Chestnut Studying
摘要
The neonatal mammalian heart can regenerate following injury through cardiomyocyte proliferation but loses this potential by postnatal day 7. Stimulating adult cardiomyocytes to reenter the cell cycle remains unclear. Here we show that cardiomyocyte proliferation depends on its metabolic state. Given the connection between the tricarboxylic acid cycle and cell proliferation, we analyzed these metabolites in mouse hearts from postnatal day 0.5 to day 7 and found that α-ketoglutarate ranked highest among the decreased metabolites. Injection of α-ketoglutarate extended the window of cardiomyocyte proliferation during heart development and promoted heart regeneration after myocardial infarction by inducing adult cardiomyocyte proliferation. This was confirmed in Ogdh-siRNA-treated mice with increased α-ketoglutarate levels. Mechanistically, α-ketoglutarate decreases H3K27me3 deposition at the promoters of cell cycle genes in cardiomyocytes. Thus, α-ketoglutarate promotes cardiomyocyte proliferation through JMJD3-dependent demethylation, offering a potential approach for treating myocardial infarction.
新生哺乳动物心脏受伤后可通过心肌细胞增殖实现再生，但到出生后第 7 天就会失去这种潜力。如何刺激成年心肌细胞重新进入细胞周期仍不清楚。在这里，我们发现心肌细胞的增殖取决于其新陈代谢状态。鉴于三羧酸循环与细胞增殖之间的联系，我们分析了小鼠心脏从出生后第 0.5 天到第 7 天的代谢物，发现α-酮戊二酸在减少的代谢物中排名最高。注射α-酮戊二酸可延长心脏发育过程中心肌细胞增殖的窗口期，并通过诱导成年心肌细胞增殖促进心肌梗死后的心脏再生。经 Ogdh-siRNA 处理的小鼠体内α-酮戊二酸水平升高，证实了这一点。从机理上讲，α-酮戊二酸会减少心肌细胞细胞周期基因启动子上的 H3K27me3 沉积。因此，α-酮戊二酸通过JMJD3依赖性去甲基化促进心肌细胞增殖，为治疗心肌梗死提供了一种潜在的方法。
实验结果1
α-KG 促进 CM 增殖和心脏再生
由于代谢与增殖之间的紧密联系，作者利用最近发表的代谢组学数据分析了出生后第 0.5 天（P0.5，再生）和出生后第 7 天（P7，非再生）小鼠心脏的 TCA 代谢物7 。α-KG 在下调的代谢物中排名第一，酶联免疫吸附试验（ELISA）证实了这一点。为了显示α-KG 在生理上的重要性，对 P7 小鼠腹腔注射α-KG（每天 300 毫克千克-1）（连续 2 周，每天一次）。注射了α-KG 的小鼠离体 CM 中的α-KG 细胞裂解物水平升高得到证实。α-KG处理增加了心脏重量与体重之比（HW/BW），同时增加了CM中Ki67+、PH3 +和Aurkb +的表达，尽管两组的CM大小相似（图1a-c）。
除了研究α-KG对发育中心脏的影响，作者还研究了α-KG对患有心肌缺血的成年小鼠的影响。对 8 周大的 C57BL/6J 小鼠永久性结扎左前降支（LAD）冠状动脉诱发心肌梗死。此后，腹腔注射α-KG（每天 300 毫克/千克-1）2 周。左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短率（LVFS）增加，左心室扩张减少（图 2a），同时心肌梗死后 4 周梗死面积缩小（图 2b）。以及末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的 dUTP 镍端标记（TUNEL）阳性 CM 数量的减少。此外，α-KG 处理导致 CM 总数增加（图 2d），单核 CM 倍性降低（图 2e）。此外，通过小麦胚芽凝集素（WGA）染色定量，α-KG 注射小鼠在心肌梗死后 4 周的 CM 体积明显缩小，表明心脏肥大程度减轻。为了进一步显示对 CM 的增殖作用，作者使用了一个系谱追踪系统，将 CM 特异性 Myh6 MerCreMer 小鼠与双标记镶嵌分析（MADM）小鼠杂交，以检查 CM 的分裂情况（图 2f）。对单色绿色或红色 CM 的评估证实，MI 后的α-KG 处理增加了 CM 的形成（图 2g）。此外，苏木精和伊红（H&E）染色显示α-KG未引起明显的形态和病理变化。为了更具体地确定α-KG在心肌梗死后早期阶段刺激CM增殖的作用，而不是保护作用，作者在心肌梗死后7天腹腔注射α-KG（每天300毫克公斤-1），持续2周（图3a）。作者发现，α-KG 改善了心功能（图 3b），缩小了疤痕（图 3c），同时通过 Ki67、PH3 和 Aurkb 染色以及计算 CMs 总数，发现 CMs 增殖增加（图 3d、e）。同样，还观察到单核 CM 数量增加，倍性降低（图 3f）。这些数据表明，外源性补充α-KG可通过诱导CM增殖改善心肌梗死后的心脏功能。
实验结果2
α-KG 通过降低 H3K27me3 和 H3K4me3 激活细胞周期
体外实验证实了 α-KG 对 CMs 的增殖作用。通过 Ki67 染色和延时显微成像测定，α-KG 以浓度（0.1-10 mM）依赖性方式诱导离体 P1 小鼠和成年小鼠 CMs 增殖（图 4a、b）。
为了深入了解α-KG诱导CM增殖的潜在途径，作者对每天注射α-KG或磷酸盐缓冲盐水（PBS，对照组）2周的P21小鼠分离的CM进行了RNA测序（RNA-seq）分析。热图显示，与对照组相比，α-KG 处理的 CM 中有 2,095 个差异表达基因（397 个下调，1,698 个上调）（图 5a）。对上调基因的基因本体（GO）分析表明，这些基因富集于细胞增殖相关通路，包括细胞群增殖、有丝分裂细胞周期和细胞群增殖的正调控（图 5b），表明细胞周期在α-KG 刺激的 CM 增殖中起着关键作用。细胞周期基因热图进一步表明，大多数细胞周期和细胞分裂基因在 α-KG 处理后都有所增加（图 5c）。此外，基因组富集分析进一步显示，α-KG 处理导致了对 CM 增殖的动态正向调控（图 5d）。α-KG在调节细胞周期基因表达方面的作用也在体外得到了验证。如图 5e、f 所示，α-KG 增加了细胞周期基因的表达。相比之下，对下调基因的 GO 分析表明，解剖结构发育、细胞成分组织、肌肉收缩、发育成熟和细胞分化等方面的基因富集（图 5b），这与最近报道的 α-KG 抑制 CM 成熟的作用相一致。进一步挖掘与 CM 成熟相关的基因发现，大多数与结构成熟相关的基因，包括 Tnni3、Mylk2、Myh6 和 Cacna1g 在 α-KG 处理后都减少了，这一点已被实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）验证。
由于之前的一项研究表明，α-KG 可通过促进肝脏产生犬尿氨酸（KYNA）来保护缺血再灌注损伤，因此作者进一步研究了 KYNA 是否在α-KG 诱导的 CM 增殖中发挥作用。与该研究11 一致，作者也观察到用α-KG 治疗的小鼠血清 KYNA 增加。然而，使用特异性抑制剂 PF-04859989 阻止犬尿氨酸氨基转移酶（KAT）介导的 KYNA 从 α-KG 生成，并不影响 α-KG 促进心脏再生和 CM 增殖的能力，这表明 α-KG 本身可直接促进 CM 增殖，而不是通过调节 KYNA 的生成。
先前的一项研究表明，α-KG通过影响几种组蛋白赖氨酸甲基化（包括H3K4me3、H3K9me3、H4K20me3、H3K27me3和H3K36me3）来调节染色质的可及性，从而维持胚胎干细胞的多能性。通过筛选比较 P1 和 P28 心脏中的组蛋白赖氨酸甲基化，作者发现只有 H3K27me3 水平在 P28 中比 P1 心脏显著增加（图 6a），这表明 H3K27me3 可能是作者研究中组蛋白甲基化的候选对象。作者更精确地确定了发育过程中小鼠离体 CM 中 H3K27me3 水平的变化情况。H3K27me3 水平早在 P7 期就显著增加，至少在 P28 期之前一直在逐渐增加（图 6b）。此外，每天服用α-KG能明显缓解离体CM中H3K27me3的逐渐增加（图6c）。接下来，作者使用染色质免疫沉淀（ChIP）测序法（ChIP-seq）评估了α-KG是否对H3K27me3的分布有影响。在转录起始位点（TSS）周围约 2 kb 区域的启动子和基因体中，H3K27me3 被显著去甲基化（图 6d）。ChIP-seq 和 ChIP-qPCR 显示，α-KG 处理减少了细胞周期基因启动子上的 H3K27me3 富集，包括 Ccna1、Ccna2、Ccne1、Ccne2、Ccnd1、Cdk1、Cdk4 和 Cdk6（图 6e，f）。在用α-KG 处理的 P21 小鼠离体 ACM 中也发现了类似的结果。然而，作者没有发现α-KG 处理后成熟基因启动子处的 H3K27me3 有明显变化（图 6g,h）。与最近的一篇报道一致，作者还发现α-KG 处理减少了 H3K4me3 沉积以及成熟基因启动子上的 H3K4me3 沉积，包括 Atp2a2、Cacna1g、Tnni3、Myh6、Tpm1、Myl2、Jph2 和 Ryr2，但细胞周期基因启动子上的 H3K4me3 沉积没有减少。这些发现表明，α-KG 可通过减少细胞周期基因上的 H3K27me3 和成熟基因上的 H3K4me3 的富集来促进 CM 的增殖。
α-KG 是 KDM6 酶不可或缺的辅助因子，KDM6 酶包括 KDM6A（UTX）、KDM6B（JMJD3）和 KDM6C（UTY）。然而，由于 KDM6C 的 Jumonji C 结构域催化活性位点发生突变，KDM6C 不能使 H3K27me3 去甲基化13 。因此，作者研究了 JMJD3 和 UTX 在 α-KG 诱导的 CM 增殖和 H3K27me3 去甲基化中的作用。通过短干扰 RNA（siRNA）沉默 Jmjd3 而非 Utx，可阻断 α-KG 介导的 CM 增殖和 H3K27me3 去甲基化（图 7a,b），表明 α-KG 可能通过 JMJD3 影响心脏中的 H3K27me3 甲基化。本研究发现，α-KG 显著增加了 JMJD3 的活性，并略微增加了其在 CMs 中的表达。作者在 MI 模型中进一步验证了 JMJD3 的作用。在 JMJD3 抑制剂 GSK-J4 的存在下，α-KG 介导的对 CM 增殖的刺激作用被阻断，对 H3K27me3 水平的抑制作用减弱（图 7c,d）。过表达的 Jmjd3能显著提高细胞周期活性，并扩大 α-KG 诱导的 CM 增殖（图 7e），同时降低 H3K27me3 水平（图 7f），这也支持了这一假设。这些数据表明，JMJD3介导的H3K27me3去甲基化可能是α-KG刺激CM增殖的潜在机制。
除了研究α-KG对JMJD3介导的H3K27me3去甲基化的影响，作者还利用靶向代谢组学研究了给予α-KG或敲除Ogdh是否会影响CMs的代谢状态。不出所料，α-KG 处理或通过 siRNA-Ogdh 敲除 Ogdh 会增加 CMs 中的α-KG 水平。富集分析表明，与对照组相比，α-KG 和 siRNA-Ogdh 处理的 CMs 中差异表达的代谢物大多涉及氨基酸代谢和 TCA 循环。在 TCA 循环中，α-KG 处理或敲除 Ogdh 会导致几种代谢物的增加，包括顺式乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸和 α-KG。令人惊讶的是，在使用α-KG 或 siRNA-Ogdh 处理的 CMs 中，大多数氨基酸代谢产物如丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺的细胞内含量都有所增加，这表明α-KG 能提高 CMs 中氨基酸的含量。α-KG在CM增殖过程中对氨基酸水平的作用有待进一步研究。
实验结果3
敲除 Ogdh 可促进心肌梗死后 CM 的增殖
为了揭示导致成体内源性 α-KG 水平低于幼体 CM 的机制，作者利用已发表的 P1、P4、P9 和 P23 小鼠心脏的转录组测序和蛋白质组学数据，对 α-KG 生成相关途径进行了筛选。转录组和蛋白质组数据表明，异柠檬酸脱氢酶 1 (Idh1/ IDH1)、谷氨酸脱氢酶 1 (Glud1/GLUD1)、支链氨基酸转氨酶 2 (Bcat2/BCAT2) 与 P1-P9 心脏相比，P23 心脏中的异柠檬酸脱氢酶 3a（Idh3a/IDH3A）、天门冬氨酸转氨酶（Got1/GOT1）和α-KG（氧谷氨酸）脱氢酶（Ogdh/OGDH）明显上调。Idh1、Got1、Glud1 和 Bcat2 是生成 α-KG 的酶。这些酶的上调与α-KG水平的变化相反。因此，这些酶被排除在候选名单之外。特别是，Ogdh/OGDH（TCA 循环中催化α-KG 转化为琥珀酰-CoA 的酶）的 mRNA 和蛋白表达量从 P1 到 P23 逐渐增加，将其与其他上调的酶区分开来，这一点也得到了 Western 印迹的证实。OGDH 蛋白表达的逐渐增加伴随着 OGDH 活性的逐渐增加，这表明 OGDH 表达的增加可能是降低 ACMs 中 α-KG 水平的关键因素。通过 siRNA 下调 Ogdh 的表达增加了 P7 CMs 的内源性 α-KG 含量并促进了其增殖（图 8a），显示了 Ogdh 对 CMs 重入细胞周期的重要性。
在心肌梗死后立即使用血清型 9 腺相关病毒（AAV9）（1 × 10 12 病毒基因组拷贝的 AAV9-Ogdh-shRNA 或 AAV9-EGFP（增强型绿色荧光蛋白））在体内特异性敲除 Ogdh，研究了 Ogdh 下调的生理重要性。免疫荧光研究和 Western 印迹显示 AAV9-Ogdh-shRNA 感染成功。通过 AAV9-Ogdh-shRNA 敲除 Ogdh 会导致其活性降低 50%，同时心脏中的α-KG 含量和 JMJD3 活性增加，但 H3K27me3 水平降低。与这些结果一致的是，AAV9-sh-Ogdh 心脏的细胞凋亡和 CM 大小均有所减少。下调 Ogdh 能明显改善心肌梗死小鼠心脏功能的下降并缩小瘢痕（图 8b,c）。此外，在敲除 Ogdh 的小鼠中，Ki67、PH3 和 Aurkb 阳性的 CM 增多（图 8d）。作者还评估了 MI 后 AAV9-Ogdh-shRNA 和 AAV9-EGFP 对 CM 总数、成核率和倍性水平的影响。与 α-KG 处理心脏的结果一致，AAV9-Ogdh-shRNA 心脏的 CM 数量增加（图 8e）；更多的是单核细胞，倍性较低（图 8f）。这些结果表明，心脏特异性敲除 Ogdh 可增加 CM 中的α-KG 积累，从而刺激心肌梗死后 CM 的增殖和再生。
