Chestnut Studying
摘要
The establishment of an early pro-regenerative niche is crucial for tissue regeneration. Gasdermin D (GSDMD)-dependent pyroptosis accounts for the release of inflammatory cytokines upon various insults. However, little is known about its role in tissue regeneration followed by homeostatic maintenance. Here, we show that macrophage GSDMD deficiency delayed tissue recovery, with little impact on the local inflammatory milieu or the lytic pyroptosis process. Metabolite secretome profiling of hyperactivated macrophages unveiled the non-canonical metabolite-secreting function of GSDMD. And we further identified 11,12-epoxyeicosatrienoic acid (11,12-EET) as a bioactive pro-healing oxylipin, secreted from hyperactive macrophages in a GSDMDdependent manner. Indeed, accumulation of 11,12-EET by direct supplementation or deletion of its hydrolytic enzyme Ephx2 accelerated muscle regeneration. We further demonstrated that the Ephx2 level accumulated within aged muscle. And consecutive 11,12-EET treatment rejuvenated aged muscle. Mechanistically, 11,12-EET amplifies FGF-FGFR signaling by modulating FGF liquid-liquid phase separation, hence boosting the activation and proliferation of muscle stem cells (MuSCs). These data depict a GSDMD-guided metabolite crosstalk between macrophages and MuSCs that governs the repair process, which offers new therapeutic insights for the regeneration of injured or aged tissues.
建立早期促进再生的 niche 对组织再生至关重要。依赖 Gasdermin D（GSDMD）的焦亡是各种损伤时炎性细胞因子释放的原因。然而，人们对其在组织再生和同态维持中的作用知之甚少。在这里，我们发现巨噬细胞 GSDMD 缺乏会延迟组织的恢复，而对局部炎症环境或焦亡过程几乎没有影响。超活化巨噬细胞的代谢物分泌组图谱揭示了 GSDMD 的非经典代谢物分泌功能。我们进一步确定了 11,12-epoxyeicosatrienoic acid（11,12-EET）是一种具有生物活性的促进愈合的氧脂素，它以一种依赖于 GSDMD 的方式从高活性巨噬细胞中分泌。事实上，通过直接补充或删除其水解酶 Ephx2 来积累 11,12-EET 可加速肌肉再生。我们进一步证实，Ephx2 水平在老化肌肉中累积。连续的 11,12-EET 治疗可使老化肌肉恢复活力。从机理上讲，11,12-EET 通过调节成纤维细胞生长因子的液相-液相分离，扩大了成纤维细胞生长因子-成纤维细胞生长因子受体的信号转导，从而促进了肌肉干细胞（MuSCs）的活化和增殖。这些数据描述了巨噬细胞和肌肉干细胞之间由 GSDMD 引导的代谢物串扰，这种串扰控制着修复过程，为损伤或老化组织的再生提供了新的治疗思路。
实验结果1
GSDMD 基因敲除损害组织修复
心脏毒素（CTX）诱导的急性肌肉损伤是一种典型的自限性无菌损伤模型，可用于探索组织再生过程，该过程由一系列严格调控的事件组成，包括最初的炎症反应和肌肉干细胞（MuSCs）的激活，以及随后炎症的消退和MuSC的增殖与分化。为了确定骨髓表达的 GSDMD 在组织再生中的作用，作者产生了 Gsdmdf/f-Lyz2-cre （Gsdmd CKO）小鼠。Gsdmd 缺乏并不影响处于平衡状态的 MuSC 数量，但却显示出修复过程的延迟，表现为再生肌肉中坏死区和再生区的持续存在（图 1a-c），以及再生后期新生肌纤维横截面积（CSA）的减少（图 1d,e）。同样，Gsdmd CKO小鼠的肌肉在7 dpi时含有更多的早期再生肌纤维（eMyHC+）（图1f,g），表明肌肉愈合过程减弱。而在巨噬细胞耗竭后，Gsdmd f/f和Gsdmd CKO小鼠的肌力和新生肌纤维CSA的再生过程相当。这些数据表明，GSDMD 在肌肉损伤期间的促进再生作用主要依赖于肌肉内巨噬细胞群。
损伤期间肌肉的再生依赖于激活静止的 MuSCs，使其上调肌生成活性程序，并连续表达 Pax7、MyoD 和 MyoG。与再生延迟表型一致，Gsdmd CKO 小鼠显示这些基因程序的 mRNA 水平下降（图 1h）。激活后，MuSCs 首先会发生强有力的增殖，然后退出细胞周期，要么分化并随后融合以修复受损肌纤维，要么回到静止状态。因此，免疫荧光染色显示，Gsdmd CKO MuSCs 的增殖明显减弱（图 1i、j），分化水平也随之下降（图 1i、k）。为了确定 GSDMD 与 MuSC 激活的功能相关性，作者检测了再生过程中 GSDMD 的裂解情况，发现裂解的 N 端（p30 NT）GSDMD 在 1 dpi 出现，并在 3 dpi 达到峰值，与巨噬细胞浸润相吻合。作者进一步证实，这些 GSDMD 裂解主要发生在肌内巨噬细胞中（图 1l）。同样，巨噬细胞的缺失也大大减少了全肌裂解液中 GSDMD 的裂解。此外，在再生早期（0-3 dpi），GSDMD 的缺乏并不影响巨噬细胞的急性浸润，但直到 10 dpi，巨噬细胞的浸润水平仍在持续。此外，众所周知，血管的改变对组织再生至关重要，而作者发现 GSDMD 的缺失不会改变血管密度。总之，这些数据表明，GSDMD 是最佳肌肉修复所必需的，对损伤后早期炎症生态位的建立影响较小。
实验结果2
GSDMD 对造血干细胞的功能至关重要
要成功进行组织修复，肌肉中的各种细胞类型需要依次、协调地级联作用，以启动干细胞活化、清除受损碎片、消除炎症和重建稳态。为了全面了解 GSDMD 缺乏时的肌肉再生过程，作者收集了再生早期（第 2 天）和晚期（第 10 天）的肌肉组织进行单细胞测序。经过质量控制后，作者共收集了 51,945 个细胞，涵盖 11 种主要细胞类型（图 2a）。损伤后，MuSCs 脱离静止状态，进入增殖状态，以启动再生过程。作者将损伤后的 MuSCs 分成 6 个连续状态，包括静止、早期/晚期激活、增殖、Myod1high 和终末分化的 Myog high 簇（图 2b），并进一步证实 MuSCs 的这种时间转换与其再生潜能呈负相关。接下来，作者进行了伪时间轨迹分析，发现了两种保守的 MuSC 过渡状态，对应于两种小鼠 MuSC 激活后的不同命运 （图 2c）。GSDMD 缺乏导致增殖系紊乱，早期细胞减少，同时也抑制了向末期 Myog 高细胞的分化（图 2c）。具体而言，静止状态的维持和损伤后向增殖状态的转变受到一系列信号级联的严格调控。作者发现，来自 Gsdmd CKO 小鼠的 MuSCs 显示出持续的 Notch 和 Wnt 信号传导水平（图 2d），这两种信号传导对 MuSC 的静止状态至关重要。与此相反，GSDMD 的缺乏削弱了 MuSCs 的 PI3K-AKT 和 FGFR-MAPK 通路，抑制了从静止到激活的转变，导致增殖和分化水平下降（图 2d）。此外，在缺乏 GSDMD 的肌肉中，这些关键信号级联的磷酸化水平显著降低。综上所述，这些数据表明 GSDMD 是肌肉干细胞从静止状态有效过渡到增殖状态所必需的，这对急性损伤后再生 niche 的早期形成至关重要。
肌肉干细胞的功能受到各种肌肉内细胞群的严格调控。有趣的是，作者发现 GSDMD 髓细胞条件性基因敲除对整体细胞成分影响甚微。对照组小鼠和 Gsdmd CKO 小鼠在损伤后早期肌肉内促炎免疫成分的短暂扩张是一致的（图 2a），这表明 Gsdmd CKO 可能不会直接影响肌肉损伤期间的早期肌肉内炎性 niche。
肌肉再生与从最初的炎症性微环境向后期的促进再生微环境的时间过渡有关，后者提供了大量细胞间信号分子，在损伤后的不同阶段对肌肉干细胞产生一定的调节作用。为了展示肌肉再生过程中的关键免疫细胞类型，作者分别用炎症（Inflammatory.Index）和促再生（Regeneration.Index）基因组对每种免疫细胞类型进行了功能分析。作者在所有免疫细胞类型中定义了三种高度动态的骨髓细胞群，即 Spp1 高巨噬细胞、Mrc1 高巨噬细胞和 Ccr2 高单核细胞（图 2e），它们在损伤后的急性期（从空心方形到实心圆形）上调炎症程序，而在后期（从实心圆形到实心三角形）转为促再生表型（图 2e）。基于 VISION 的富集分析进一步表明，GSDMD 缺乏并不影响这些动态髓细胞群的表型转变。轨迹分析表明，GSDMD 缺失并不影响单核细胞向巨噬细胞的分化过程，这与之前的结果一致，即 Gsdmd 基因敲除并不影响早期阶段巨噬细胞的总浸润。此外，作者还进行了细胞-细胞相互作用分析，发现 Gsdmd 基因敲除对免疫成分中最重要配体的表达几乎没有影响，这表明 GSDMD 通过已知配体-受体对细胞间相互作用的影响可能较小。总之，单细胞测序分析表明，髓鞘表达的 Gsdmd 对于再生过程中肌肉内免疫成分的时间转换可能是不可或缺的。
GSDMD 蛋白最初被确定为细胞焦亡的执行者，通过其 N 端片段寡聚形成的孔隙促进白细胞介素-1β（IL-1β）等各种促炎介质的分泌。因此，为了探究 Gsdmd 基因敲除是否会影响焦亡过程及随后促炎介质的释放，作者用 BS 3 [双（磺基琥珀酰亚胺基）乙酸酯]进行了交联实验，以检测损伤过程中肌肉内 GSDMD 的寡聚化，结果发现 Gsdmd f/f 小鼠的 N 端片段显著寡聚化，表明 GSDMD 孔隙在肌肉损伤后早期就已形成。然而，作者发现 GSDMD 缺乏并不影响 NINJ1 的寡聚，而 NINJ1 是 GSDMD N 端片段寡聚后导致质膜破裂的关键事件。这些数据表明，在肌肉再生过程中，GSDMD 孔隙的形成可能与裂解焦亡无关。此外，鉴于典型的焦亡会导致促炎介质的大量释放，作者使用灵敏的多重 OLINK 分析法系统分析了肌肉内的分泌组，其中涵盖了参与炎症、再生和应激反应的关键蛋白。在此之前，作者对常用的、高含量的细胞内标志蛋白进行了分析，以确认组织间质（TIF）成分的纯度。
根据主成分分析，作者发现早期与晚期的肌肉内分泌物组截然不同，而 GSDMD 缺乏对包括一系列促炎症和促再生因子在内的整体组织间液成分影响甚微。尤其是，Gsdmd 基因敲除并不影响间质 IL1β，而 IL1β 是最主要的焦亡释放促炎细胞因子之一。GSDMD 孔形成后焦亡的最后一步是质膜破裂，导致细胞间大分子被动释放。作者发现对照组和 Gsdmd CKO 小鼠 TIF 内的 HMGB1 水平相当。此外，基于与焦亡过程高度相关的基因，作者发现 Gsdmd 基因敲除对髓系细胞的焦亡过程影响有限，这进一步表明 GSDMD N 端片段在再生早期的寡聚化可能不会直接导致溶解性焦亡，但有可能诱发亢进状态。这些数据共同揭示了 GSDMD 在损伤后早期的促进再生作用。
实验结果3
11,12-EET 从 GSDMD 孔隙中分泌出来
考虑到 GSDMD 的促进再生能力可能较少地归因于其调节焦亡相关炎症的典型功能，作者接下来建立了一种体外条件培养基试验，以阐明 GSDMD 激活在肌肉再生中发挥关键作用背后的根本原因。为了模拟巨噬细胞在体外激活 GSDMD 而不发生溶解性焦亡时的亢奋状态，作者向细胞提供甘氨酸，以渗透保护性地维持质膜的完整性，同时允许活性通过寡聚的 GSDMD 导管。接下来，作者使用 3 kDa 纤维素膜对从对照组和 Gsdmd 基因敲除巨噬细胞中收集的上清液进行超速离心，从而分离出大部分蛋白质配体（>3 kDa）和小分子代谢物（<3 kDa）。作者发现，IL-1β（依赖于 GSDMD）、IL-6 和 TNFα（不依赖于 GSDMD）等蛋白质配体在 <3 kDa 部分的可检测性微乎其微。为了确定哪些成分能促进肌肉再生，作者接下来将收集到的上清液提供给小鼠成肌细胞。有趣的是，与基因敲除巨噬细胞的上清液相比，添加 Gsdmd WT 巨噬细胞上清液中 <3 kDa 部分的上清液可增加肌生成潜能（图 3a），肌管尺寸更大，融合水平更高（图 3b）。
基于这些结果，作者推测某些通过 GSDMD 孔主动分泌的小分子可促进肌生成。作者使用脂多糖（LPS）、nigericin（称为 LN）或 poly（dA:dT）（称为 LP）连续处理来触发 GSDMD 裂解和膜孔形成。作者利用碘化丙啶（PI）染色来标记已形成膜导管的细胞，而上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的水平则代表细胞溶解死亡的程度。为了鉴定 GSDMD 介导的真正活性（非裂解）分泌，作者再次向细胞提供甘氨酸，并使用 Gsdmd CKO 巨噬细胞作为阴性对照。不出所料，甘氨酸阻止了巨噬细胞的溶解性死亡，但对 GSDMD 孔的形成几乎没有影响，这表明巨噬细胞处于亢奋状态。因此，作者利用这两种 GSDMD 激活模型建立了一种筛选策略，在 GSDMD 孔形成后使用非靶向代谢组学系统分析分泌组（图 3c）。在不同刺激诱导的焦亡中检测到了大量代谢物。考虑到甘氨酸的补充会导致甘氨酸本身的直接积累，并有可能在作者的筛选系统中诱导出其他人工信号，作者排除了因添加甘氨酸而发生显著变化的代谢物。值得注意的是，作者检测到了一种代谢物--11,12-环氧苦辛三烯酸（EET），它以依赖 GSDMD 的方式持续富集在甘氨酸处理过的巨噬细胞的上清液中（图 3d）。
11,12-EET是由磷脂自然转化而来的二十烷酸之一。为了量化作者的非靶向代谢组学结果，作者采用了竞争性 11,12-EET 酶联免疫吸附试验，发现 GSDMD 激活会导致高活性巨噬细胞主动分泌 11,12-EET 。为了进一步验证，作者使用了二十烷酸家族的靶向代谢组学，共检测到 88 种氧脂。PCA 图显示，GSDMD 缺乏对细胞内组成的影响有限，但却导致了不同水平的氧脂素分泌组。与非靶向代谢组学一致，作者发现了一系列二十烷酸，包括 11,12-EET, 它们以 GSDMD 依赖性的方式被积极分泌（图 3e）。接下来，根据上清液中 11,12-EET 相对于细胞裂解液总量的百分比计算，作者进一步证实，GSDMD 缺乏时，11,12-EET 的释放量而非细胞总量显著减少。
随后，作者试图在体内验证这些发现。作者在 CTX 诱导损伤后的不同时间点收集了肌肉和肌肉组织的配对 TIF。将 TIF 中的代谢物与肌肉组织中的代谢物水平进行归一化处理。作者确定了急性损伤后三种不同的分泌模式：“早期分泌”（整个早期阶段分泌，1-5 dpi）、“短暂分泌”（损伤后短暂分泌）和 “晚期分泌”（晚期阶段开始分泌，5 dpi）（图 3f）。除了 11,12-EET 本身，作者还发现早期间质分泌组富含一系列类二十烷相关代谢物（图 3g）。接下来，作者收集了 Gsdmd f/f 和 Gsdmdf/f -Lyz2-cre 小鼠的 TIF，然后进行 LC-MS/MS 检测 11,12-EET。与体外数据一致，作者发现 GSDMD 缺乏会显著抑制肌肉内 11,12-EET 的水平（图 3h,i）。利用三种独立的全局策略，作者将 11,12-EET 鉴定为一种具有代表性的代谢物（图 3j），它在 GSDMD 激活时从亢奋的巨噬细胞中积极分泌。
最后，作者开始测试这种依赖于 GSDMD 的代谢物分泌是否会直接影响肌肉再生。补充 11,12-EET 可加速成肌细胞系的成肌能力。接下来，作者用 11,12-EET 以及对照组和 Gsdmd 基因敲除巨噬细胞的上清液处理新鲜分离的小鼠肌肉干细胞。11,12-EET能明显加速MuSCs活化后的形态变化，提高其成肌潜能（图3k）。此外，11,12-EET（图 3l）和对照组巨噬细胞的上清液（图 3m）都能增强 MuSC 的增殖，而对非 MuSC 成分的影响较小。
实验结果4
11,12-EET 促进组织再生
考虑到11,12-EET潜在的促进再生能力，作者接下来要证明11,12-EET水平在体内的促进再生能力。11,12-EET 的生物合成由细胞色素 P450 途径中的多种协同酶组成，因此很难通过操纵特定基因来提高 11,12-EET 的生物合成水平。然而，众所周知，可溶性环氧化物水解酶（由 EPHX2 编码）会将 EETs 水解为无生物活性的二羟基二十碳三烯酸；消减该酶会导致 EET 水平的累积。因此，作者生成了 Ephx2 CKO（Ephx2f/f -Lyz2-cre）小鼠，以评估 11,12-EET 在体内积累的影响。Ephx2 CKO 小鼠的肌肉再生速度加快，肌肉坏死和再生面积减少（图 4a,b），肌纤维分布扩大（图 4c,d），肌肉强度和重量增加。同样，Ephx2 的缺乏也促进了 MuSCs 成肌过程中的连续基因程序（图 4e），6 dpi 时 eMyHC + 早期再生肌纤维的数量减少（图 4f），表明再生过程增强。免疫荧光染色进一步证实，Ephx2髓系基因敲除加速了MuSCs的增殖能力以及MYOD和MYOG蛋白水平的顺序（图4g,h）。
为了评估 11,12-EET 积累对肌肉再生的贡献是否依赖于 GSDMD，作者将 Ephx2f/f -Lyz2-cre 小鼠与 Gsdmd f/f 小鼠杂交，产生了四种基因型，包括 GsdmdCKO Ephx2CKO、GsdmdHet Ephx2CKO、GsdmdCKO Ephx2Het 和同窝对照 GsdmdHet Ephx2Het，然后进行 CTX 诱导的 TA 肌肉损伤（图 4i）。GSDMD 的进一步消耗阻碍了在 Ephx2 CKO 小鼠中发现的 11,12-EET 积累的有益作用，在 14 dpi 时，肌纤维尺寸（图 4j-m）和肌肉重量（图 4n）均有所减少。此外，在 GsdmdCKO Ephx2 CKO 小鼠和 GsdmdCKO Ephx2 Het 小鼠之间没有观察到明显的差异。因此，服用双硫仑（DSF）（一种 GSDMD 孔形成的有效抑制剂）也能抵消 Ephx2 缺乏的促进再生效应（图 4o-q）。因此，这些结果表明，巨噬细胞释放的 11,12-EET 促进再生的潜力需要体内 GSDMD 的孔形成功能。
实验结果5
11,12-EET 可增强 FGF-FGFR 信号转导
为了探索11,12-EET如何通过上调MuSCs的成肌能力来促进肌肉再生的机制，作者分离了原代MuSCs，诱导其体外活化和连续增殖。MuSCs的活化和增殖在时间上受到严格调控。通过分析转录组数据，作者发现11,12-EET显著促进了MuSCs的活化和增殖，细胞质翻译和线粒体呼吸活性相关基因以及多个细胞周期相关基因（H3c7和H2ac10）和分化肌球蛋白基因（Myh4和Mylpf）的表达水平均有所升高（图5a,b）。此外，与静止状态相比，EET处理后的基因表达模式与活化的MuSCs呈正相关。耐人寻味的是，EET处理后的MuSCs已进入增殖状态，而对照组MuSCs在此时仍富含MAPK级联和PI3K信号（图5b），这表明11,12EET在MuSC活化过程中加速了这些信号转导。与之前的结果一致，与其他生长因子受体相比，早期活化的 MuSCs 有更高水平的表皮生长因子受体表达（Fgfr1 和 Fgfr4），这表明表皮生长因子-表皮生长因子受体轴是肌肉内可激活 PI3K-AKT-mTOR 和 MAPK 通路的主要信号之一。基于这一硅学分析，作者在 3 dpi 时直接从 CTX 损伤的 TA 肌肉中分离出 MuSCs，并发现 EET 处理确实诱导了 mTOR（p-AKT、p-P70 和 p-4EBP）和 MAPK（p-P38）信号的激活水平升高（图 5c）。因此，作者接下来要确定 11,12-EET 是否会影响上游的 FGF-FGFR 轴。令人吃惊的是，11,12-EET 直接放大了 FGF 信号，在 FGF 反应型 NIH-3T3 细胞中激活了 MAPK 和 PI3K-AKT-mTOR 通路，FGFR 抑制剂可有效抑制这种激活。相比之下，11,12-EET 对表皮生长因子-表皮生长因子受体轴的影响微乎其微。
在肌肉再生过程中，由于多种配体在肌肉内的浓度有限，需要采取一定的策略来扩大信号转导，以实现足够的促进再生过程。因此，作者利用 MuSC scRNAseq 数据对每个基因与 FGF 信号得分的相关程度进行了排序，以证明 FGF 信号放大所需的潜在细胞程序。作者发现，与较高的 FGF 信号正相关的顶级基因明显富集了细胞外结构和生长因子结合能力等基因术语（图 5d），这些术语是充分启动和转导 FGF-FGFR 信号所必需的，而且与 FGF 的生化特性密切相关。具体而言，FGF 的无序 N 端和 C 端序列有助于其寡聚化，从而为细胞膜表面的液-液相分离（LLPS）提供了足够的多价弱相互作用。因此，作者假设 11,12-EET，作为一种脂质，可能会增强 FGF 在膜表面的相分离，从而有效放大下游信号传导。作者首先使用聚乙二醇（PEG-8000）作为挤出剂，发现添加 11,12-EET 可显著增加 PEG 诱导的 eGFPFGF 液滴的形成（图 5e,f），同时溶液浊度升高（图 5g）。此外，光漂白后荧光恢复（FRAP）数据进一步表明，11,12EET 增强了 FGF 液滴的荧光恢复，表明其流动性更高（图 5h）。耐人寻味的是，11,12-EET 增强了 eGFP-FGF 培养后在细胞边缘形成的明亮凝聚物（图 5i），并提高了这些凝聚物的液态性质（图 5j）。此外，生化数据进一步证明，11,12-EET 能增强 FGF 的寡聚化，从而提高其信号转导能力。这些数据共同表明，11,12-EET 通过增强膜表面的 FGF 相分离，扩大了 FGF-FGFR 信号转导。
考虑到体外培养系统中穆氏干细胞的活化能力和增殖水平不能完全代表体内穆氏干细胞在损伤过程中的动态，作者对 CTX 损伤小鼠肌肉注射生理盐水或 11,12-EET 并同时/不同时腹腔注射 FGFR 抑制剂。作者的结果表明，11,12-EET 能有效增强体内 FGF-FGFR 信号通路的激活，而 FGFR 抑制剂能显著抑制这种激活。此外，髓系 EPHX2 缺乏诱导的 11,12-EET 生理累积也促进了 FGF-FGFR 信号级联。
作者进一步对是否经过 11,12-EET 处理的肌肉进行了单细胞测序分析。同样，作者鉴定出了 6 种连续的 MuSC 细胞类型，注射 11,12-EET 会导致损伤后分化的高 Myod 和高 Myog MuSCs 水平升高，从而加速 MuSCs 的增殖和分化。富集分析进一步揭示了11,12-EET能上调MuSCs与FGF的结合能力和下游信号级联。此外，作者还发现，11,12-EET 处理增强了 FGF 结合与 p38MAPK 级联之间的相关性，而 Gsdmd 缺乏则阻碍了这种相关性，这表明 11,12-EET 通过促进体内 FGF-FGFR 信号级联的结合能力，放大了 FGF-FGFR 信号级联。总之，作者利用生化数据和硅学数据证明，11,12-EET 通过增强 FGF 的 LLPS 来放大 FGF-FGFR 信号。
实验结果6
EET 在各种模型中促进再生
最后，作者着手阐明 11,12-EET 在体内组织修复方面的治疗潜力。肌肉注射 11,12-EET 能显著改善肌肉再生，提高肌肉重量和强度（图 6a），增大肌管直径（图 6b、c），并在 14 dpi 时减少坏死和早期再生区域（图 6d）。此外，作者还注意到，EET 处理的肌肉在再生晚期炎症消退速度加快，eMyHC + 肌纤维减少。值得注意的是，作者进一步证实 11,12-EET 的促进再生能力依赖于表皮生长因子受体。
考虑到 FGF 在角膜和皮肤损伤等各种组织再生过程中具有广泛的促进再生能力，作者接下来测试了 11,12-EET 是否能促进其他损伤模型中的组织再生。作者建立了一种角膜损伤模型，给药过量的眼用制剂苯扎氯铵（BAK）会导致干眼症状和角膜上皮损伤。11,12-EET 滴眼液治疗可显著降低角膜荧光素钠染色（表明上皮受损）（图 6e），同时改善泪液分泌量和泪膜稳定性等临床表现（图 6f）。病理分析进一步显示，11,12-EET 治疗可改善角膜增厚，并减少晚期炎症细胞浸润，而炎症细胞浸润会阻碍角膜再生，导致角膜纤维化和其他并发症。耐人寻味的是，11,12-EET 能显著提高 KRT14 + 角膜缘祖细胞的增殖水平，表明角膜上皮再生能力增强（图 6g,h）。此外，在皮肤打孔活检诱导的皮肤损伤模型中，局部注射 11,12-EET 也能显著提高伤口闭合率（图 6i,j），同时局部基底表皮祖细胞的 Ki67 信号升高（图 6k）。同样，在紫外线诱导的皮肤损伤模型中，11,12-EET 处理可显著减轻羽扇肿胀，并减少白细胞浸润。
虽然与年龄相关的组织再生能力下降是多因素造成的，但作者想知道 11,12-EET 是否与年龄相关的修复缺陷有生理关联。令人惊讶的是，作者发现老化肌肉中 EPHX2 升高（图 6l），导致肌肉内 11,12-EET 水平下降（图 6m）。因此，作者给老龄小鼠肌肉内补充 11,12-EET 或对照，每 3 天一次，持续 15 个周期（图 6n）。虽然补充 11,12-EET 能适度减轻老化引起的纤维化，但它能显著恢复老化肌肉的活力，使肌肉重量和强度增加，肌纤维分布更广（图 6n,o）。这些有利影响可能是由于 11,12-EET 的局部浓度升高导致卫星细胞池扩大（图 6p,q）。在这些小鼠数据的基础上，作者利用公开数据集分析了人类老化肌肉中 EPHX2 的表达，发现 EPHX2 的水平随着年龄的增长而升高（图 6r），这进一步表明 11,12-EET 的积累也可能与人类肌肉老化的生理相关。最后，作者开始证明 11,12-EET 是否能促进人类肌肉干细胞的增殖。作者收集了人类回肠造口术后产生的肌肉碎片，并进行了 hMuSCs 分离（图 6s）。与小鼠肌肉干细胞的数据一致，作者发现 11,12EET 处理能显著提高这四种样本中 hMuSCs 的增殖能力（图 6t,u），从而加强了 11,12EET 促进人类肌肉再生的治疗潜力。总之，作者利用多种损伤模型和人体数据表明，从 GSDMD 孔中释放的代谢物 11,12-EET 具有普遍的促进修复潜力，并能使老化肌肉恢复活力。
