Chestnut Studying
摘要
Although fat is a crucial source of energy in diets, excessive intake leads to obesity. Fat absorption in the gut is prevailingly thought to occur organ-autonomously by diffusion. Whether the process is controlled by the brain-to-gut axis, however, remains largely unknown. Here we demonstrate that the dorsal motor nucleus of vagus (DMV) plays a key part in this process. Inactivation of DMV neurons reduces intestinal fat absorption and consequently causes weight loss, whereas activation of the DMV increases fat absorption and weight gain. Notably, the inactivation of a subpopulation of DMV neurons that project to the jejunum shortens the length of microvilli, thereby reducing fat absorption. Moreover, we identify a natural compound, puerarin, that mimics the suppression of the DMV–vagus pathway, which in turn leads to reduced fat absorption. Photoaffinity chemical methods and cryogenic electron microscopy of the structure of a GABAA receptor–puerarin complex reveal that puerarin binds to an allosteric modulatory site. Notably, conditional Gabra1 knockout in the DMV largely abolishes puerarin-induced intestinal fat loss. In summary, we discover that suppression of the DMV–vagus–jejunum axis controls intestinal fat absorption by shortening the length of microvilli and illustrate the therapeutic potential of puerarin binding to GABRA1 in fat loss.
虽然脂肪是膳食中重要的能量来源，但摄入过多会导致肥胖。人们普遍认为，脂肪在肠道中的吸收是通过扩散的方式由器官自主进行的。然而，这一过程是否受大脑到肠道轴的控制在很大程度上仍是未知数。在这里，我们证明迷走神经背运动核（DMV）在这一过程中起着关键作用。DMV神经元失活会减少肠道对脂肪的吸收，从而导致体重减轻，而激活DMV神经元则会增加脂肪吸收和体重增加。值得注意的是，使投射到空肠的 DMV 神经元亚群失活，会缩短微绒毛的长度，从而减少脂肪的吸收。此外，我们还发现了一种天然化合物葛根素，它能模拟抑制 DMV-迷走神经通路，进而减少脂肪吸收。光亲和化学方法和低温电子显微镜观察GABAA受体-葛根素复合物的结构发现，葛根素与一个异位调节位点结合。值得注意的是，在DMV中条件性敲除Gabra1在很大程度上能消除葛根素诱导的肠道脂肪损失。总之，我们发现抑制DMV-迷走神经-空肠轴可通过缩短微绒毛的长度来控制肠道脂肪的吸收，并说明了葛根素与GABRA1结合在减脂中的治疗潜力。
实验结果1
DMV 调节空肠脂肪吸收
鉴于 DMV 在大脑到肠道通路中的核心作用，作者首先评估了 DMV 神经元失活对肠道脂肪吸收的影响。作者使用化学基因设计药物（DREADDS）专门激活的设计受体（chemogenetic designer receptor exclusively activated by designer drugs，DREADDS）技术，将表达 Cre 依赖性 hM4D(Gi) 的重组腺相关病毒（rAAV）（rAAV-EF1α-DIO-hM4D(Gi)-mCherry）或对照 AAV（rAAV-EFLA-DIO-mCherry）注射到Phox2b-cre杂合小鼠的 DMV 区域。这种方法使作者能够特异性地靶向 DMV 中的 PHOX2B 神经元群（图1a-c）。氯氮平N-氧化物（CNO）是一种化学基因设计受体的配体，已被证明能使体内的 DMV 神经元失活。腹腔注射 CNO 后，DMV 神经元被抑制的小鼠（Px2b-4i）与对照组小鼠（Px2b-con）相比，喂食高脂食物后体重增加较少（图1d），但食物消耗量没有差异。进行了口服脂肪耐受性试验（OFTT），以比较各组之间的肠道甘油三酯（TG）吸收情况。与Px2b-con 小鼠相比，Px2b-4i 小鼠在灌油后的血浆 TG 水平较低（图1e）。从Px2b-4i 小鼠粪便中收集的非酯化脂肪酸 (NEFA) 和 TG 含量（图1f,g）明显高于对照组小鼠，这表明 DMV 抑制后脂肪排泄增加。与此相一致，作者观察到Px2b-4i 小鼠空肠对脂肪的吸收减少（图1h），而空肠是吸收脂肪的主要部位。作者还进行了口服葡萄糖耐量试验，观察到组间血糖水平无明显差异。这些发现表明，DMV 抑制导致空肠脂肪吸收减少。
为了证实上述肠道表型主要是由于 DMV 神经元而不是其他表达 Phox2b 的神经元（如 NTS 中的神经元）失活所致，作者进一步在Chat-cre小鼠中对 DMV 神经元进行了化学失活。在这些小鼠中，Cre 重组酶选择性地表达在胆碱能（CHAT+）神经元中，这些神经元主要位于 DMV 中，而不在 NTS 中（图1i）。作者将 Cre 依赖性 AAV-hM4D(Gi) 注射到Chat-cre小鼠的 DMV 中（图1j）。与Chat-con 小鼠相比，应用 CNO 后，作者观察到Chat-4i 小鼠发生了显著变化，如体重增加较少、血浆 TG 水平较低、粪便脂肪排泄较多和空肠脂肪吸收较少（图1k-o）。这些结果与Px2b-4i 小鼠的表型一致，验证了 DMV 抑制对空肠脂肪吸收的抑制作用。
接下来，作者向Phox2b-cre小鼠（3q）的 DMV 双侧注射 hM3D(Gq)（rAAV-EF1α-DIO-hM3D(Gq)-mCherry）激活 DMV 神经元。作者还指定了另外两组Phox2b-cre小鼠作为对照，它们分别注射了 hM4D(Gi) （4i）或对照病毒（con）。与Px2b-con 小鼠相比，CNO 诱导 DMV 神经元激活后，作者观察到体重增加、粪便 NEFA 和 TG 排泄减少以及空肠 TG 含量增加。与Px2b-4i 小鼠相比，长期激活Px2b-3q 小鼠 DMV 神经元的结果显示出相反的效果。值得注意的是，作者没有发现 DMV 操作后十二指肠或回肠等其他肠段的 TG 含量发生显著变化。
为了证实 DMV-迷走神经通路在肠道脂肪吸收中的作用，作者进行了膈下迷走神经切断术。迷走神经切断术导致体重增加减少、脂肪排泄增加和空肠脂肪吸收减少。这些发现共同表明，DMV 的活动在调节空肠脂肪吸收并因此导致体重变化方面起着关键作用。
实验结果2
鉴定用于抑制 DMV 的葛根素
为了确定调控 DMV 神经元的化学分子或天然化合物，作者将药理处理与 PHOX2B-Cre:Rosa26-tdTomato 小鼠脑干切片的电生理学研究相结合。浴用葛根素--一种被批准用于治疗心脑血管疾病的药物--诱导动作电位频率显著降低（图2a,b），这是由于 DMV 神经元的膜电位超极化所致（图2c）。在总共 22 个检测到的神经元中，16 个（72.7%）表现出葛根素抑制的发射变化模式（图2d）。在注射葛根素后喂食高纤维食物的小鼠中，与对照组相比，DMV 中 FOS 阳性神经元的数量明显减少（图2e、f）。作者还观察到，葛根素（i.p.）处理在不影响食物摄入量的情况下减少了体重增加（图2g、h），降低了血浆 TG 水平（基于 OFTT；图2i），增加了粪便脂肪排泄（图2j、k）并抑制了空肠脂肪吸收（图2l）。与抑制 DMV 的结果一致，葛根素治疗对口服葡萄糖耐量或十二指肠和回肠中的 TG 含量没有显著影响。此外，葛根素对胃肠道蠕动和转运也没有影响。为避免葛根素对外周器官的潜在混杂效应，给配对喂养的高脂血症小鼠侧脑室内注射葛根素（图2m）。葛根素治疗持续抑制体重增加并降低血浆 TG 水平（图2n，o）。值得注意的是，作者还观察到葛根素中心给药增加了粪便总脂质含量（图2p,q）并降低了空肠 TG 含量（图2r）。这些结果表明葛根素具有抑制DMV活性的作用，从而导致空肠脂肪吸收的减少。
实验结果3
葛根素靶向 GABRA1 以抑制 DMV
为了阐明 DMV 神经元抑制脂肪吸收的分子机制，作者接下来以葛根素为诱饵，进行了基于活性的蛋白质谱分析。作者合成了带有光活性标签的葛根素标签探针，通过光亲和化学反应富集和观察目标蛋白（图3a）。作者验证了探针标记的葛根素与未标记的葛根素具有相同的增加粪脂排泄的作用。将探针标记的葛根素添加到新鲜分离的脑干样本中，并使用 10 个剂量的非标记葛根素作为探针标记葛根素的竞争对手。光亲和反应结束后，用液相色谱法和串联质谱法（LC-MS/MS）对靶蛋白进行评估。在 571 个潜在靶蛋白中（图3b），只有 14 个候选蛋白属于膜受体和离子通道。在这 14 个蛋白中，鉴于 GABRA1 在 DMV 中大量表达，而在邻近脑区表达较少（Allen Brain Map 数据库），因此 GABRA1 被优先列为有希望的靶标。此外，GABAA受体也与迷走神经调节有关。作者通过 Western 印迹验证了探针标记的葛根素与 GABRA1 蛋白之间的相互作用（图3c）。作者还检测到，在 DMV 区域的 PHOX2B-tdTomato 神经元中，探针标记的葛根素与 GABRA1 高度共定位，这些信号可以被 10 个剂量的非标记葛根素阻断（图3d）。
GABAA受体是五聚体配体门控离子通道，是脊椎动物神经系统抑制性神经传递的主要决定因素。为了描述葛根素对含α1亚基GABAA受体的影响，作者使用了α1β3γ2L 异源五聚体--一种典型的神经元亚型。首先，通过对表达该受体的 HEK293S 细胞进行全细胞膜片钳记录，作者发现葛根素能放大 GABA 诱导的电流（图3e、f）。接下来，作者解析了与葛根素结合的 α1β3γ2LGABAA受体的单颗粒低温电子显微镜（cryo-EM）结构，其标称分辨率为 2.4 Å（图3g）。在α1+/γ2-界面的环路 C 下的一个位置观察到了葛根素密度（图3g），这是苯二氮卓类药物和其他异位调节剂在突触GABAA受体胞外区域的经典结合位点。在这个口袋中，葛根素的表面积为 587 Å2。它的羟基苯基指向γ2-C-亚基，而铬酮和葡萄糖苷基则主要与 α1-D+ 亚基接触。α1Tyr210和γ2Phe77残基通过π-π堆积相互作用锚定葛根素色酮核心。除了水介导的接触外，葛根素还通过氢键网络稳定了与环 C 残基α1Ser205 和α1Thr207 以及α1His102 和γ2Asp56 的结合（图3h）。与激动剂 GABA 一起结合到两个β3+/α1-界面的正交位点上，葛根素的结合使离子通道进入深度脱敏状态，这一点可以从相对的结构域排列和 9′ 激活门看出，9′激活门比之前报道的地西泮结合结构更宽。这些结构数据以及电生理记录表明葛根素具有正异构调节剂的作用。
为了证实葛根素能通过 DMV GABRA1 抑制脂肪吸收，作者将Gabra1flox/flox（Gabra1fl/fl）小鼠与Phox2b-cre小鼠杂交，产生Gabra1条件性基因敲除（cKO）小鼠。与对照组flox小鼠相比，在Gabra1缺失的情况下，作者观察到DMV神经元活动增加、体重增加（图3i,j）、粪便脂肪排泄减少（图3k,l）和空肠脂肪吸收增加（图3m）。值得注意的是，在脑干切片中进行全细胞膜片钳记录时，葛根素对对照组小鼠的大多数 DMV 神经元（70%，20 个神经元中的 14 个）产生抑制作用，但在Gabra1缺失的情况下，葛根素的作用大大降低（19.05%，21 个神经元中的 4 个）。此外，Gabra1的缺失也取消了葛根素抑制脂肪吸收和体重增加的作用（图3i-m）。综上所述，作者的数据表明葛根素通过结合含有α1亚基的GABAA受体，对DMV-迷走神经轴产生抑制作用，从而调节脂肪的吸收。
实验结果4
在脂肪吸收过程中的空肠投射 DMV 神经元
DMV-迷走神经投射到胃肠道的不同区段。为了靶向投射到空肠的 DMV 神经元，作者将编码小麦胚芽凝集素（WGA）和 Cre 重组酶融合蛋白的逆行 AAV 病毒（AAV-hSyn-WGA-Cre-P2A-mcherry (AAV-WGA-Cre)）注射到野生型小鼠的空肠。同时，向 DMV 区域注射 Cre 依赖性 hM4D(Gi) 或对照 AAV 病毒，从而对投射到 WGA-hM4D(Gi) （WGA-4i）小鼠或对照（WGA-con）小鼠空肠的 DMV 神经元进行化学遗传操作（图4a,b）。与Phox2b-cre和Chat-cre小鼠中 DMV 神经元失活时观察到的结果一致，作者观察到 WGA-4i 小鼠体重增加较少（图4c、d），血浆 TG 水平降低（图4e），粪便脂肪排泄增加（图4f、g），空肠脂肪吸收减少（图4h）。用同样的方法，作者还使投射到十二指肠或回肠的 DMV 神经元失活。在体重、脂肪吸收、血浆 TG 水平或粪便脂肪排泄方面均未观察到明显差异。这些结果表明，投射到空肠的 DMV 神经元可直接调节脂肪吸收和体重增加。
实验结果5
DMV 控制空肠微绒毛长度
作者接下来探讨了葛根素和DMV-迷走神经轴如何影响脂肪的吸收。作者首先检测了 DMV 失活小鼠空肠中脂质转运体的表达，但没有观察到明显的变化。脂肪吸收效率被认为与总表面积的变化密切相关；然而，在 DMV 神经元失活或注射葛根素后，空肠上皮绒毛的长度没有发生明显变化。值得注意的是，通过基于 EM 图像的分析，作者观察到 DMV 神经元失活后空肠微绒毛的长度减少（图5a-c）。同时，调控微绒毛7的基因，包括Ezr（编码egrin）、Cdc42、Eps8和Vil1，在DMV失活小鼠中的表达水平显著低于对照小鼠（图5d）。同样，作者发现 DMV 神经元的激活延长了空肠微绒毛的长度并增加了相关基因的表达。此外，空肠投射 DMV 神经元的失活也显示了类似的结果，空肠微绒毛长度和相关基因的表达量都有所下降（图5e-h）。与DMV抑制的结果一致，葛根素（i.p.）处理缩短了微绒毛的长度并降低了相关基因的表达，而在DMV中缺失Gabra1则减弱了葛根素的这些作用（图5i-m）。此外，作者没有发现十二指肠或回肠在 DMV 抑制或葛根素处理后发生显著变化。这些观察结果共同说明了 DMV-迷走神经通路通过影响空肠微绒毛长度来控制肠道脂肪吸收的模型。
