和衣康酸从谷氨酰胺而来。为了在小胶质细胞中验证这一点,将[U-13C]谷氨酰胺示踪剂应用于LPS刺激的小胶质细胞。与周边巨噬细胞类似,LPS处理的小胶质细胞显示出中康酸和衣康酸的M4同位素的高丰度。中康酸和衣康酸的质量同位素分布非常相似,但中康酸的含量较低。这些发现表明,中康酸和衣康酸是通过相同的途径生成的,但中康酸比衣康酸生成得晚,这一点在之前的外周巨噬细胞研究中已有描述。
为了验证体内注射LPS后小胶质细胞反应性降低是由于衣康酸或中康酸对小胶质细胞的直接影响,作者继续测量了在预处理和未预处理的情况下,LPS刺激原代小胶质细胞后促炎细胞因子的释放。与未经处理的对照组相比,无论小胶质细胞是否经过衣康酸或中康酸预处理,LPS刺激都会导致原代小胶质细胞培养上清液中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的释放增加(图6)。值得注意的是,两种代谢物的预处理均能减少促炎细胞因子的释放。具体来说,中康酸预处理细胞在IL-6和TNF-α方面的降幅显著,而衣康酸仅能显著降低IL-6水平(图6)。IL-1β和IL-6的基因表达分析结果证实了这些结果。这两种代谢产物均显著降低了LPS诱导的IL-1β和IL-6的表达(图6)。
考虑到Cordes等人发现衣康酸治疗会影响星形胶质细胞的代谢程序,作者接下来研究了用衣康酸或中康酸预处理是否也能减少星形胶质细胞的炎症反应。为此,作者用衣康酸或中康酸预处理原代星形胶质细胞,类似于原代小胶质细胞,然后暴露于LPS(图6H-K)。与未受刺激的对照组相比,无论是否用衣康酸和中康酸进行预处理,受LPS刺激的星形胶质细胞都会向上清液中释放大量的IL-6和TNF-α(图6)。值得注意的是,在LPS刺激后,用衣康酸和中康酸预处理的星形胶质细胞培养上清液中这些细胞因子的水平并未降低,甚至IL-6在衣康酸和中康酸的作用下还出现了增加(图6H)。同样,基因表达分析显示,两种代谢物预处理后,LPS刺激的IL-1β和IL-6表达并未降低(图6)。
总之,衣康酸和中康酸均减轻了LPS刺激小胶质细胞的体外炎症反应,但对星形胶质细胞无效,因此表明它们在体内产生的有益作用归因于小胶质细胞直接免疫调节。
实验结果5
Irg1-缺乏和内源性衣康酸合成缺乏对LPS诱导的神经炎症的影响
考虑到衣康酸和中康酸在免疫反应中的基本作用,作者旨在研究Irg1 −/−小鼠中Irg1缺陷导致的内源性衣康酸缺乏如何影响脑内LPS诱导的神经炎症反应。先前的研究表明,内源性衣康酸在抑制炎症反应方面发挥着关键作用,与能够产生衣康酸的WT小鼠相比,Irg1−/−小鼠的疾病结果更加严重。在LPS诱导的脓毒症休克模型中,Irg1−/−小鼠的症状比WT小鼠更严重。Kuo等人发现,Irg1基因敲除小鼠在脑卒中模型中脑损伤明显加重。与野生型小鼠相比,这些损伤表现为脑梗死面积更大、血脑屏障破坏更严重、小胶质细胞活化程度更高。然而,Irg1-缺陷对脑免疫的影响仍知之甚少。为了评估IRG1的功能及其在LPS诱导的神经炎症中与内源性衣康酸和中康酸的产生,野生型和Irg1基因敲除小鼠均接受了两次腹腔注射LPS(0.5 mg/kg,间隔24小时)或生理盐水作为对照(图7A)。随后,在第二次注射LPS后3小时,对两种基因型的小鼠的大脑炎症反应进行了分析比较。注射后24小时,Irg1基因敲除小鼠和野生型小鼠的体重均下降,而注射生理盐水的小鼠则没有出现体重下降,这表明基因型没有显著影响(图7B)。为了研究IRG1缺失是否会影响LPS诱导的炎症反应,作者使用ELISA法测量了血清和脑匀浆中的细胞因子水平(图7C-F)。正如预期的那样,双LPS注射诱导了IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10在WT小鼠中的分泌,而在Irg1基因敲除小鼠中分泌进一步增加(图7)。值得注意的是,虽然Irg1基因敲除小鼠在LPS刺激后血清中的促炎介质水平略高,但与注射LPS的野生型小鼠相比,这些差异并不具有统计学意义。
全脑匀浆中细胞因子水平的分析表明,与各自的生理盐水对照组相比,LPS注射显著提高了两种基因型小鼠的细胞因子水平(图7)。
值得注意的是,与野生型小鼠相比,Irg1基因敲除小鼠在LPS诱导下分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α显著增加。综上所述,作者的数据表明,缺乏内源性衣康酸的产生仅对LPS引发的炎症细胞因子反应有轻微影响。
实验结果6
衣康酸内源性合成的变化对脂多糖诱导的小胶质细胞反应没有显著影响
本研究中早先描述的体外实验,使用WT小胶质细胞原代培养物,先用衣康酸处理,然后用LPS刺激,结果显示炎症表型减少(图6)。因此,作者研究了IRG1缺失及其相应的衣康酸缺乏是否会影响LPS诱导的海马小胶质细胞反应(图8A、B)。与接受生理盐水的Irg1基因敲除小鼠相比,LPS注射导致Irg1基因敲除小鼠海马CA1区和DG区IBA1+细胞数量显著增加(图8)。相反,与注射生理盐水的WT小鼠相比,注射LPS的WT小鼠仅表现出微胶质细胞密度略有增加。值得注意的是,对两种基因型注射LPS的小鼠进行比较后发现,Irg1基因敲除小鼠CA1内的微胶质细胞密度显著增加。此外,在注射LPS后,在WT小鼠的CA1和DG中观察到IBA1荧光强度显著增加(图8)。相比之下,Irg1基因敲除小鼠在CA1区域的IBA1荧光显著增强,在DG区域也有显著但并不显著的增加(图8)。虽然LPS给药在小鼠中诱导了炎症性小胶质细胞表型,但由于Irg1缺失导致内源性衣康酸产生缺失,并未显著影响这种反应。然而,通过免疫荧光对小胶质细胞激活标记物CD68的分析表明,与注射生理盐水的小鼠相比,注射LPS的小鼠海马亚区的CD68荧光强度没有显著升高,无论是WT小鼠还是Irg1敲除小鼠。仅在WT小鼠的CA1亚区域中,注射LPS后观察到CD68水平略有上升的趋势。此外,通过GFAP染色对免疫标记的星形胶质细胞进行定量分析,发现无论注射LPS还是生理盐水,两种基因型小鼠的GFAP荧光强度均无显著升高。在注射LPS后,仅观察到WT小鼠海马CA1和DG亚区域以及Irg1基因敲除小鼠CA1亚区域的GFAP表达略有升高。值得注意的是,尽管LPS注射会导致海马内小胶质细胞的密度和反应性增加,但IRG1缺失和由此导致的内源性衣康酸生成不足并未显著影响LPS引发的小胶质细胞密度和反应性增加。
实验结果7
WT和Irg1 基因敲除小鼠均表现出LPS诱导的突触传递和可塑性受损
为了更详细地研究Irg1-缺失在LPS诱导的神经炎症中的作用,作者研究了Irg1-缺失及其相应的内源性衣康酸生成缺失对活动依赖性突触可塑性的影响。具体来说,作者评估了野生型小鼠和Irg1基因敲除小鼠在LPS诱导的突触可塑性损伤程度上的差异。为此,作者进行了电生理评估(图9)。对野生型小鼠的基底突触传递进行分析,发现注射LPS的小鼠和注射生理盐水的小鼠之间没有显著差异(图9A、E)。然而,在刺激强度为400、500、600和700μA时,与注射生理盐水的Irg1基因敲除小鼠相比,注射LPS的Irg1基因敲除小鼠的fEPSP斜率降低,表明突触传递明显受损(图9E)。随后,作者评估了沙费尔侧支-CA1突触PPF的短期突触可塑性(图9B、F)。在WT或Irg1基因敲除小鼠中,两种处理方法之间在PPF上没有观察到显著差异,这表明两种基因型的小鼠在注射LPS后,突触前功能基本不受影响。最后,作者检查了长期活动依赖性突触可塑性(图9C、D、G、H)。与之前一样,在20分钟的稳定基线记录后,使用TBS在Schaffer collateral CA3到CA1通路诱导LTP(图9C、G)。作者的研究结果表明,与注射生理盐水的对照组相比,无论基因型如何,注射LPS后小鼠海马中的LTP都明显受损。在LPS注射后LTP的维持阶段,这种损伤扩展到两种基因型(图9)。
总体而言,作者的研究结果表明,Irg1基因缺失和内源性衣康酸的缺失不会显著影响LPS诱导的海马体内活动依赖性突触可塑性的损伤。
