Chestnut Studying
摘要
Macrophages sense pathogens and orchestrate specific immune responses. Stimulus specificity is thought to be achieved through combinatorial and dynamical coding by signaling pathways. While NFκB dynamics are known to encode stimulus information, dynamical coding in other signaling pathways and their combinatorial coordination remain unclear. Here, we established live-cell microscopy to investigate how NFκB and p38 dynamics interface in stimulated macrophages. Information theory and machine learning revealed that p38 dynamics distinguish cytokine TNF from pathogen-associated molecular patterns and high doses from low, but contributed little to information-rich NFκB dynamics when both pathways are considered. This suggests that immune response genes benefit from decoding immune signaling dynamics or combinatorics, but not both. We found that the heterogeneity of the two pathways is surprisingly uncorrelated. Mathematical modeling revealed potential sources of uncorrelated heterogeneity in the branched pathway network topology and predicted it to drive gene expression variability. Indeed, genes dependent on both p38 and NFκB showed high scRNAseq variability and bimodality. These results identify combinatorial signaling as a mechanism to restrict NFκB-AND-p38-responsive inflammatory cytokine expression to few cells.
巨噬细胞能够感知病原体并协调特定的免疫反应。人们认为,刺激特异性是通过信号通路的组合和动态编码来实现的。虽然NFκB动态编码刺激信息是已知的,但其他信号通路的动态编码及其组合协调仍不清楚。在这里,我们建立了活细胞显微镜来研究NFκB和p38动态如何在受刺激的巨噬细胞中相互作用。信息理论和机器学习表明,p38动态机制能够区分细胞因子TNF和病原体相关分子模式,区分高剂量和低剂量,但在考虑两条通路时,对信息丰富的NFκB动态机制的贡献很小。这表明免疫应答基因受益于免疫信号动态或组合的解码,但不是两者兼而有之。我们发现,两条途径的异质性出人意料地不相关。数学模型揭示了分支途径网络拓扑结构中不相关异质性的潜在来源,并预测其将驱动基因表达的变异性。事实上,依赖于p38和NFκB的基因表现出高度scRNAseq变异性及双峰性。这些结果将组合信号传导机制确定为一种机制,可将NFκB-AND-p38反应性炎性细胞因子表达限制在少数细胞中。
前言
巨噬细胞是先天免疫系统无处不在的哨兵细胞。它们通过分泌细胞因子和趋化因子来维持组织稳态并协调局部和全身免疫反应。它们必须平衡对病原体的高度敏感性,以产生有效的反应,抵御组织受损的风险。事实上,巨噬细胞反应失调与多种病理有关。反应的刺激特异性是确保适当但非不必要的免疫活动的一种手段,因此是健康巨噬细胞的标志。巨噬细胞通过十几个受体(包括Toll样受体(TLR))感知病原体相关分子模式(PAMP)和宿主细胞因子,这些受体汇聚在数量有限的免疫反应信号通路中,包括IKK/NFκB和TBK1/ IRF通路和MAPKs,包括p38、JNK和ERK。
这些途径如何影响特定刺激基因表达程序?先前的研究已经证明了刺激信息的动态编码和组合编码。通过动态编码,单个信号通路可以通过特定于刺激的动力学(即信号活动随时间的变化)将不同刺激的信息传递到细胞核。靶基因可以区分不同的动态特征,从而产生特定于刺激的响应。例如,转录因子NFκB的活性动态特征(称为“NFκB信号编码子”)包括信号的速度、振幅和持续时间,这些特征能够向细胞核传递有关细胞外免疫威胁的信息。NFκB靶基因和增强子已被证明能够以基因特异性方式区分这些信号密码子的差异性部署。虽然NFκB动态的信息含量已经得到了充分阐明,但其他先天免疫反应途径的动态信号活动的信息含量尚未得到量化或表征。
组合编码涉及在特定刺激组合中激活的两个或多个通路;这允许免疫反应基因通过响应特定通路组合来表达特定刺激,通常通过高度基因特异性调节机制。平均细胞可变活性的生化研究已经证实,PRR和细胞因子受体激活了关键免疫反应信号通路中的不同亚群,例如,NFκB + JNK响应宿主细胞因子TNF(肿瘤坏死因子),NFκB + JNK + p38响应MyD88激活的PAMP,以及NFκB+JNK+IRF对TRIF激活的PAMP的反应。在单细胞RAW264.7细胞(一种巨噬细胞样永生化细胞系)中,JNK和NFκB活性的组合激活可区分细菌感染细胞和未感染的旁系细胞以及暴露剂量。MAPK p38 也需要比 NFκB 更高的 TLR4 配体剂量才能激活,这表明它可能有助于区分配体剂量。然而,MAPK p38在原代巨噬细胞中的动态调节机制、动态调节是否包含信息以及它们如何与NFκB动态调节协调编码刺激物的剂量和分子特性等信息,目前尚不清楚。
此前对群体平均值的生化研究表明,MAPK p38是NFκB动态和组合编码的合适候选者。信号传导机制研究报道了激活MAPK p38的两种不同信号通路。TNF激活p38几乎完全依赖于IKK和Tpl2下游的MKK3/6,而PAMP LPS(脂多糖)则可以通过TAK1下游的MKK4激活p38,这表明不同的激活动态可能会导致不同的结果。此外,基因调控机制的研究表明,NFκB和MAPK p38共同控制重要的免疫反应基因,如炎性细胞因子。除了激活转录因子(如CREB)外,MAPK p38通过控制mRNA处理和半衰期、前蛋白处理和 和分泌。通过这些机制,p38活性与转录激活NFκB形成“顺序与门”,这意味着虽然它们作用于顺序的生化步骤,但以这种方式调节的细胞因子的正常产生需要它们的活动。这表明NFκB-p38组合编码在确保基因表达的刺激特异性方面发挥作用。
虽然有大量证据表明NFκB-p38组合编码在巨噬细胞反应的刺激特异性中发挥着作用,但尚不清楚它与任一通路中的动态编码有何关联。鉴于先天免疫反应中存在大量细胞间异质性,量化NFκB-p38组合信号的编码能力需要在单细胞水平上进行研究。刺激特异性可以通过机器学习分类或信号理论中的信息理论分析进行量化,该分析可以确定观察到的信号特征与刺激之间的相关程度。
为了对原代巨噬细胞中p38和NFκB的动态和组合编码进行单细胞定量研究,作者利用了两种最新开发的技术:首先,作者使用了激酶易位报告基因(KTR),这是一种工程化蛋白,包含一个荧光蛋白,该荧光蛋白与目标激酶的底物识别主题以及磷酸化依赖性核定位和出口信号相结合。KTR的磷酸化通常会增加核出口,减少核进口。这允许使用活细胞显微镜实时监测激酶的动态活性,包括激活和失活。其次,作者使用HoxB4转导的髓样前体系统(hMPs)来生成使用M-CSF的初级hMP衍生的巨噬细胞(hMPDMs)。这些细胞在PAMP反应转录组反应和NFκB信号动态方面与原代骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)非常相似。由于这些前体细胞可以在培养中维持,因此可以在分化成巨噬细胞之前用上述KTR进行基因工程改造。
作者在此报告,p38活性表现出刺激和剂量特异性动态,其包含的信息少于NFκB,但能够精确区分TNF和PAMP。然而,与信息丰富的NFκB动态特征相结合,尽管两种途径的剂量反应行为不同,但p38动态特征对配体或剂量区分的作用却与预期相反,作用甚微。这表明,当免疫反应基因进化出解码NFκB动态或解码NFκB和p38组合的能力时,它们会获得刺激特异性,但进化出这两种能力后,它们获得的刺激特异性却很少。由于分支路径结构固有的信号干扰,p38和NFκB信号动态被发现关联性差且异质性高。作者的研究结果表明,AND门基因调控机制在产生细胞可变甚至双峰表达反应方面发挥着作用。
实验结果1
用于活细胞成像的NFκB和p38 MAPK活性双报告巨噬细胞
为了使用活细胞成像技术同时研究巨噬细胞中NFκB和p38 MAPK的单细胞活动动态,作者构建了双报告细胞,表达荧光标记的RELA和p38特异性荧光激酶易位报告基因(KTR)(图1A)。作者使用先前建立的敲入小鼠系(该系从内源性Rela基因座表达mVenus-RelA(从而避免了基于过表达的检测系统可能导致的NFκB动态变化))的骨髓,制备了hMPs。这些细胞可以分化成hMP衍生的巨噬细胞(hMPDM),在PAMP反应转录组反应和NFκB信号动态方面与原代骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)非常相似。随后,研究人员使用慢病毒转导将p38特异性KTR与mCerulean结合,通过载体确保转基因在分化后具有抗沉默表达。通过荧光激活细胞分选收集了mVenus+(100%单细胞门控)和mCerulean+(17%单细胞门控)的细胞。
鉴于KTR是激酶活性的底物,但不是信号效应分子,因此它们的异位表达预计不会显著改变信号系统的参数。然而,底物磷酸化对引入额外的激酶底物的剂量反应可能很敏感。作者通过Western Blotting比较了双报告细胞hMPDMs和mVenus-Rela hMDPMs在2小时内接受三种LPS剂量刺激时内源性p38底物MK2及其下游靶标CREB的磷酸化情况,未观察到任何明显差异(图1B)。作者还证实,通过磷酸化测量的p38活化和通过IκBα降解测量的NFκB通路均未受到影响(图1B)。
为了测试分化后hMPDM中p38报告基因的表达、功能和特异性,作者拍摄了8小时内有和没有LPS刺激的表达p38-KTR的hMPDM的图像。在刺激之前,KTR的荧光强度在细胞核中高于细胞质;正如预期的那样,细胞之间的比例是不同的。在模拟刺激下观察到的KTR的易位非常少,而LPS刺激诱导了一部分核KTR从细胞核转移到细胞质,在30分钟时可见,并在1小时后增加(图1C)。刺激后6小时,KTR的核荧光强度再次增加,但未达到基线水平。预先用药理p38抑制剂预处理可减少观察到的转位(图1C)。
通过调整先前建立的自动化图像分析流程,可以对每个刺激条件下8小时内数百个细胞的p38-KTR荧光C/N比进行量化(图1D)。由于使用了C/N比,因此可以控制报告基因表达的内在变异性。在原位刺激前测量了30-60分钟的基线荧光,从而可以对轨迹进行逐个细胞的基线校正。量化的轨迹证实了在模拟刺激下没有观察到易位,在LPS刺激下观察到了从细胞核中移出和返回细胞核的易位,这代表了p38的激活和失活,以及在p38抑制剂存在下易位强度的大幅下降,证实了KTR的特异性(图1D)。使用该报告基因测量的p38活性表明,单个细胞对刺激的响应在信号的速度、振幅和持续时间等方面存在异质性。
由于不同的MAPK活性测定方法具有不同的灵敏度,特别是在低剂量时,作者比较了KTR显微镜报告的p38平均(伪整体)活性,以响应三种剂量的PAMP LPS(脂多糖,结合TLR4,通过MyD8 8和TRIF适配器,通过NFκB、MAPK和IRF途径发出信号)、P3C4(Pam3CysSerLys4,与TLR2/1结合,通过MyD88向NFκB和MAPK途径发出信号)和CpG(CpG寡脱氧核苷酸,与TLR9结合,通过MyD 88到NFκB和MAPK途径)和宿主细胞因子TNF(肿瘤坏死因子,结合TNF受体1/2,通过TRADD适配器信号传导到NFκB和MAPK途径)超过4小时,通过Western Blotting(WB)检测到大量磷酸化p38水平(图1E)。KTR测量结果与WB观察到的刺激和剂量特异性p38活性的许多特征相吻合,例如快速激活和失活动态、峰值振幅和激活与失活速度的刺激特异性,以及激活强度和速度的剂量特异性。具体而言,两种测定方法对CpG的剂量反应和动态非常吻合,但WB观察到的失活程度略高。P3C4剂量反应与相对峰值振幅匹配良好,尽管在较低剂量下使用KTR时峰值的出现时间略有延迟。在低剂量的LPS和TNF中,KTR测量的信号似乎比WB测量产生的信号少,这反映了这两种测量方式的不同特性。当比较磷酸化p38底物MK2的水平与p38-KTR显微镜结果时,也获得了类似的结果。
为了进一步确认p38-KTR能够正确反映p38活性的动态变化和异质性,作者将流式细胞术测量的p38磷酸化与KTR测量进行了比较。刺激后第一小时的平均荧光强度(MFI)概括了KTR显微镜观察到的平均(伪整体)p38活性的动态和剂量反应的许多方面,例如峰值激活的时间、宽度和相对振幅,特别是对于CpG和LPS(图1F)。在低剂量P3C4和TNF刺激下,KTR测量值与流式细胞术测量值相比,信号强度变化较大,可能处于实验变异的范围内(图1F)。重要的是,在单细胞水平上,当通过p-p38流式细胞术和p38-KTR显微镜测量时,在所有细胞中,p38激活的细胞在P3C4、CpG和LPS中的比例显示出相似的剂量反应(图1G),证实了与p-p38流式细胞术相比,p38-KTR对低刺激剂量的敏感性没有系统性降低。然而,对于TNF,p38-KTR测量的活化细胞比例低于流式细胞术测量值,特别是在低剂量时,这表明KTR对低剂量TNF诱导的p38活性的敏感性较低(图1G)。TNF介导的p38活性的持续时间短或短暂性可能起了一定的作用。总之,p38-KTR是一种合适的报告基因,可与mVenus-RelA结合用于hMPDM中,以研究巨噬细胞中p38和NFκB在单细胞水平上的组合信号传导。
实验结果2
P38反应的刺激特异性:PAMPs可以区别于TNF
虽然众所周知NFκB信号动态具有高度的刺激特异性,但p38信号中包含的刺激特异性信息尚未确定。因此,在研究NFκB和p38的组合编码之前,作者首先使用p38-KTR hMPDMs的活细胞显微镜,比较了p38单独对三种不同PAMP(P3C4、CpG和LPS)高剂量刺激和宿主细胞因子TNF的反应。在对轨迹进行自动图像分析和严格的质量过滤后,显示923-1171个细胞中p38活性轨迹的热图(两个生物重复)和示例轨迹揭示了p38活性的刺激特异性(图2A)。例如,刺激诱导的p38动态变化在振幅(P3C4和LPS的振幅较高,CpG的振幅适中,TNF的振幅较低)、激活速度(TNF激活p38的速度非常快,CpG激活p38的速度较慢)、 失活强度(TNF的第一个峰值非常窄,且急剧下降;P3C4的第一个峰值较宽;LPS的活性下降缓慢;CpG的第一个峰值宽度差异很大),以及持续时间(LPS的活性持续时间较长)。在所有配体中,观察到受相同配体刺激的单个细胞之间的信号在速度、振幅和持续时间等方面存在差异(图2A)。
为了量化p38动态的信息含量,作者将单细胞时间序列数据分解为228个动态特征,包括描述激活和去激活速度、振幅、振荡特性、持续时间、早期与晚期活动以及总活动的特征(图2B)。然后,作者确定了高剂量P3C4、CpG、LPS、TNF和模拟刺激与p38活性的这些动态特征之间的相互信息(MI)(以比特为单位报告的相关性测量,其中1比特表示对比两个条件时具有完全相关性),发现其为1.12比特(图2C)。这表明,p38动态在一定程度上区分了这五种刺激条件(五种条件下的最大MI为2.32位),尽管并不完美。
为了更好地理解p38活动如何区分这些刺激,作者使用机器学习对p38活动的来源进行分类,这意味着作者训练机器学习模型,根据单细胞p38动态活动预测刺激身份。首先,作者训练了一个长短期记忆(LSTM)循环神经网络(RNN),用于对四种刺激(图2D)的p38时间序列数据进行分类(使用由95个轨迹时间点组成的向量作为输入)。选择RNN的LSTM架构类型是因为它非常适合直接从时间序列数据中学习序列信息。它不会将时间点视为离散特征,而是在计算当前时间点的输出时考虑先前时间点的输出。此外,LSTM是对标准RNN的改进,可以更好地处理更长的序列。作者进行了五次交叉验证来评估模型性能。按类别划分的F1分数(分类的精确度和敏感性的调和平均值)显示,TNF模型的性能特别高(F1分数:0.86),而CpG、P3C4和LPS的F1分数在0.46到0.56之间,其中CpG的表现最差,LPS的表现最好(图2E)。
然后,作者使用228个动态特征从四个刺激条件下提取p38动态轨迹,并使用所得值作为输入到一个决策树集成分类器,该分类器对于这些类型的分类问题通常在性能、避免过拟合和实施可行性方面取得良好的平衡。作者同样使用5倍交叉验证(图2F)评估了这种分类。使用这种基于特征的分类器获得的按类别F1分数证实,TNF刺激特别容易区分,F1分数为0.89,而CpG、P3C4和LPS则更难区分,F1分数在0.54和0.63之间(图2G)。
从两个分类器的5倍交叉验证中得出的混淆矩阵(显示了每个类别中的数据是如何分类的)证实,TNF衍生的p38活性分类具有高灵敏度(87/92%),很少被误分类为其他刺激物(图2H、I)。P3C4和LPS触发的p38活性的分类灵敏度分别为56/57%和57%/62%,且两者最常被误分类为CpG。CpG的灵敏度最低,为44/54%。
这两种截然不同的分类方法(时间序列数据的LSTM分类和从时间序列中提取动态特征的决策树分类器)的结果相似,这为这些发现提供了信心,并证实了提取的动态特征捕捉了与p38诱导刺激的可区分性相关的p38动态特征(图2E、H与2G、I)。基于特征的分类器(总体模型准确率:67%)比时间序列分类器(总体模型准确率:61%)略胜一筹,这可能是因为一些动态特征基于多个时间点,因此可以消除技术噪音,当然,这些截然不同的机器学习模型之间的其他差异也可能起到作用。
这些分类分析的一个关键发现是,p38激活动力学将宿主细胞因子TNF与所测试的细菌和病毒PAMP区分开来。仔细观察一些动态特征后发现,TNF诱导的p38活性的特点是激活速度快、第一峰振幅低、持续时间长、总活性高(图2J)。这种低活性的一个后果可能是TNF与模拟刺激的区分度较低;事实上,作者发现0.53比特的互信息将TNF与模拟刺激区分开来,而0.69、0.77和 0.85比特的相互信息分别将CpG、LPS和P3C4与模拟刺激区分开来(图2K),尽管精确的定量将受到报告基因或生理激酶底物的反应速度的影响。
同样,当对所有四种刺激和模拟刺激进行动态特征分类时,与仅对四种刺激进行分类相比,TNF类的F1评分下降幅度最大(从0.89降至0.8)(图2G)。混淆矩阵表明,TNF最常被误分类为模拟刺激,反之亦然。模拟刺激的第二个最常见的错误分类是CpG。其F1评分从0.54下降到0.48,而P3C4和LPS的F1评分受分类器中包含模拟刺激的影响较小(图2G)。
实验结果3
MAPK p38强化NFκB对配体特性的识别
接下来,作者试图研究p38信号如何与NFκB信号结合,因为这两种途径通常由相同的配体激活。作者使用双报告基因hMDPM来测量PAMP和TNF诱导的NFκB和p38在同一细胞中的动态变化(图3A),发现NFκB和p38在单个细胞中的动态变化明显不同。NFκB动态反应在响应速度、振幅、持续时间和振荡内容方面表现出先前报道的刺激特异性。例如,TNF诱导的NFκB活性通常具有很强的振荡性,而细菌PAMP则主要引起非振荡性动态反应。
作者首先思考刺激特异性p38信号是否有助于刺激特异性NFκB信号,从而提高细胞区分不同刺激的能力。为此,作者首先使用所有四种刺激条件下NFκB的时间序列或动态特征训练机器学习分类器。分类的混淆矩阵显示,虽然NFκB活性使得PAMP类别的分类准确率始终高于p38,但TNF的识别率也相当高(使用时间序列时略高,使用动态特征时略低)(图3B、C)。然后,作者使用NFκB和p38的组合活动训练机器学习模型,发现大多数分类的准确性略有提高,其中TNF识别再次表现出特别高的准确性(图3B、C)。相应地,p38时间序列和基于p38特征的分类的整体分类准确率分别为61%和67%,而NFκB 时间序列数据和动态特征时分别为74%和70%,而当对它们的组合活动进行分类时,则分别提高到79%和74%,这表明p38有助于NFκB提供的刺激区分度(图3D、E)。作为对照,作者使用p38或NFκB活动分别与从所有刺激中随机选择的细胞中错误匹配的NFκB或p38活动相结合,训练分类器(“随机”)。与使用相应的单通路输入相比,使用这种“随机”NFκB + p38输入时,无论是基于时间序列还是基于特征的分类器,其整体模型准确率(图3D、E)或刺激之间的混淆模式均没有提高。
从肿瘤坏死因子与PAMP的区分性来看,按类别划分的F1评分证实,p38和NFκB都能以高灵敏度和精确度识别肿瘤坏死因子诱导的活动(F1评分:0.85-0.89),但这两种方法都不能提供始终如一的出色分类(图3F、G)。p38 + NFκB联合活性使时间序列和基于特征的分类器的TNF F1评分分别略微上升至0.94/0.91。NFκB或p38活性的随机化证实了小幅上升是由于适当匹配的联合活性(图3F、G)。因此,两种信号通路都能独立区分宿主细胞因子TNF和PAMP,而联合活性仅略微提高了可靠性。
然后作者思考了他们的联合活动是否提高了TNF与模拟的区分度。相互信息计算显示,TNF诱导的NFκB活动与模拟的区分度为0.86比特。考虑到p38与NFκB的组合在这些计算中没有提供任何改进,因此联合活动的区分度为0.83比特,单独的p38为0.53比特(图3H)。
同样,当对模拟和所有四种刺激或仅四种刺激(图3C)进行分类器训练时,使用NFκB特征或NFκB+p38特征的总体准确率几乎没有提高(0.70/0.74与0.74/0.77)(图3E),TNF 类别的F1评分保持相似(0.85/0.84与0.91/0.89)(图3G),而在使用p38特征的分类器中,包含模拟刺激的结果是总体准确度相似(0.67与0.66),TNF F1评分降低(0.89至0.8)。总体而言,作者的研究结果支持以下结论:NFκB主要负责区分宿主细胞因子TNF刺激与模拟刺激,而p38则可独立可靠地区分TNF刺激与PAMP刺激。
接下来,作者探讨了p38和NFκB的组合信号是否能够更好地区分三种PAMP。虽然p38动态特征为P3C4、CpG、LPS和模拟提供了0.83位的互信息,但NFκB动态特征提供了1.1位,组合提供了1.23位(图3I)。使用p38活性时,时间序列和基于特征的分类器的总体分类准确率为60%/61%,使用NFκB活性时为70%,使用活性组合时为75/73%(图3J)。这三种单独的分析一致表明,p38动态本身对区分PAMP的能力有限,与NFκB动态组合时提供的信息也很少。
时间序列和基于特征的分类的类别F1评分显示,在三种PAMP中,LPS在仅p38、仅NFκB和p38 + NFκB分类中的F1评分最高,使其成为三种PAMP中最易区分的(图3K)。当考虑与单独的NFκB相比的综合活性时,CpG和LPS的分类比P3C4的分类改善得更多,后者仅略有增加。考虑到混淆矩阵,仅使用p38活性时,所有刺激均表现出高度混淆,CpG被误分类为P3C4的频率略高于被误分类为LPS的频率(图3L)。在组合活性下,P3C4被误分类为LPS(或相反)的情况特别罕见。在考虑组合活性时,CpG被误分类为LPS的情况有所减少。在分类准确性(图3J)、F1评分(图3K)和类别混淆方面,使用随机化p38或NFκB活性的对照分类与单通路分类器表现相似。所选动态特征的可视化演示了p38特征如何有助于区分PAMP:虽然P3C4和CpG诱导的NFκB轨迹显示“最大导数”分布非常相似,但这两种配体在其p38动态的“最大导数”中显得更加不同(图3M,左)。同样,与NFκB相比,p38的“最小导数”在LPS和P3C4之间表现出更大的差异(图3M,中间),而p38的“最大振幅”可能有助于区分LPS和CpG(图3M,右)。总之,与单独的NFκB活性相比,p38有助于刺激特异性信号传导,从而更准确地识别难以区分的刺激,例如MyD88激活的PAMP。
实验结果4
MAPK p38无法改善剂量区分,其效果不及NFκB动态特征
NFκB动态特征具有剂量特异性。此前的一项研究报道了NFκB和MAPK对巨噬细胞中脂多糖A(一种TLR4配体)刺激的剂量反应差异,其中MAPK的开关式剂量反应确保了无害和有害PAMP水平之间的反应差异。因此,作者接下来试图确定NFκB和p38动态是否共同作用以区分刺激剂量。为此,作者确定了713-1259细胞在8小时内对5种剂量P3C4、CpG、LPS或TNF的p38和NFκB活性(图4A)。剂量范围在10 5之间。选择最高剂量是为了使NFκB反应达到饱和,而选择最低剂量是为了使NFκB活性与模拟刺激相似。p38和NFκB活性的变化轨迹似乎与剂量有关。例如,随着P3C4剂量的增加,p38振幅和反应速度增加,而第一个峰的宽度减小。NFκB和p38似乎具有不同的激活阈值,例如,0.1 ng/ml P3C4几乎可以激活几乎所有细胞中的NFκB,但只能激活一小部分细胞中的p38(图4A)。
为了量化不同的激活阈值,作者拟合了希尔曲线,以描述P3C4刺激后p38或NFκB活性细胞比例的剂量反应(图4B),并确定了提供NFκB和p38反应细胞半最大百分比的配体浓度(图4C)。激活p38所需的P3C4剂量比激活NFκB高6.7倍,证实了不同的剂量反应。作者推测NFκB和p38的剂量反应差异并不适用于所有刺激。事实上,作者观察到了刺激特异性剂量反应差异:p38半最大活性时的TNF浓度是NFκB的12.9倍;对于LPS,是8倍,对于CpG,是2.6倍。(与流式细胞术或基于蛋白质印迹的测量相比,KTR对低TNF剂量(0.1 ng/ml)的敏感性略有下降,这可能会影响TNF的剂量反应(见图1E-G))。因此,作者证实了先前报道的NFκB和p38对LipidA的剂量反应差异也可以在其他免疫刺激中观察到。
基于不同的剂量反应,人们可能会假设,与单独包含在p38或NFκB活性中的剂量信息相比,p38和NFκB之间的组合信号将增加刺激剂量之间的可区分性。为了研究这个问题,作者首先训练了仅基于p38、NFκB或两者“总活性”的四种刺激剂量反应的机器学习分类器。这导致基于p38活性的分类器对所有四种刺激剂量的分类准确率较低(0.28-0.37),而使用NFκB活性的分类准确率略高(0.4-0.47)(图4D)。同时使用p38和NFκB总活性进行分类可进一步提高分类准确率(0.46-0.51)。然而,当使用所有动态特征而不是仅使用“总活性”对刺激剂量进行分类时,与仅使用NFκB特征或仅使用p38特征相比,结合使用p38和NFκB特征并不能始终提高刺激分类的准确性(分别为0.62-0.75和0.6-0.74以及0.47-0.61)(图4D)。单独使用NFκB特征或单独使用p38特征相比,分类准确率并未持续提高(分别为0.62-0.75与0.6-0.74和0.47-0.61)(图4D)。同样,在相互信息计算中,p38和NFκB的组合动态特征提供的剂量信息并不比NFκB或p38单独提供的信息多(分别为1.15-1.51比特和1.2-1.5比特,以及0.52-1.07比特)(图4E)。
接下来,作者想知道p38是否有助于组合改善某些相邻剂量的二进制区分。在剂量范围内的相邻刺激剂量的二进制区分中,观察到了与全剂量范围分类类似的模式,NFκB和NFκB+p38动力学提供了类似的准确分类(图4F)。单独的p38动态特征通常提供的分类准确性低于NFκB或NFκB ,尤其是在低于或接近其激活阈值的低剂量和中剂量时,但有趣的是,在中高剂量时(例如,10与100 ng/ml P3C4)接近基于NFκB的分类的准确性(图4F)。这表明,在较高剂量下,p38可以独立提供剂量特异性信息。
由于之前的工作表明,p38在剂量感应中的作用可能是区分有害和无害的PAMP浓度,因此作者接下来试图确定如何区分模拟刺激和单个刺激剂量。与相邻剂量的分类类似,在模拟刺激与个体刺激剂量的二元分类中,NFκB和p38动态信号都能对高于其激活阈值的剂量进行高度准确的分类,其中NFκB的表现通常优于p38,两者表现差异的大小与它们对特定刺激的差异激活阈值一致。然而,它们的组合动态特征并未提高分类的准确性。
因此,虽然p38动态特征在一定程度上与剂量相关,并能准确识别中剂量和高剂量刺激,但考虑到NFκB动态特征所含信息的丰富性,当考虑所有动态特征时,它们并不能增加可用的总剂量信息。然而,当仅考虑“总活性”时,p38和NFκB途径结合使用可略微提高剂量识别的准确性。
实验结果5
异质性MAPK p38和NFκB动态特征在细胞间关联性较差
p38的激活由信号通路介导,该信号通路与NFκB共享一个受体近端信号模块。作者试图了解NFκB和p38的异质动态特征是否与单细胞群体相关。相应p38和NFκB动态特征的斯皮尔曼相关系数通常较低,即使对于高剂量配体也是如此(图5A)。有趣的是,在时间进程早期确定的特征,例如“达到半最大活性所需时间”,与LPS、P3C4和CpG呈最高但仍然适度的正相关(相关系数为0.59至0.74)(但与TNF呈弱相关,为0.12),而 稍晚确定的功能,例如“最大振幅”,则表现出非常弱的相关性或无相关性(-0.08至0.11),而在时间轴上较晚确定的功能,例如“持续时间”和“总活性”,则表现出弱负相关性(-0.12至-0.23)。在刺激条件下,对NFκB轨迹的细胞身份进行重新排列后,相关系数均接近0,且很少具有统计学意义。这表明,正确匹配的数据中的弱相关性可能代表了特征之间的相关关系。作者通过计算刺激反应性p38和NFκB活动半小时积分的相关系数,研究了刺激时间进程的相关性。虽然0-0.5 h的积分呈中度正相关(0.26-0.57),但接下来的区间积分的相关系数较小或接近0(例如,1-1.5 h活动积分为-0.14-0.076 。076),然后是弱负值(3.5-4小时活动积分为-0.14至-0.19)(图5B)。
所有p38 30分钟活动积分与所有NFκB 30分钟活动积分之间的相关性证实了这一动态模式,但存在一些刺激特异性差异(图5C)。在所有四种刺激中,唯一一致的中度正相关是NFκB和p38活性在0-0.5 h之间的30分钟积分的相关性(图5C,另见图5B),而2-4 h的所有30分钟积分之间几乎一致地存在弱负相关(图5C)。同样,p38和NFκB动态特征之间的相关性也证实了这些特征之间存在弱相关性,且在时间轴上确定较晚的特征通常呈弱负相关。如图5A所示,p38和NFκB的“达到½最大活性所需时间”代表反应速度,在所有刺激下均呈适度正相关,但TNF除外。其他较弱的相关性包括:p38“达到最大活动量一半的时间”与NFκB“最大振幅”和NFκB“总活动量”(针对P3C4和LPS)以及NFκB“频率”(针对CpG)的相关性。在所有四种刺激中,NFκB“达到最大活动量一半的时间”与p38“最大振幅”呈弱负相关,与p38“总持续时间”和p38“总活动量”也呈弱负相关。特别是对于P3C4和LPS,p38的“达到总活动量一半的时间”、“持续时间”和“总活动量”与NFκB的“最大振幅”以及NFκB的“总持续时间”和“总活动量”呈弱负相关。总之,在受到不同刺激后,单个细胞中p38和NFκB的异质性活动仅在极短的时间内呈正相关,大多数动态特征显示相关性较差,而稍后的活动则显示弱负相关,这表明存在负交叉调节机制。
然后,作者使用变异系数(CV)量化了高剂量刺激下特定p38和NFκB动态特征的异质性,变异系数是一种平均标准化变异度测量指标。p38 KTR报告基因和p-p38流式细胞术产生的LPS诱导信号分布的比较显示宽度相似,表明KTR很好地代表了生物p38的异质性。在各种刺激下,p38和NFκB的大多数特征的CV通常低于或接近1,且p38和NFκB的CV通常相似。明显的例外是TNF刺激的“达到½最大活性所需时间”和“频率”,p38的CV接近2,远高于NFκB的CV(低于1)(图5D)。对不同剂量下“达到最大活性一半所需时间”、“最大振幅”和“总活性”等动态特征的异质性进行量化分析后发现,CV值通常随着剂量的增加而降低,且p38和NFκB动态特征的CV值相似,表明刺激响应动态的均值归一化异质性低于模拟诱导动态。与其他刺激相比,TNF诱导的动态变化在p38和NFκB之间通常存在更大的剂量差异。高剂量刺激下p38和NFκB在0到4小时内的30分钟活动积分的CV表现出相似的模式,p38活动的CV与NFκB的CV相似或略高。p38和NFκB CV之间的差异在较晚的时间点增加,因为0.5到1小时到3.5到4小时之间通常观察到的活动CV的增加对p38比NFκB更明显。TNF诱导的p38和NFκB CVs之间的差异最大,这是由于p38活动积分的CVs较大,而LPS的CVs最小。因此,刺激诱导的p38和NFκB动态特征存在可比水平的异质性,但在异质单细胞群中相关性较差。
实验结果6
对单细胞p38和NFκB动态进行数学建模,揭示了异质性的来源
鉴于两条途径中复杂的异质性模式,作者试图使用数学建模方法研究这些信号传导途径的已知机制是否能够解释单细胞p38和NFκB的轨迹。为此,作者将通过IKK/Tpl2/MKK3/6和通过TAK1/MKK4激活p38的新模型与一个详细的、已建立的刺激诱导NFκB激活模型(图6A)相结合。该模型的p38模块被参数化,以适应高剂量P3C4、CpG、LPS和TNF刺激后的代表性p38活性轨迹。该模型能够正确模拟实验中细胞p38动态的许多方面,这些细胞因其具有代表性的特定刺激动态而被选中(图6B,顶部)。实验测得的这些代表性hMPDM的NFκB动态与模拟的“代表性细胞”NFκB轨迹高度吻合(图6B,底部)。
参数化模型表明,激活p38的两个通路分支可能以不同的速度起作用,快速激活的MKK6分支介导p38活性的初始阶段,而MKK4分支需要更长的时间才能达到其最大模拟激活,从而将p38活性延长到稍后的时间点(图6C)。因此,预测这两个通路分支将以刺激特异性动力学激活,从而调节p38的刺激特异性。
信号传导的细胞间异质性通常可以用少数参数的异质性来解释。为了探讨这些假设是否也能解释MAPK信号传导的异质性,作者研究了其对LPS的反应。为了模拟单细胞异质性,除了分配受体和NFκB相关的参数外,激酶MKK4、MKK6和p38的总浓度从对数正态分布中采样,平均值与上面建立的“代表性细胞”模型相匹配(图6A、D)。这确实导致高度异质的模拟单细胞p38轨迹,类似于实验数据(图6E)。
接下来,作者使用参数灵敏度分析来了解p38模块中单个参数的变化对LPS诱导的p38动力学的影响。在模拟的“代表性细胞”中,增加或减少p38的总浓度分别会导致“最大振幅”和“总活性”的显著增加或减少,而响应速度(“达到½最大活性所需的时间”)不受影响。改变MKK6浓度会影响“达到最大活动量一半所需的时间”,因为随着浓度增加,达到最大振幅的时间会提前;“最大振幅”和“总活动量”虽然随着MKK6浓度的增加而增加,但不如p38的增幅大,并且随着浓度增加趋于平稳;随着MKK6浓度的增加,p38活动的第一阶段变得更加明显。相反,MKK4浓度的增加主要影响p38活性的第二阶段,该阶段变得更加明显,并导致“最大振幅”略有增加,而“总活性”则由于活性下降较慢而增加。MKK4浓度的降低仅对最大振幅产生轻微影响,因为受影响较小的第一阶段活动决定了这些参数条件下的“最大振幅”。“达到最大活动量的一半所需的时间"仅因MKK4活动量的强劲增加而延迟,因为这些增加导致第二阶段而非第一阶段的活动量达到最大振幅。同时增加MKK4和MKK6会导致p38轨迹振幅增加,且第一和第二阶段的活动量增强,从而减缓下降速度。p38浓度增加,与MKK4、MKK6或两者结合,会大大增加响应轨迹的总体振幅和相应的“总活性”,同时保持由其他两种激酶浓度决定的响应形状。当激酶浓度采样分布的均值发生变化时,在异质单细胞p38轨迹的模拟中观察到类似的模式。总体而言,该参数敏感性分析支持以下观点:MKK6和MKK4通路分支控制p38活性的第一阶段和第二阶段,而p38浓度则对响应的总体幅度有强大的控制作用。
详细研究NFκB和p38的异质响应后,作者发现,通过分配几个参数引入的分子网络异质性导致p38和NFκB活性动态在同一模拟细胞中呈弱相关。对选定的动态特征进行斯皮尔曼相关系数的测定证实了这一印象:模拟的p38和NFκB活性与实验结果高度吻合,在“达到½最大活性所需时间”方面呈中度正相关(相关系数(CC):0.63),而在“最大振幅”方面则不相关(CC:0.11)(图6F)。因此,模拟活动的半小时积分在前半小时呈中度正相关(相关系数(CC):0.51),但在接下来的两个半小时间隔内不相关(CC:0.11、0.08)(图6F)。作者的建模结果表明,实验观察到的单细胞NFκB和p38活动相关性差,实际上是分支通路结构的固有特征。有趣的是,在实验结果中呈弱负相关关系的1.5 h后的“总活性”和“30 min活性积分”在模拟数据中呈中度正相关(图6F)。这表明NFκB和p38之间存在未知的负交叉调节机制,该机制在数学模型中并未体现。
为了找到导致p38和NFκB活性之间相关性差的分子异质性的来源,作者使用常数代替采样参数值,从而消除了p38和/或NFκB模块中的噪声,并计算了p38和NFκB动态特征之间的相关性。对p38模块进行去噪对相关性几乎没有影响(图6G)。相比之下,NFκB模块的去噪处理使后期动态特征(“最大振幅”和“总活性”,相关系数:0.80、0.95)和30分钟活性积分(0-1.5小时)的相关性显著增加(相关系数:0.84-0.87),而“达到½最大活性所需时间”的相关性则没有受到影响(图6G)。积分从0到1.5小时(相关系数:0.84-0.87),而“达到最大活动量一半的时间”的相关性没有受到影响(图6G)。对两个模块进行去噪处理后,相关系数进一步增加,但“达到½最大活性的时间”除外,它仍然不受影响(图6G)。这表明异质NFκB和p38动态之间缺乏强相关性可能主要源于IκB-NFκB信号传导模块中的分子异质性。
在模拟的 LPS 反应性 p38 和 NFκB 活性中,0 至 1.5 h 之间的 30 min 活性积分的异质性(以变异系数(CV,一种平均标准化变异度量)衡量)分析显示,CV 低于 1,其中 p38 的 CV 高于 NFκB(图 6H)。在实验结果中,p38和NFκB的积分变异系数均低于1。接下来,作者分析了参数去噪对异质性的影响。正如预期的那样,对p38或NFκB模块进行去噪会缩小NFκB和p38活动值的范围,但对变异系数的影响很小(图6H)。对p38模块进行去噪仅使p38活性积分的CV值略有下降,而对NFκB模块进行去噪则使早期NFκB活性积分的CV值略有下降,但1-1.5 h积分的CV值却有所上升。同样,p38的动态特征(如“达到½最大活性的时间”、“最大振幅”和“总活性”)的CV值更高,且仅受到任一模块去噪的轻微影响(图6I)。这表明,p38和NFκB动态特征的异质性可能源于共享上游模块中的参数分布,而它们缺乏相关性很大程度上是由于IκB-NFκB信号传导模块中的参数分布。
实验结果7
MAPK p38和NFκB信号传导的非相关异质性可能导致与与门目标基因表达的双峰现象
NFκB和p38的信号动态显示单细胞异质性相关性较差(图5)。作者试图探索细胞因子表达的功能后果,细胞因子被称为NFκB和p38靶标。基于p38和NFκB动态特征之间的弱相关性,作者假设p38虽然对反应的刺激特异性贡献不大,但对巨噬细胞基因表达反应的异质性有贡献。因此,作者假设p38和NFκB控制的基因在单细胞mRNA水平上比仅受NFκB控制的基因具有更大的可变性。
为了验证这一假设的合理性,作者开发了一个数学模型,用于研究刺激诱导的NFκB和p38(与门)或仅NFκB控制的基因表达,其中NFκB活性促进mRNA转录速率,而p38活性抑制mRNA降解速率(代表p38在抑制mRNA降解中的作用,促进蛋白质TTP(图7A)。作者以四种刺激作为输入,使用实验测定的高剂量刺激诱导的p38和NFκB活性,模拟了NFκB-only或NFκB&p38控制基因在8 h内的mRNA浓度(图7B)。在所有四种刺激下,NFκB&p38控制的基因表达从1小时开始就比仅NFκB控制的基因表达更强,并且在许多时间点具有更大的mRNA值范围(图7B)。有趣的是,在某些情况下,NFκB和p38控制的基因表达的mRNA浓度分布似乎更具有双峰性,例如P3C4诱导的1 h基因表达、CpG诱导的3 h基因表达和TNF诱导的1 h基因表达(图7B)。因此,与仅受NFκB控制的基因相比,NFκB和p38控制的基因的数学基因表达模型预测了更高的变异性,并可能具有双峰性。
为了验证这一预测,作者使用靶向单细胞RNA测序技术,对包括几种细胞因子在内的一组免疫反应基因进行了测定,以确定在P3C4、CpG、LPS或TNF刺激下单细胞中mRNA水平的变化,持续时间长达8小时。细胞因子基因Il1a和Il1b被归类为受p38和NFκB控制,它们表现出刺激特异性表达时间曲线,在单个细胞中的表达范围很广,从无法检测到最大可检测表达(图7C)。相比之下,仅受NFκB控制的两个基因Nfkbia和Nfkbie在单个细胞中的表达水平分布要窄得多。在所有刺激中,Il1a和Il1b表达的范诺因子(分布方差的平均标准化测量值)在所有时间点都始终高于1,而Nfkbia和Nfkbie的范诺因子在第1、3和8小时的时间点较低或约为1(图7D,左)。双峰系数是衡量分布双峰程度的指标,在1和3 h时点,所有四种刺激下Il1a和Il1b表达的双峰系数接近0.5或更高,但在这些时点,Nfkbia和Nfkbie的双峰系数始终低于0.5(图7D,右)。
考虑到 NFκB&p38 与 NFκB 唯一基因调控策略 (GRS) 中的所有基因（通过基于文献的整理通过敲除细胞系和定量建模获得的先前发表的基因分配进行分类，NFκB&p38 GRS 中 P3C4 (NFκB: 1.27; NFκB&p38: 1.59, p = 0.011)、CpG (NFκB: 1.31; NFκB&p38: 1.58, p = 0.033) 和 LPS (NFκB: 1.33; NFκB&p38：1.59，p = 0.045），而由TNF诱导的基因表达的Fano因子（诱导较低的p38活性）在两个GRS之间的均值差异较小且在统计学上不显著（NFκB：1.26；NFκB&p38：1.39，p = 0.23）（图7E）。基因表达的Fano因子分布在1小时时没有统计学上的显著差异（图7E）。NFκB&p38 GRS中的基因在用P3C4刺激1小时时具有较高的双峰系数（p = 0.031），CpG刺激导致1小时时的双峰系数差异接近统计学意义（p = 0.058），但在8小时时无差异。
根据mRNA中是否存在ARE元素(ARE元素是p38控制mRNA稳定性调节因子TTP的结合位点)对基因进行分类,结果显示,在1 h时,含ARE基因的双峰系数高于不含ARE基因的双峰系数,且仅在CpG刺激中,这种差异具有统计学意义(p = 0.015)。在1或8 h时,含ARE和不含ARE的基因的Fano因子没有统计学差异。对含有ARE元件且据报告受p38调控的基因进行研究,发现P3C4(p = 0.035)、CpG(p = 0.0026)和TNF(p = 0.057)刺激1小时的双峰系数存在明显差异,但LPS刺激(p = 0.43)不存在差异(图7F,顶部)。在仅受NFκB控制的含ARE基因中未观察到此类差异(图7F,底部)。在各种刺激下,p38和NFκB在4 h内的单细胞30 min综合信号活动双峰系数均低于0.5,且p38和NFκB活动通常具有非常相似的较低双峰系数。这表明,非双峰p38和NFκB信号输入共同增加了NFκB和p38以及门控基因表达的双峰性。
对NFκB和p38靶基因的基因本体分析显示,与细胞因子和趋化因子活性以及受体结合相关的术语出现富集,这表明许多炎性细胞因子是NFκB和p38依赖基因(图7G)。对所有四种配体和两个GRS的基因表达结果按平均Fano因子排序,发现细胞因子基因的Fano因子往往更高,通常由NFκB&p38 GRS控制,而不是仅由NFκB控制(图7H)。总之,与仅依赖于NFκB的基因表达相比,依赖于NFκB和p38的基因表达(包括细胞因子基因)表现出更高的双峰性(主要在较早的时间点)和异质性(主要在较晚的时间点)。
