Chestnut Studying
摘要
Impaired cerebral glucose metabolism is a pathologic feature of Alzheimer’s disease (AD), with recent proteomic studies highlighting disrupted glial metabolism in AD. We report that inhibition of indoleamine-2,3-dioxygenase 1 (IDO1), which metabolizes tryptophan to kynurenine (KYN), rescues hippocampal memory function in mouse preclinical models of AD by restoring astrocyte metabolism. Activation of astrocytic IDO1 by amyloid β and tau oligomers increases KYN and suppresses glycolysis in an aryl hydrocarbon receptor–dependent manner. In amyloid and tau models, IDO1 inhibition improves hippocampal glucose metabolism and rescues hippocampal long-term potentiation in a monocarboxylate transporter–dependent manner. In astrocytic and neuronal cocultures from AD subjects, IDO1 inhibition improved astrocytic production of lactate and uptake by neurons. Thus, IDO1 inhibitors presently developed for cancer might be repurposed for treatment of AD.
脑葡萄糖代谢受损是阿尔茨海默病(AD)的病理特征,最近的蛋白质组学研究强调了AD中神经胶质代谢的紊乱。我们报告了抑制吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)的情况,该酶将色氨酸代谢为犬尿氨酸(KYN),通过恢复星形胶质细胞代谢,在AD小鼠临床前模型中挽救了海马记忆功能。淀粉样β和tau低聚物激活星形胶质细胞IDO1,增加犬尿氨酸,抑制糖酵解,这种作用依赖于芳基烃受体。在淀粉样蛋白和tau蛋白模型中,IDO1抑制剂能够改善海马葡萄糖代谢,并恢复海马长时程增强作用,其作用机制与单羧酸转运体有关。在AD患者的星形胶质细胞和神经元共培养物中,IDO1抑制剂能够改善星形胶质细胞乳酸的产生和神经元的摄取。因此,目前用于治疗癌症的IDO1抑制剂可能被重新用于治疗AD。
实验结果1
IDO1抑制剂可恢复星形胶质细胞对淀粉样蛋白肽和tau寡聚体的生物能量反应
作者研究了IDO1活性是否会影响星形胶质细胞对42残基Aβ(Aβ42)低聚物(oAβ)和tau低聚物(oTau)的反应,这两种物质是阿尔茨海默病(AD)中两种主要的神经毒性病理。小鼠原代星形胶质细胞在接触oAβ、oTau以及oAβ和oTau的组合(oAβ+oTau)后,IDO1 mRNA表达显著增加,IDO1依赖性KYN生成显著增加(图1,A至D)。作者还观察到,在人类iPSC衍生的星形胶质细胞(iAstrocytes)中,IDO1活化和KYN的产生是由AD病理引起的(图1E),这表明小鼠和人类星形胶质细胞对Aβ和tau寡聚体具有保守的IDO1反应。IDO1介导的KYN生成可通过预先使用选择性IDO1抑制剂PF06840003(PF068)来抑制。作者给小鼠和人类星形胶质细胞同时注射PF068和13C标记的TRP,并追踪KYN;作者发现,小鼠和人类星形胶质细胞中TRP衍生的KYN浓度在oAβ+oTau的作用下升高,证实了oAβ+oTau通过激活IDO1来增加KYN(图1D)。
然后,作者研究了IDO1在星形胶质细胞中激活的下游效应。KYN与芳香受体结合并触发芳香受体向细胞核的转移。在细胞核中,芳香受体与芳香受体核转运蛋白(ARNT)形成二聚体,以调节转录反应。作者测试了用oAβ+oTau刺激星形胶质细胞是否诱导IDO1依赖性AhR:ARNT结合。对oAβ+oTau的反应中,AhR和ARNT的共免疫沉淀增加,这种增加被PF068抑制(图1F),表明oAβ+oTau激活IDO1并诱导AhR:ARNT结合。使用免疫组织化学检测AhR的验证证实了IDO1促进AhR向星形细胞核的转移(图1G)。
在细胞核中,ARNT的浓度是有限的,因为ARNT也可以与低氧诱导因子1-α(HIF1α)结合,后者是一种转录因子,可调节糖酵解基因的转录并增加乳酸的产生。为了评估星形胶质细胞中AhR-ARNT与HIF1α-ARNT基因的表达,作者研究了小鼠星形胶质细胞在PF068孵育条件下或未经孵育条件下对oAβ+oTau刺激的AhR与HIF1α转录反应。正如预期的那样,星形胶质细胞AhR基因转录在oAβ+oTau刺激后增加,但在IDO1抑制下减少(图1H)。相反,IDO1抑制增加了静止星形胶质细胞中HIF1α调节的糖酵解基因表达,并逆转了oAβ+oTau刺激星形胶质细胞中HIF1α调节的转录的抑制(图1I)。事实上,IDO1抑制剂恢复了oAβ+oTau刺激下星形胶质细胞中的糖酵解中间产物和乳酸、糖酵解(以细胞外酸化率(ECAR)衡量)和线粒体氧化磷酸化(以基础呼吸衡量)(图1,J至L)。使用小干扰RNA(siRNA)来敲除IDO1的表达,从而验证IDO1抑制对星形胶质细胞生物能量代谢的影响。IDO1的敲除与IDO1的药理抑制具有相同的效应,并恢复了基底呼吸、ECAR和糖酵解中间产物(包括乳酸)在星形胶质细胞中的水平,这些细胞受到oAβ+oTau的刺激(图1,M和N)。相反,在小鼠星形胶质细胞中应用外源KYN可导致基础呼吸和ECAR呈剂量依赖性降低,并抑制在oAβ+oTau刺激的星形胶质细胞中产生糖酵解和TCA中间产物(图2,A至C)。综上所述,这些数据表明,星形胶质细胞的葡萄糖代谢通过IDO1依赖机制被oAβ+oTau破坏。
为了进一步证实IDO1和AhR在抑制星形胶质细胞对oAβ+oTau的糖酵解反应中的作用,作者用短发夹RNA(shRNA)转染星形胶质细胞中的AhR。定量免疫印迹证实了AhR蛋白浓度的降低,Seahorse生物能量分析显示,AhR的敲除阻止了oAβ+oTau引起的星形胶质细胞葡萄糖代谢的缺陷(图2D和E)。为了验证AhR敲除是否能够恢复葡萄糖代谢,作者进行了13C-葡萄糖同位素追踪,并观察到在oAβ+oTau刺激下,葡萄糖掺入下游糖酵解中间体的过程在AhR缺陷星形胶质细胞中得到了恢复(图2F)。激活的星形胶质细胞的免疫因子分析显示IDO1抑制没有效果。因此,KYN依赖性AhR信号抑制暴露于oAβ+oTau的星形胶质细胞的葡萄糖代谢。这些数据表明,IDO1活性增加可能会对AD中星形胶质细胞对神经元的代谢支持产生负面影响。
实验结果2
IDO1抑制剂可恢复淀粉样蛋白AD病理模型中的长期记忆
星形胶质细胞是大脑中糖原的主要储存库,糖原可迅速分解为乳酸,为神经元线粒体呼吸和突触活动提供能量。学习和记忆是由星形胶质细胞产生的乳酸促成的。鉴于星形胶质细胞乳酸在支持神经元代谢方面的作用,作者假设抑制星形胶质细胞中的IDO1可能会改善AD病理模型的海马记忆缺陷和突触可塑性。
作者首先证实,与星形胶质细胞相比,原代小鼠神经元中不存在IDO1活性。PF068抑制IDO1后,星形胶质细胞而非神经元的糖酵解和线粒体呼吸出现剂量反应性增加(图2,G和H)。然后,作者评估了脑渗透性IDO1抑制剂PF068在6个月大的野生型(WT)小鼠体内对海马KYN和乳酸浓度的影响,给药4小时后[口服给药,剂量为0至15 mg/kg体重(mg/kg)]。IDO1抑制剂以剂量依赖性方式减少海马KYN并增加乳酸(图2I)。然后,作者测试了PF068在两种积累错误折叠的Aβ42肽的淀粉样前体蛋白(APP)突变小鼠模型中的效果:APPSwe-PS1∆E9(APP/PS1)和5XFAD模型。在两种突变APP模型中,海马KYN均增加,而PF068(口服15 mg/kg,持续1个月)可阻断这种增加,表明IDO1激活与体内Aβ42积累有关(图2、J和L)。两种模型中海马乳酸的减少均与IDO1相关(图2,K和M),表明IDO1和KYN的产生在调节淀粉样蛋白积累小鼠模型的海马葡萄糖代谢中发挥作用。
然后,作者测试了IDO1活性是否会导致在APP突变体模型中观察到的空间记忆和突触缺陷。在巴恩斯迷宫和新的物体识别(NOR)任务中,IDO1抑制剂PF068逆转了APP/PS1小鼠海马依赖性空间记忆的缺陷(图3,A至C)。作者还通过测量小鼠脑切片CA3至CA1 Schaffer collateral通路的长时程增强(LTP)来评估海马突触的可塑性。与行为学发现一致,IDO1抑制逆转了APP/PS1小鼠脑切片中的LTP缺陷,LTP是学习和记忆的细胞指标(图3D)。通过将APP/PS1小鼠与Ido1−/−小鼠连续杂交,在APP/PS1小鼠中实现了IDO1的基因缺失;在莫里斯水迷宫实验中,IDO1缺失也恢复了海马的空间记忆(图3E)。与该模型中的药理抑制作用一致(图2K),IDO1的基因缺失也减少了KYN,并相应增加了海马中的乳酸(图3,F和G)。在第二个淀粉样蛋白沉积模型5XFAD模型中,空间记忆和海马可塑性也得到了恢复(图3,H至J)。对于这两个模型,IDO1抑制剂对脑内Aβ40和Aβ42的总含量没有影响,这是通过胍提取可溶性和不可溶性Aβ肽测定的。然而,在5XFAD小鼠中,通过药物抑制后,硫黄素S(ThioS)阳性致密核心斑块和6E10阳性弥漫性斑块中的Aβ肽积累减少(图3,K和L),表明对淀粉样蛋白的聚集状态有影响。突触蛋白BACE1的积累会分解APP,被认为是营养不良神经突起的标志;在5XFAD小鼠中,IDO1抑制后BACE1的含量也减少了,这与观察到的行为改善一致。星形胶质细胞的激活(通过神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的积分密度测量)不受IDO1抑制的影响。
然后,作者研究了5XFAD小鼠海马中因抑制KYN-AhR信号传导而产生的转录变化。根据作者之前的数据,IDO1存在于星形胶质细胞中,而不存在于神经元中,作者间接评估了IDO1抑制对体内星形胶质细胞的影响,并研究了5-6个月大的5XFAD小鼠海马中AhR和HIF1 α转录反应(图3,M和N)。IDO1抑制剂可减少AhR调节的转录物,并增加参与糖酵解代谢的多种HIF1α转录物(包括Ldha、Aldoa、Eno1、Pdk1、Tip1、Pkm、Pgam1和Pfkfb3),表明IDO1抑制剂可通过转录调控体内葡萄糖代谢。
实验结果3
IDO1抑制剂可逆转阿尔茨海默病病理学tau模型中的代谢和海马记忆变化
除了脑内淀粉样蛋白聚集(被认为对AD的发展是必要的,但还不够充分)外,AD的第二大病理学特征是脑内多个区域中错误折叠的tau蛋白的聚集和扩散。因此,作者测试了IDO1抑制剂在PS19(P301S)tau AD病理模型中的效果,该模型表达人微管相关蛋白tau(MAPT)的突变形式。海马KYN增加,而乳酸减少,与APP模型中观察到的变化相似(图4,A和B)。此外,IDO1抑制剂在PS19tau小鼠中恢复了巴恩斯迷宫和NOR(图4,C和D)任务中的空间记忆缺陷,并恢复了脑片中的海马LTP(图4E)。与5XFAD模型类似,在PS19模型中,IDO1抑制使海马中AhR和HIF1α调节的转录本增加恢复正常(图4F)。尽管未发现星形胶质细胞活化方面的明显变化,但对海马可溶性和不可溶性tau(总量)以及磷酸化tau异构体(Thr181和Thr231磷酸化tau)的分析表明,IDO1抑制可降低可溶性和不可溶性tau部分中的Thr231磷酸化tau以及不可溶性部分中的Thr181磷酸化tau(图4,G至J)。在淀粉样蛋白和tau模型中,海马功能的恢复和病理的缓解表明,Aβ和tau共同引发IDO1驱动的代谢缺陷。
实验结果4
IDO1在淀粉样蛋白和tau病理模型中扰乱海马葡萄糖代谢
为了更好地理解IDO1抑制剂有益作用背后的代谢基础,作者对所有三个临床前模型的海马进行了代谢组学分析。作者发现了APP/PS1、5XFAD和PS19模型中13种共同的代谢产物,这些代谢产物表现出葡萄糖代谢的富集(图5,A和B)。在淀粉样蛋白和Tau蛋白病理中,IDO1抑制剂将多种糖酵解和TCA循环中间产物恢复到野生型浓度,这与中心代谢物缺乏状态的恢复一致(图5,C至F和H至J)。与APP/PS1同窝小鼠相比,APP/PS1;Ido1基因敲除小鼠的海马葡萄糖代谢也得到了恢复(图5G)。在雄性和雌性动物中观察到了类似的效果。综上所述,这些数据表明,IDO1抑制——在淀粉样蛋白和tau病理中——恢复了海马葡萄糖代谢、空间记忆和突触可塑性。
为了进一步证实IDO1抑制剂能够恢复体内活跃的葡萄糖代谢,作者采用正交法,以生理速度和浓度注入同位素标记的13C-葡萄糖,使大多数脑葡萄糖来自注入的葡萄糖,通过颈动脉注入APP/PS1和PS19小鼠,分别用载体或IDO1抑制剂处理。同位素葡萄糖输注速度足够快,使大部分脑葡萄糖均匀地被13C标记(M+6),从而可以测量13C标记葡萄糖在海马糖酵解和TCA代谢物中的掺入情况。IDO1抑制剂使海马中间代谢产物、乳酸和TCA代谢产物标记恢复到控制水平,从而控制淀粉样蛋白和tau蛋白病理(图6,A和B)。为了直观地确认这些变化,作者进行了基质辅助激光解吸电离(MALDI)成像。对未用药和服用PF068的老鼠进行成像,结果显示,在APP/PS1淀粉样蛋白和PS19 tau模型中,葡萄糖转化为糖酵解(果糖1,6-二磷酸和乳酸)和TCA(苹果酸)中间体的过程均有所减缓。在两种病理中,IDO1抑制剂PF068均能逆转这种减缓趋势(图6,C至F)。
实验结果5
IDO1抑制剂可恢复乳酸依赖性LTP
体外实验数据表明IDO1在调节星形胶质细胞乳酸生成方面发挥着作用,基于此,作者推测,在PF068治疗过的AD小鼠中,海马LTP的恢复可能依赖于星形胶质细胞产生的乳酸,乳酸随后被转运至神经元。因此,作者给接受过载体或IDO1抑制剂治疗的AD小鼠海马切片注射了单羧酸转运体MCT1和MCT2抑制剂AR-C155858。MCT1/2的抑制会破坏乳酸从星形胶质细胞向神经元的转移。在所有三种AD模型中,MCT1/2的抑制均阻止了PF068对海马LTP的救援(图7,A至C),这表明IDO1抑制以乳酸依赖的方式在不同病理中救援LTP。
此外,作者对接受PF068治疗的AD模型小鼠海马切片进行了13C-葡萄糖质量标记,并进行了电生理测试,在MCT1/2抑制剂存在或不存在的情况下,研究了标记的葡萄糖下游掺入TCA中间体的过程(图7,D至F)。正如之前在体内质量标记(图6)中所示,在APP/PS1、5XFAD和PS19海马切片中的IDO1抑制恢复了同位素标记的柠檬酸和苹果酸的浓度,这与葡萄糖通量恢复到TCA相一致。然而,这种恢复作用完全被MCT1/2抑制所阻止,这表明在淀粉样蛋白和tau蛋白病理中,神经元以IDO1依赖的方式利用乳酸。因此,在淀粉样蛋白和tau蛋白模型中抑制IDO1可以恢复乳酸的产生和被神经元吸收,从而恢复突触活动。
实验结果6
IDO1抑制剂可恢复来自晚发性AD(LOAD)患者的hAstrocytes向hNeurons的乳酸转移
APP/PS1、5XFAD和PS19模型再现了家族性AD和tau病罕见遗传形式的个体病理。然而,大多数AD是晚发性(LOAD),病因更复杂。为了研究KYN浓度在LOAD中是否发生变化,作者测量了KYN和TRP在特征明确的人类死后脑组织中的含量,这些组织中Braak病理学(AD神经病理学诊断的基础)的数量不断增加。作者评估了中额叶皮层(一个表现出双侧灰质损失、突触损失和高Aβ负荷(33)的大脑区域)中的KYN和TRP浓度。组织取自被分类为非痴呆(Braak I-II,n = 12)、痴呆Braak I-II(非AD,n = 12)、AD Braak III-IV(AD-mid,n = 12)和AD Braak V-VI(AD-high,n = 12)的受试者。诊断组在年龄、性别和死后间隔方面保持平衡。液相色谱-质谱联用(LC-MS)显示,KYN含量随着Braak阶段的增加而增加,但TRP含量没有变化(图8A)。
接下来,作者想知道IDO1对葡萄糖代谢调节的影响是否可以在LOAD人类星形胶质细胞和神经元体外模型中模拟。将特定患者的人类iPSC细胞系分化成一对基因匹配的神经元(hNeurons)和星形胶质细胞(hAstrocytes)。作者对来自认知正常(CN)个体和LOAD个体的h神经元和h星形胶质细胞的TRP和KYN进行了LC-MS定量分析。作者发现,CN个体和LOAD个体之间的h神经元TRP、KYN或下游的喹啉代谢物没有变化。然而,LOAD个体中hAstrocytes的TRP含量降低,KYN含量增加(图8,B和C)。用IDO1抑制剂PF068处理LOAD astrocytes,使TRP和KYN浓度恢复正常,表明LOAD astrocytes中的IDO1活性高于CN astrocytes。
然后,作者测试了IDO1抑制剂对来自CN个体和LOAD个体的hAstrocytes与hNeurons共培养时葡萄糖代谢和乳酸转移调节的影响。作者用13C-葡萄糖标记hAstrocytes,并用溶剂或PF068处理20小时。将hAstrocytes完全清洗干净,然后与各自的同源hNeurons共培养4小时,以便hAstrocyte产生的[M+3]乳酸被hNeurons吸收(图8D)。LOAD hAstrocytes的葡萄糖代谢比CN hAstrocytes低;然而,IDO1抑制后,这种缺陷得以纠正(图8E)。特别是,AD hAstrocytes中的[M+3]乳酸与CN hAstrocytes相比有所减少,但使用PF068后恢复到CN浓度。在PF068处理过的hAstrocytes与hNeurons共同培养后,hNeurons中的[M+3]乳酸摄取也恢复正常(图8F)。LOAD h神经元与PF068处理过的hAstrocytes共同培养,恢复了葡萄糖向丙酮酸和下游TCA代谢物的转化。在MCT1抑制剂存在的情况下,向CN和LOAD神经元施加外源性乳酸证实,乳酸是下游TCA代谢物在人iPSC衍生的神经元(iNeurons)中产生的底物。综上所述,这些发现表明,IDO1产生的KYN抑制LOAD hAstrocytes中乳酸的产生,并抑制hNeurons随后的摄取。IDO1抑制恢复了hAstrocytes中的葡萄糖通量,从而使得LOAD hNeurons能够摄取乳酸,补充TCA,为线粒体呼吸和突触活动提供能量。
IDO1抑制在LOAD星形胶质细胞和神经元中诱导的代谢恢复与作者在临床前APP和Tau突变模型的海马体中观察到的类似。为了确定这种体外效应的潜在机制,作者对LOAD和CN人类iPSC队列的一部分进行了RNA测序(RNA-seq)。主成分分析表明,LOAD hAstrocytes具有明显的疾病状态特征和轻微的药物效应,但hNeurons则没有显著差异,无论疾病状态或药物治疗如何(图8,G和H)。对每种条件下的基因表达进行了评估,结果显示,与CN hAstrocytes相比,LOAD hAstrocytes中存在差异表达基因(DEGs),包括编码犬尿氨酸途径酶的基因(图8I)。虽然PF068的转录效应相对温和,但LOAD神经元与基因匹配的、接受PF068治疗的hAstrocytes共培养的基因本体分析表明,与丙酮酸利用和TCA功能增加相关的通路发生了变化,这与作者在AD临床前模型中观察到的结果相似(图8,J和K)。LOAD和CN hAstrocytes基因差异表达分析的主题分析显示,AhR-ARNT主题特别丰富。通过主题分析确定的AhR-ARNT相关转录物的无偏分层聚类显示,LOAD和CN hAstrocytes之间的AhR靶基因存在分离,表明IDO1通路和KYN生成在调节LOAD中星形胶质细胞反应方面发挥作用。
