Cell丨二甲双胍抗衰老的全面评估

长期二甲双胍治疗对灵长类动物具有老年保护作用

    为了评估二甲双胍长期治疗是否会延缓健康灵长类动物的衰老，作者进行了一项概念验证研究，研究对象是年龄在13到16岁之间的雄性猕猴（Macaca fascicularis），大约相当于人类的40到50岁。研究开始时，猴子按年龄平均分配，并随机分配到二甲双胍或药物治疗组（以下简称 O-Met 和 O-Ctrl）。O-Met 组的猴子每天服用 20 毫克/千克二甲双胍，这是人类糖尿病治疗的标准剂量，同时与 O-Ctrl 组保持相同的环境和护理条件（图 1A）。经兽医确认，O-Ctrl 组的一名参与者在研究的第 1126 天死于肾衰竭。其余的猴子坚持了 1,200 天，大约 3.3 年，相当于人类的 10 年。

    两组猴子每 3 个月接受一次常规体检（图 1A）。作者观察到，长期服用二甲双胍与血糖平衡受损无关，也不会导致体重下降。同样，作者也没有检测到血细胞组成或尿液生理特征的显著变化。
    作者还加入了另外两个对照组：年轻（3-5 岁）和中年（10-12 岁）的雄性成年猴，分别称为 Y-Ctrl 组和 M-Ctrl 组。O-Met组完成1200天的二甲双胍治疗后，作者对所有四组猴子的68项生物参数进行了分析。这些指标包括形态指标（体重指数和器官指数）、血液检查（血常规检查、血液生化检查和激素）和影像学指标（计算机断层扫描[CT]和磁共振成像[MRI]）（图 1B）。综合来看，这些结果表明二甲双胍长期治疗的安全性很高。此外，作者还注意到，与 O-Ctrl 组相比，O-二甲双胍组与衰老相关的牙周骨质流失有所缓解（图 1C）。
    为了评估记忆、学习和认知灵活性，作者采用了威斯康星综合测试装置（WGTA）法。在评估记忆保持的延迟任务中，O-Met 组与 O-Ctrl 组相比，在延迟后获取食物的准确性更高，这表明二甲双胍可能会增强老年动物的记忆力（图 1D）。此外，在物体辨别任务中，O-Met组表现出更高的学习能力，表明二甲双胍有可能提高老年动物的学习能力（图1D）。同样，在物体反转学习中，O-Met 组比 O-Ctrl 组显示出更强的认知恢复能力（图 1D）。

    当作者用核磁共振成像研究大脑形态时，一般线性混合模型（GLMMs）显示，与年轻猴子相比，老年猴子的皮层厚度减少了，尤其是在额叶和颞叶（图 1E）。与 O-Ctrl 组相比，二甲双胍治疗的老年猴额叶皮质厚度保持不变，顶叶皮质厚度有增加的趋势（图 1E）。组织学检查显示，二甲双胍能增加额叶皮层的厚度，而额叶皮层通常会随着猴子年龄的增长而变薄（图 1F）。通过使用 CHARM5 图谱将大脑细分为 88 个区域，作者发现二甲双胍治疗的猴子有 9 个区域的皮质厚度有所增加，主要集中在额叶（图 1G）。这些区域包括对认知功能非常重要的皮质区域（图 1G），即眶额皮质 (OFC)（即 10、11 和 13 区）、外侧前额皮质 (LPFC) （即 9 区）、前扣带回皮质 (ACC) （即 24a/b 区）、中扣带回皮质 (MCC) （即 24a/b 质区）和运动皮质（即、 综上所述，这些发现以及记忆和认知功能的增强表明，二甲双胍可能会延缓与衰老相关的大脑结构退化，尤其是在额叶。

二甲双胍可减轻多种组织中与衰老相关的转录波动

    为了从分子角度深入了解灵长类动物的衰老和二甲双胍干预的系统效应，作者进行了全生物体和全基因组的RNA-seq分析。作者总共分析了三种不同年龄（Y-Ctrl、M-Ctrl 和 O-Ctrl）的猴和接受二甲双胍治疗（O-Met）的老猴的 79 个组织/器官（包括神经、皮肤、内分泌、消化、生殖、免疫、呼吸、心血管、肌肉、泌尿和骨骼系统）（图 2A）。首先，作者使用 Mfuzz c-means 聚类进行了时间排序分析，以剖析年龄依赖性转录动态。该分析显示了四个不同的群组：群组 1 持续上调（U），群组 2 持续下调（D），群组 3 初期上调，随后下调（UD），群组 4 初期下调，随后上调（DU）（图 2B）。U群中的基因主要与先天性免疫反应和炎症反应有关，而D群中的基因则涉及细胞外基质组织和发育过程，反映了衰老过程中组织维护和再生能力的下降（图2B）。

    接下来，作者研究了二甲双胍在组织水平上对年龄依赖性转录组变化的影响。当作者比较幼猴、中年猴和老年猴（“Y-Ctrl、M-Ctrl 到 O-Ctrl”）之间以及幼猴、中年猴和二甲双胍处理过的老年猴（“Y-Ctrl、M-Ctrl 到 O-Met”）之间的变化轨迹时，作者发现二甲双胍的干预与所有四个群组中年龄依赖性转录动态变化的整体缓解有关。基因组变异分析（GSVA）表明，二甲双胍明显地挽救了 U 簇和 D 簇中基因的表达，而对其他两个簇的影响则不太明显（图 2C）。为了量化二甲双胍在缓解衰老方面的作用程度，作者计算了特定组织的 “拯救得分”。值得注意的是，二甲双胍拯救了大多数衰老组织（图 2D），在 11 个系统的 79 个组织中，额叶、皮肤、肝脏、肾脏、股四头肌和肺等组织获得的拯救分数最高（图 2D）。当作者使用 GSVA 在通路水平上描述衰老拯救时，作者发现二甲双胍治疗与衰老相关的炎症反应、细胞凋亡、纤维化和活性氧（ROS）通路的抑制有关（图 2E、2F）。相反，二甲双胍治疗会重新激活通常参与发育和形态发生的衰老抑制通路，包括 Wnt 信号转导、脂质代谢和 DNA 修复通路（图 2E和 2F）。总之，作者的综合图谱捕捉到了组织转录特征，揭示了二甲双胍在灵长类动物中发挥的全面老年保护作用。

二甲双胍可减轻各种组织的衰老特征

    为了验证作者的研究结果，作者进行了全面的组织学评估，重点是衰老的典型特征，尤其是在救治分数较高的组织中。作者的初步观察结果表明，服用二甲双胍可减少衰老细胞的聚集，这体现在O-Met组与O-Ctrl组相比，肺、肝、肾（包括皮质和髓质）、心脏、胃和皮肤等组织中p21阳性细胞减少（图3A）。此外，与 O-Ctrl 组相比，二甲双胍治疗可减少肺、肾和心脏中与衰老相关的纤维化区域的扩大（图 3B）。同样，二甲双胍治疗也减轻了泌尿系统中与衰老相关的脂质过氧化物的积累（以 4-羟基壬烯醛（4-HNE）为标志）。此外，在O-Met猴组织中，二甲双胍还能有效纠正与衰老相关的表观遗传不稳定性指标，如H3K9me3的缺失和内源性逆转录病毒（ERV）蛋白表达的上调。此外，二甲双胍还能抵消骨骼肌衰老的一个关键指标--快II纤维的减少。

    令人震惊的是，作者发现二甲双胍对抑制慢性炎症有广泛而有效的作用，慢性炎症是衰老的主要标志，几乎是所有衰老相关疾病的基础。作者还注意到，二甲双胍治疗与衰老相关分泌表型（SASP）因子（包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)、S100钙结合蛋白 A8 (S100A8)和基质金属蛋白酶 9 (MMP9)）的升高减弱有关（图 3E-3G）。总之，作者的研究结果表明，二甲双胍能有效减少灵长类动物衰老特征的出现，包括组织变性和炎症。

二甲双胍降低多组学生物年龄

    为了量化二甲双胍诱导的生物年龄减速，作者基于多组学数据建立了猴子衰老时钟的计算模型。除了泛组织转录组图谱外，作者还获得了DNA甲基化图谱，为转录拯救得分最高的组织构建了DNA甲基化时钟。此外，作者还利用质谱技术生成了定量血浆蛋白质组学数据集和代谢组学特征。通过整合 Y-Ctrl、M-Ctrl 和 O-Ctrl 组群（共 36 只猴）的数据，作者建立了一个惩罚性线性模型。通过该模型，作者可以估算出每只猴子的生物年龄，并计算出 ΔAge 即预测的生物年龄与该测量值对猴子实际年龄的期望值之间的差异。为此，作者采用ElasticNet方法量化了每只猴子的生物年龄指标，包括DNAmAge（基于DNA甲基化）、transcriptAge（基于转录组）、proteinAge（基于蛋白质组）和metabAge（基于代谢组）（图4A）。

    据此分析估计，服用二甲双胍后，治疗猴的蛋白质年龄平均重置了-6.41岁（图4B）。在转录组衰老显著恢复的组织中，DNAmAge也得到了恢复，包括额叶、肺、肾脏（皮质）、肝脏和皮肤，其平均恢复时间分别为-6.10、-5.11、-4.90、-3.95和-2.65年（图4C）。鉴于这些数据，作者研究了二甲双胍在转录组水平上对各组织生物年龄的影响。作者的分析表明，所有十三种组织的转录本年龄都恢复到了年轻状态，包括跟腱（ΔAgeDiff -5.31岁）、肝脏（ΔAgeDiff -4.14岁）、支气管（ΔAgeDiff -3.71岁）、肌肉（ΔAgeDiff -3.56岁）和肺（ΔAgeDiff -3.40岁）（图4D ）。总之，作者的研究结果表明，二甲双胍干预可延缓不同组织和不同肿瘤层的衰老，生物年龄的测量也证明了这一点。

二甲双胍可延缓老龄猴的肝脏衰老并增强肝脏保护功能

    肝脏作为一个代谢器官，其 DNAmAge（ΔAgeDiff 约为 -3.95岁）和转录物年龄（ΔAgeDiff 约为 -4.14岁）都出现了二甲双胍相关的大幅下降（图 4C和 4D）。为了更精确地分析二甲双胍的干预效应，作者对 Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl 和 O-Met 组的肝脏样本进行了 snRNA-seq 分析（图 5A）。

    随后，作者利用从青年到中年再到老年的 snRNA-seq 数据，开发了 “单核转录组衰老时钟”（sn-transcriptAge），在细胞类型水平上描述衰老和衰老减速的特征。首先，作者通过比较 Y-Ctrl、M-Ctrl 和 O-Ctrl 队列中任何两组的差异表达基因（DEGs），以|log2(fold change)| > 0.25 和调整后p值 < 0.05 为临界值，将其定为年龄依赖性 DEGs。利用这些衰老 DEGs 的表达矩阵作为输入数据，并将每只猴子的年代作为训练标签，作者采用 ElasticNet 模型构建了单核衰老时钟，并利用留一（LOO）交叉验证技术对该模型进行了改进，以提高其预测精度。通过将所有细胞类型的数据点组合到一个奇异的输入矩阵中，作者建立了一个综合模型，预测二甲双胍治疗可使肝脏平均年轻4.28岁（图5B）。值得注意的是，三种特定类型的细胞--肝细胞、Kupffer 细胞和 T 细胞--表现出了明显的年轻化拯救效果，它们的 sn-transcriptAge 平均回归年龄分别为 5.83 年、6.66 年和 6.43 年（图 5B）。

    与 Y-Ctrl 和 M-Ctrl 组相比，二甲双胍治疗显著恢复了 O-Ctrl 组持续上调（U 组）或下调（D 组）基因的表达。总体而言，二甲双胍挽救了约 33.9% 的 U 组 DEGs 和 21.2% 的 D 组 DEGs。更具体地说，不同的细胞类型与不同的拯救效果相关，具有边缘促衰老效应。基因功能注释显示，D群基因主要参与肝细胞的基本代谢功能，包括脂质转运（如ABCA9、HACL1和SLC22A7）和脂质分解（如HACL1、CYP4F12和PNPLA3），以及氨基酸分解（如ARG1、GNMT和SHMT1）。这些结果表明，二甲双胍治疗可以缓解衰老引起的肝脏代谢损伤。相比之下，U 组基因则富集在免疫反应（如LBP、C4BPA 和C4BPB）和转化生长因子-β（TGF-β）通路（如 SMAD3、TGFBR1 和 TGFBR2）等通路中、O-Met 猴 U 组基因的抑制与炎症和纤维化状态的减轻有关。

    当作者对获救的 DEGs 比例和 Augur 评分（评估每种细胞类型对特定治疗敏感性的指标）进行排序时，作者发现 Kupffer 细胞、肝细胞和 T 细胞是前三种获救的细胞类型，这与作者的生物年龄估计一致。此外，与衰老相关和获救的大量 RNA-seq DEGs 主要归因于肝细胞的转录变化，突出了它们在衰老和通过二甲双胍治疗缓解衰老中的关键作用。同样，基因表达轨迹显示，二甲双胍治疗后，肝细胞特异性 U 和 D 群基因的表达强健地恢复到了年轻状态。具体来说，O-Met 组中指示肝细胞衰老的通路包括炎症反应（如CRP、LBP 和SERPINA3）和脂质代谢（如ABCB11、HACL1 和SCP2），已恢复到类似 Y-Ctrl 而非 O-Ctrl 的状态。与生物信息学分析一致，组织学分析证实，最近被确定为衰老生物标志物的脂蛋白颗粒成分--载脂蛋白 E（APOE）的表达增加，已恢复到年轻状态。通过油红 O 染色，作者验证了与年龄相关的脂滴异常积聚在 O-Met 组中得到缓解。此外，二甲双胍还降低了肝脏老化过程中升高的 TNF-α 水平和纤维化。总之，这些结果表明二甲双胍可能通过增强肝细胞的代谢功能来保护肝功能。

二甲双胍能延缓老年猴的大脑衰老并提供神经保护

    由于二甲双胍治疗后大脑结构和功能得到了改善，并且考虑到额叶在DNAmAge中表现出了最显著的拯救作用（图4C），作者的下一步是探索二甲双胍对额叶的老年保护作用。采用与肝脏相同的方法，作者对所有四组猴子的额叶样本进行了 snRNA-seq 分析（图 5C）。与肝脏 snRNA-seq 分析一样，作者对 ElasticNet 模型进行了训练，以评估额叶的综合转录组图谱（图 5D和 5E）。有趣的是，作者发现二甲双胍治疗后，大多数细胞类型都恢复到了更年轻的阶段，表现出sn-transcriptAge的减少。通过将所有细胞类型的数据整合到一个统一的模型中，作者可以确定二甲双胍治疗后猴子的额叶平均延长了 5.90 年（图 5D）。随后，在抑制性神经元（InN）（ΔAgeDiff -5.59岁）、兴奋性神经元（ExN）（ΔAgeDiff -5.45岁）以及小胶质细胞（ΔAgeDiff -6. 86岁）、少突胶质细胞（OL）（ΔAgeDiff -6.79岁）、星形胶质细胞（ΔAgeDiff -6.08岁）和少突胶质祖细胞（OPC）（ΔAgeDiff -5.70岁）（图5E）。

    二甲双胍治疗明显缓解了所有四个群（U、D、UD 和 DU）和细胞类型的基因抑制，这与生物年龄的缓解一致。在 O-Met 猴中，对随衰老而持续增加的 U 簇中的衰老 DEGs 进行了分析，发现它们分别被拯救了 30.1%，而随衰老而持续减少的 D 簇中的 DEGs 则被拯救了 28.0%。基因本体（GO-term）分析表明，在ExN、InN、OL、OPC、小胶质细胞和星形胶质细胞中，对神经元功能至关重要的基因，如树突形态发生/延伸和突触组装（如GSK3B、GRID2和NRG3），在衰老过程中被下调，但二甲双胍治疗后被恢复（图5F）。相比之下，衰老过程中上调的通路，包括免疫反应激活、补体激活和 TGF-β 受体信号通路调控，在二甲双胍治疗后被重置到较低水平（图 5F）。作者还研究了二甲双胍是否会加剧衰老 DEGs 的表达变化，从而产生潜在的副作用，结果发现，snRNA-seq 在所有细胞类型中捕获的促衰老 DEGs 数量非常有限，这表明二甲双胍在此剂量下的促衰老影响可能是可控的。实验证明，二甲双胍治疗后，与大脑衰老和神经退行性疾病进展相关的标记物恢复到了与年轻猴子相似的水平。这包括 SA-β-gal 阳性细胞的减少、p-Tau (T181) 的积累以及 MMP9 等促炎因子的减少（图 5G）。此外，作者还观察到，作为老龄猴特征的髓鞘厚度减少，在二甲双胍治疗后重建为年轻状态（图 5G）。

    接下来，Augur 评分评估显示，二甲双胍诱导的 ExN 老年保护作用最为明显（图 6A）。鉴于 ExN 在认知功能中的关键作用，作者对额叶 ExN 进行了深入分析（图 6A-6C）。基因组富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）表明，二甲双胍治疗可恢复通常随衰老而下调的通路，如突触膜粘附、树突形态发生和神经发生（图 6B）。此外，二甲双胍还上调了与神经元保护相关的基因，这些基因通常会随着衰老而被抑制。相反，与神经元衰老和凋亡相关的基因则被二甲双胍下调（图 6C）。一系列组织学检测进一步证实了这些结果，为二甲双胍的神经保护作用提供了令人信服的证据。具体来说，二甲双胍可降低 SPiDER-β-gal 阳性神经元的比例，并减轻核包膜完整性的丧失（图 6D和 6E）。此外，二甲双胍还能减轻神经元内的异常蛋白积累，这表现在侵袭体和淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块的减少（图 6F）。二甲双胍还能促进神经元再生和突触连接，树突的伸长证明了这一点，这是神经元结构可塑性和功能能力的一个关键方面（图6G）。此外，在特别容易衰老的海马区，作者检测到小胶质细胞（一种与多种神经退行性疾病和衰老有关的细胞类型）的聚集减少，神经元核膜完整性得到恢复（图 6H）。此外，二甲双胍还增加了海马区神经前体的活性（图6H）。这些结果共同表明，二甲双胍通过对抗与衰老相关的细胞改变，提供了全面的神经保护，抵御衰老的有害影响。

二甲双胍以 Nrf2 依赖性方式自主缓解神经元衰老

    随后，作者利用已建立的人胚胎干细胞（hESC）衍生神经元体外模型来评估二甲双胍潜在的老年保护作用。 低剂量二甲双胍（5 μM）治疗 15 天可缓解神经元衰老指标，包括降低 SA-β-gal 活性、减少侵袭体和 Aβ 积累、降低 IL-6 表达和恢复层粘连 B2 水平（图 7A-7C）。这些发现表明，二甲双胍可通过细胞自主机制延缓人类神经元的衰老。

    在评估二甲双胍潜在下游效应因子的蛋白质水平时，作者观察到二甲双胍治疗恢复了核因子红细胞衍生 2-like 2（磷酸化 Nrf2）的活性形式，这是细胞抗氧化反应的关键调节因子，通常在神经元长期培养过程中会减少。二甲双胍处理会导致核磷酸化的 Nrf2 增加，并伴随着 Nrf2 靶基因如HO-1、NQO-1、SOD3、GPX2 和GPX1 的上调，而这些基因在人类神经元（hNeuron）衰老过程中通常会被抑制和下调（图 7D、7E）。同样，二甲双胍处理降低了脂质过氧化产物 4-HNE 的表达和 ROS 水平，表明与 O-Ctrl 组相比，O-Met 组织的氧化应激水平较低（图 7F）。此外，二甲双胍诱导的 h 神经元基因表达变化在体内也得到了部分反映。作者观察到，二甲双胍处理后，衰老的 hNeurons 中线粒体基因表达或 mtDNA 含量没有明显变化。这些结果表明，Nrf2活性的升高可能介导了二甲双胍对灵长类神经元的老年保护作用。

    为了验证作者的假设，作者采用了两种方法操纵 Nrf2 在 h 神经元中的活性。首先，作者使用小干扰 RNA（siRNA）敲除 Nrf2（图 7G），导致活性 Nrf2 及其靶基因的核水平降低，即使在二甲双胍存在的情况下也是如此（图 7H、7J）。Nrf2 的抑制加速了神经元的衰老，而二甲双胍治疗并不能延缓衰老（图 7I和 7J）。这些观察结果表明，二甲双胍的神经保护作用至少部分取决于 Nrf2 的活性。其次，作者生成了具有 E82G Nrf2 工程变体的 hNeurons，该变体通过阻碍 KEAP1 的结合来增强 Nrf2 的激活（图 7K）。这种基因增强策略能有效激活 Nrf2 通路，表现为 Nrf2 E82G 神经元的核 Nrf2 磷酸化增强、靶基因表达升高、4-HNE 和 ROS 等氧化标记物降低，与野生型神经元形成鲜明对比（图 7L、7N）。因此，在长期培养 hNeurons 过程中观察到的细胞衰老表型得到了挽救（图 7M和 7N）。此外，Nrf2组成性激活的老年保护作用超过了二甲双胍单独使用的作用，而且当二甲双胍与Nrf2 E82G突变同时使用时，二甲双胍并没有增强这些作用（图7M和7N）。这些发现与核定位磷酸化 Nrf2 的水平一致，表明 Nrf2 通路激活是二甲双胍延缓人类神经元衰老的关键机制。与作者的体外研究结果一致，在二甲双胍处理的猴子的多个组织中也检测到了Nrf2通路的激活，包括额叶神经元（图7O、7P）。总之，二甲双胍主要通过激活Nrf2通路来延缓神经元衰老，进而延缓大脑衰老。