Chestnut Studying
摘要
The NLRP3 inflammasome is a multiprotein complex that plays a vital role in the innate immune system in response to microbial infections and endogenous danger signals. Aberrant activation of the NLRP3 inflammasome is implicated in a spectrum of inflammatory and autoimmune diseases, emphasizing the necessity for precise regulation of the NLRP3 inflammasome to maintain immune homeostasis. The protein level of NLRP3 is a limiting step for inflammasome activation, which must be tightly controlled to avoid detrimental consequences. Here, we demonstrate that ABHD8, a member of the α/β-hydrolase domain-containing (ABHD) family, interacts with NLRP3 and promotes its degradation through the chaperone-mediated autophagy (CMA) pathway. ABHD8 acts as a scaffold to recruit palmitoyltransferase ZDHHC12 to NLRP3 for its palmitoylation as well as subsequent CMA-mediated degradation. Notably, ABHD8 deficiency results in the stabilization of NLRP3 protein and promotes NLRP3 inflammasome activation. We further confirm that ABHD8 overexpression ameliorates LPS- or alum-triggered NLRP3 inflammasome activation in vivo. Interestingly, the nucleocapsid (N) protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) impairs the ABHD8-NLRP3 association, resulting in an elevation in NLRP3 protein level and excessive inflammasome activation. These findings demonstrate that ABHD8 May represent a potential therapeutic target in conditions associated with NLRP3 inflammasome dysregulation.
NLRP3 炎性体是一种多蛋白复合物，在先天性免疫系统中对微生物感染和内源性危险信号起着至关重要的作用。NLRP3 炎症小体的异常激活与一系列炎症和自身免疫性疾病有关，这强调了精确调节 NLRP3 炎症小体以维持免疫平衡的必要性。NLRP3 蛋白水平是炎性体激活的一个限制步骤，必须加以严格控制以避免有害后果。在这里，我们证明了α/β-含水解酶结构域（ABHD）家族成员ABHD8与NLRP3相互作用，并通过伴侣介导的自噬（CMA）途径促进其降解。ABHD8 是一种支架，可将棕榈酰基转移酶 ZDHHC12 招募到 NLRP3 上，使其发生棕榈酰化，并随后通过 CMA 介导降解。值得注意的是，ABHD8 缺乏会导致 NLRP3 蛋白的稳定，并促进 NLRP3 炎性体的激活。我们进一步证实，ABHD8的过表达可改善体内LPS或明矾诱导的NLRP3炎性体活化。有趣的是，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的核壳（N）蛋白会损害ABHD8与NLRP3的结合，导致NLRP3蛋白水平升高和炎性体过度激活。这些研究结果表明，在与 NLRP3 炎症小体失调相关的疾病中，ABHD8 可能是一个潜在的治疗靶点。
实验结果1
ABHD8 与 NLRP3 相互作用
为研究 ABHD8 可能参与 NLRP3 炎症小体活化的调控，进行了免疫沉淀（IP）试验（图 1A）。这一发现得到了共聚焦分析和佛斯特/荧光共振能量转移（FRET）测定的进一步支持，它们证明了 NLRP3 与 ABHD8 之间的紧密联系（图 1B、C）。此外，NLRP3和ABHD8之间的关联在NLRP3炎性体诱导剂如ATP、尼日利亚菌素、硅胶或明矾的作用下显著增强（图1D,F）。进一步研究发现，NLRP3 的 NOD（核苷酸结合寡聚化结构域）和 LRR（富亮氨酸重复）结构域参与了与 ABHD8 的相互作用（图 1F,G）。此外，还观察到 ABHD8 不与 PYCARD/ASC、pro-CASP1（图 1H）或其他受体如 NLRP1、AIM2 或 NLRC4（图 1I）相互作用。综上所述，这些发现表明 ABHD8 与 NLRP3 之间存在特异性相互作用。
实验结果2
ABHD8 可特异性抑制 NLRP3 炎症小体的激活
为了探索ABHD8在NLRP3炎症小体激活过程中的潜在作用，作者设计了两种靶向ABHD8的小干扰RNA（siRNA）来下调其表达。作者观察到，在 NLRP3 炎症小体诱导剂（而非 AIM2 炎症小体激活剂 poly(dA:dT)）的作用下，ABHD8 的敲除显著增强了 CASP1 的激活、IL1B 的成熟和产生以及细胞的死亡。为了证实这些发现，作者通过 CRISPR-Cas9 技术构建了两个 ABHD8 基因敲除（KO）的 THP1 细胞。一致的是，在 ABHD8 缺失的 THP-1 衍生巨噬细胞中，ATP、尼日利亚菌素、硅胶或明矾诱导的 NLRP3 炎性体活化显著增加，但聚(dA:dT)诱导的 AIM2 炎性体活化却没有增加（图 2A,B）。同样，在骨髓衍生巨噬细胞（BMDMs）中转染 Abhd8 siRNA 会导致 NLPR3 炎性体活化的明显和特异性增强（图 2C、D）。与此相反，ABHD8 的缺乏对依赖于炎性体的促炎性细胞因子 IL6 或 TNF/TNF-α 的产生没有抑制作用。综上所述，这些数据表明 ABHD8 能特异性地减弱 NLRP3 炎性体的激活。
实验结果3
ABHD8 以溶酶体依赖方式介导 NLRP3 降解
为了剖析 ABHD8 通过与 NLRP3 相互作用在炎性体激活中的抑制功能，作者研究了 ABHD8 对 NLRP3 稳定性的影响。作者的研究结果表明，ABHD8 的用量增加会显著降低 NLRP3 的蛋白水平，而不会影响 NLRP3 mRNA 的丰度（图 3A-C）。此外，通过环己亚胺（CHX）追逐试验，作者证实 ABHD8 基因缺失会显著降低内源性 NLRP3 的降解率，但不会降低 PYCARD 或 pro-CASP1 的降解率。这些数据表明，ABHD8 通过促进 NLRP3 降解来降低其蛋白水平。
在真核细胞中，泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统是负责蛋白质降解的主要质量控制系统。为了确定哪种降解系统实质上参与了 ABHD8 介导的 NLRP3 降解，作者采用了多种相关抑制剂，发现溶酶体抑制剂氯化铵（NH4 Cl）和氯喹（CQ）会阻碍 ABHD8 介导的 NLRP3 降解，但蛋白酶体抑制剂卡非佐米（CFZ）或巨自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤（3-MA）不会。此外，溶酶体抑制剂处理可逆转 ABHD8 缺失对 THP-1 衍生巨噬细胞或 BMDMs 中 NLRP3 蛋白水平的影响，而蛋白酶体抑制剂或巨自噬抑制剂没有相同的效果（图 3H-K）。此外，在巨自噬功能受损的 BECN1- 或 ATG5 缺陷 HEK293T 细胞中，ABHD8 仍能促进 NLRP3 降解（图 3L,M）。总之，这些结果表明 ABHD8 介导的 NLRP3 降解主要通过溶酶体途径，而不是蛋白酶体或大自噬途径。
实验结果4
ABHD8 通过 CMA 途径促进 NLRP3 降解
CMA 是一种依赖于溶酶体的选择性降解途径，以含有类似于 Lys-Phe-Glu-Arg-Gln (KFERQ) 主题的底物为目标。这些底物被 HSPA8/HSC70（热休克蛋白家族 A（Hsp70）成员 8）识别，随后 HSPA8/HSC70 通过与 LAMP2A（溶酶体相关膜蛋白 2A）相互作用，将底物送至溶酶体降解。先前的研究表明，NLRP3 是 CMA 的底物。
因此，作者研究了 ABHD8 介导的 NLRP3 降解是否通过 CMA 途径进行。作者观察到 ABHD8 显著促进了 NLRP3 与 HSPA8 或 LAMP2A 的结合。作者随后证实，在缺乏 ABHD8 的 THP1 衍生巨噬细胞中，NLRP3-HSPA8-LAMP2A 的相互作用受到了强烈的损害（图 4A、B）。此外，敲除 HSPA8 或 LAMP2A 可阻止 ABHD8 介导的 NLRP3 在 HEK293T 细胞中降解。与此相一致，作者发现在 ABHD8-KO THP-1 衍生巨噬细胞中，NLRP3 蛋白水平上调，而敲除 HSPA8 或 LAMP2A 可逆转 ABHD8 缺乏对 THP-1 衍生巨噬细胞中 NLRP3 蛋白水平的影响（图 4C-F）。总之，这些结果表明 ABHD8 通过 CMA 途径促进 NLRP3 降解。
实验结果5
ABHD8 招募 ZDHHC12 对 NLRP3 进行棕榈酰化以促进其降解
由于 NLRP3 的棕榈酰化是 NLRP3 通过 CMA 途径降解的关键，且 ABHD 家族的几个成员（如 ABHD10 和 ABHD17）与蛋白质棕榈酰化的调控有关，作者推测 ABHD8 可能会影响 NLRP3 的棕榈酰化水平。作者观察到 ABHD8 的过表达增强了 NLRP3 的棕榈酰化水平（图 5A,B），而 ABHD8 的缺失则保留了这一效应（图 5C,D）。值得注意的是，ABHD8 缺乏酰基转移酶活性基序（HXXXXD），因此作者假设 ABHD8 作为支架蛋白招募其他棕榈酰基转移酶使 NLRP3 棕榈酰化。由于作者已经证明 ZDHHC12 是炎性体激活后期介导 NLRP3 棕榈酰化的主要棕榈酰基转移酶，因此作者试图研究 ABHD8 是否通过招募 ZDHHC12 来介导 NLRP3 棕榈酰化和降解的增强。通过 IP 检测，作者确定了 ZDHHC12 与 ABHD8 之间的相互作用（图 5E）。值得注意的是，ABHD8 基因缺失会显著削弱 NLRP3-ZDHHC12 的相互作用（图 5F,G）。同样，过表达 ZDHHC12 可促进 NLRP3 的棕榈酰化和降解，而 ABHD8 的缺失则可消除这些效应，这证实 ABHD8 对 ZDHHC12 介导的 NLRP3 棕榈酰化和降解至关重要（图 5H-K）。同时，ZDHHC12的缺乏也会削弱ABHD8介导的NLRP3棕榈酰化和降解的促进作用（图5L-O）。综上所述，这些结果表明，ABHD8 在 ZDHHC12 招募到 NLRP3，随后促进 NLRP3 棕榈酰化和降解的过程中发挥了重要作用。
实验结果6
ABHD8 负向调节 LPS 或明矾诱导的体内炎症
为了进一步阐明ABHD8的生物学意义，作者通过注射表达质粒建立了ABHD8过表达模型。利用腹腔注射大肠杆菌 LPS 诱导的内毒素休克模型，作者观察到 ABHD8 的过表达显著抑制了 LPS 挑战诱导的 IL1B 分泌，但没有抑制血浆中 IL6 或 TNF/TNF-α 的分泌（图 6A）。此外，与对照组小鼠相比，ABHD8过表达小鼠的NLRP3蛋白水平和肺组织损伤显著降低（图6B,C）。此外，与对照组小鼠相比，明矾挑战明显减少了 ABHD8 过表达小鼠腹腔灌洗液中 IL1B 的产生，但没有减少 IL6 或 TNF/TNF-α 的产生（图 6D）。而在 ABHD8 过表达小鼠的腹腔渗出液细胞中，NLRP3 蛋白水平显著下降（图 6E）。这些结果表明，ABHD8 在体内抑制 NLRP3 炎性体活化方面起着至关重要的作用。
实验结果7
SARS-CoV-2 N 蛋白损害 NLRP3-ABHD8 关联
SARS-CoV-2感染诱导的炎性体过度激活与冠状病毒病2019（COVID-19）的严重程度有关，给公共卫生问题和社会发展带来了巨大危害。因此，揭示SARS-CoV-2的发病机制是一个亟待解决的重要科学难题。
正如之前所报道的，作者证实SARS-CoV-2的核壳蛋白（N）可以促进NLRP3炎症小体的激活（图7A）。值得注意的是，作者观察到 N 的增加会提高 NLRP3 的蛋白水平（图 7B）。因此，除了已知的促进 NLRP3 与 PYCARD 之间结合的作用外，作者的发现还为 N 蛋白可能与其他分子相互作用影响 NLRP3 的稳定性这一假设提供了支持。有趣的是，作者发现NLRP3和ABHD8都与N蛋白相互作用（图7C,D），而且N蛋白可以挽救ABHD8介导的NLRP3降解（图7E），这表明N蛋白可能会损害NLRP3-ABHD8的相互作用。接下来作者发现，N蛋白明显降低了NLRP3与ABHD8之间的关联（图7E）。此外，当 ABHD8 被敲除时，NLRP3 蛋白水平明显升高，但只有在 N 蛋白缺失的情况下才能观察到这种效应（图 7F）。相应地，N蛋白不能进一步显著促进ABHD8缺陷细胞中IL1B的产生（图7G）。因此，结合之前的研究结果和作者的观察，可以得出结论：SARS-CoV-2的N蛋白破坏了NLRP3-ABHD8的关联，从而增强了NLRP3的稳定性，最终导致炎性体激活增加。
