Chestnut Studying
摘要
Caspase-8-dependent pyroptosis has been shown to mediate host protection from Yersinia infection. For this mode of cell death, the kinase activity of receptor-interacting protein kinase 1 (RIPK1) is required, but the autophosphorylation sites required to drive caspase-8 activation have not been determined. Here, we show that non-canonical autophosphorylation of RIPK1 at threonine 169 (T169) is necessary for caspase-8-mediated pyroptosis. Mice with alanine in the T169 position are highly susceptible to Yersinia dissemination. Mechanistically, the delayed formation of a complex containing RIPK1, ZBP1, Fas-associated protein with death domain (FADD), and caspase-8 abrogates caspase-8 maturation in T169A mice and leads to the eventual activation of RIPK3-dependent necroptosis in vivo; however, this is insufficient to protect the host, suggesting that timely pyroptosis during early response is specifically required to control infection. These results position RIPK1 T169 phosphorylation as a driver of pyroptotic cell death critical for host defense.
研究表明,依赖半胱天冬酶-8的焦亡可保护宿主免受耶尔森菌感染。对于这种细胞死亡方式,受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)的激酶活性是必需的,但驱动半胱天冬酶-8活化的自磷酸化位点尚未确定。在此,我们证明RIPK1在苏氨酸169(T169)的非典型自磷酸化对于caspase-8介导的焦亡是必需的。T169位点为丙氨酸的小鼠极易受到耶尔森菌的感染。从机制上讲,T169A小鼠中RIPK1、ZBP1、Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)和caspase-8的复合物延迟形成,导致caspase-8无法成熟,最终激活RIPK3依赖性坏死性凋亡;然而,这不足以保护宿主,表明早期反应期间及时发生焦亡是控制感染所必需的。这些结果表明,RIPK1 T169磷酸化是焦亡细胞死亡的驱动因素,对宿主防御至关重要。
实验结果1
耶尔森菌模型刺激后,RIPK1 T169而不是典型的S166磷酸化会引发细胞死亡
作者和其他人此前曾报道,RIPK1激酶活性在耶尔森菌属细菌驱动的TLR4下游的CASP8依赖性焦亡中起着核心作用。在这种和其他RIPK1依赖性细胞死亡模式中,RIPK1的激酶活性驱动着多个残基的自磷酸化。虽然RIPK1 S166磷酸化是RIPK1激酶活性的公认生物标志物,但仅明确表明其在激酶依赖性凋亡和坏死性凋亡中发挥作用。然而,作者实验室之前的工作已经确定了一种RIPK1激酶依赖性焦亡的模型,该模型不会上调RIPK1 S166的磷酸化。这一发现,加上RIPK1激酶活性的要求,为确定在耶尔森菌诱导的细胞死亡中驱动CASP8依赖性焦亡的RIPK1磷酸化位点提供了依据。为了获得对此研究的支持，作者利用永生化的骨髓巨噬细胞 (iBMDM) 和 CRIPSR-Cas9 生成了两种敲入 RIPK1 突变细胞系，一种是用丙氨酸 (RIPK1 S166A) 替换位置 166 的丝氨酸，另一种是用天冬酰胺 (RIPK1 D138N 激酶失活) 替换位置 138 的天冬氨酸，这些细胞系来自内源性 RIPK1 基因组位点。利用这些 iBMDM，作者将 LPS 与 TAK1 抑制剂 5Z-7-oxozeaenol (5z7) 结合使用，作为 YopJ 充足耶尔森氏菌诱导死亡的模型。因此,作者发现,与B6相比,iBMDM中RIPK1的S166A替代导致死亡动力学开始延迟约1小时,但这些细胞很快达到近80%至100%的死亡程度。相反,RIPK1 D138N激酶失活的iBMDMs在死亡动力学和程度方面表现出更大的延迟,在B6后4小时开始死亡,死亡率达到40%至50%(图1A)。这表明RIPK1激酶活性所针对的其他残基对LPS/5z7诱导的死亡有重要贡献。由于LPS/5z7诱导的细胞死亡具有焦亡性质,作者比较了D138N和S166A iBMDM中IL-1β的释放,方法是先用LPS诱导前体IL-1β上调,然后进行5z7处理诱导死亡。与RIPK1激酶活性对焦亡的要求一致,与用LPS预处理并用5z7处理的B6 iBMDMs相比,RIPK1 D138N iBMDMs或使用Nec-1(RIPK1激酶活性的小分子抑制剂)时,IL-1β的释放显著减少(图1B)。相比之下,RIPK1 S166A iBMDMs上清液中的IL-1β水平与B6 iBMDMs非常相似,这进一步表明RIPK1激酶活性的不同靶标驱动了IL-1β的释放。由于RIPK1 S166A iBMDMs的焦亡和IL-1β释放与B6 iBMDMs相似,作者试图进一步描述D138N和S166A iBMDMs在LPS/5z7处理下死亡效应子活化的差异。为此,作者进行了LPS/5z7刺激的时间过程,并通过免疫印迹评估了几个半胱天冬酶的激活、GSDMD裂解以及RIPK3和MLKL的磷酸化。在RIPK1 S166A iBMDMs中,CASP8、CASP3或GSDMD的激活没有显著变化,尽管在RIPK1 D138N系中,这三种酶的激活都被延迟或抑制。RIPK1 S166A突变细胞中观察到的最大变化似乎是这些细胞无法发生RIPK3依赖性坏死性凋亡,RIPK3磷酸化缺失和坏死性凋亡典型执行者MLKL的下游磷酸化证明了这一点(图1C)。综上所述,S166A iBMDMs对LPS/5z7治疗的敏感性、它们对LPS/5z7的反应分泌IL-1β的能力以及它们激活TLR4下游细胞死亡效应子表明,作为耶尔森菌模型,S166的自磷酸化不是LPS/5z7处理后焦亡和IL-1β释放所必需的。
鉴于LPS/5z7诱导的焦亡需要RIPK1的激酶活性,而S166磷酸化缺失并不能显著抑制这种死亡,作者使用了一种无偏的方法来确定RIPK1可能靶向的其他氨基酸。除S166外,小鼠RIPK1在丝氨酸残基14/15和161以及苏氨酸残基169处被证明具有自磷酸化作用,而添加RIPK1抑制剂Nec-114可显著抑制所有这些反应(图1D)。为了确定这些磷酸化是否可能在CASP8依赖性焦亡中发挥作用,作者从用LPS或LPS/5z7刺激的BMDMs裂解液中沉淀出RIPK1,并通过质谱分析RIPK1特异性沉淀物。结果发现,在用LPS/5z7处理的BMDMs中,T169和S14的磷酸化水平升高,而在仅用LPS处理的BMDMs中则没有。为了进一步研究T169对CASP8介导的焦亡的必要性,作者在内源性Ripk1基因组位点169处敲入丙氨酸代替苏氨酸,从而产生T169A iBMDM细胞系。与D138N iBMDMs类似,T169A iBMDMs对LPS/5z7诱导的焦亡具有高度保护作用,并且IL-1β释放几乎完全消失,与激酶失活表型完全一致(图1E和1F)。综上所述,T169残基在CASP8介导的焦亡中的作用在体外分析中得到了有力证实,表明T169的自身磷酸化对于焦亡至关重要,从而支持进一步研究T169在耶尔森菌感染中的作用。
实验结果2
抑制RIPK1 T169的磷酸化可抑制CASP8依赖性死亡和下游焦亡,而不会改变炎症信号
为了研究RIPK1 T169自磷酸化在体内的作用,作者使用CRISPR技术构建了RIPK1 T169A敲入小鼠(图2A)。Ripk1T169A/T169A (RIPK1 T169A)小鼠按预期孟德尔频率出生,成年后未出现异常病理,表明RIPK1 T169磷酸化缺失不会干扰发育和稳态。作者首先试图证实RIPK1 T169A BMDMs表现出与B6相似的炎症特征,且该突变不会改变其炎症支架功能。B6和RIPK1 T169A BMDMs在应激性炎症反应中表现出相似的MAPK信号激活动力学,以及IκBα降解和NF-κB p65磷酸化。然后,作者试图通过用LPS或LPS/5z7刺激B6和RIPK1 T169A BMDMs 2小时并收集RNA进行批量测序分析来分析转录的变化。样本与样本之间的比较显示,在治疗组内具有极高的相关性,表明基因型似乎不是转录反应变化的主要驱动因素(图2B)。对原始测序进行主成分分析表明,样本主要按刺激分组,而非按基因型分组(图2C)。综合来看,这些结果表明RIPK1 T169A突变并未改变RIPK1在炎症信号传导中的作用。
接下来,作者想知道RIPK1 T169A突变是否会改变原代细胞在耶尔森菌模型处理下RIPK1激酶依赖性细胞死亡。为此,作者首先制作了小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs),模拟RIPK1激酶依赖性细胞死亡,并用LPS和5z7以及TNF-α和5z7刺激它们。RIPK1 T169A原代MEFs与B6 MEFs相比,在添加Nec-1后对LPS/5z7的保护水平相似(图2E)。出人意料的是,RIPK1 T169A MEFs对TNF-α/5z7的保护程度甚至高于B6 MEFs对TNF-α/5z7/Nec-1的保护程度,这表明T169处磷酸化丧失可能对这些细胞的保护程度甚至高于激酶抑制(图2E)。此外,虽然作者发现用TNF-α和环己基酰胺处理后死亡没有变化,但作者发现RIPK1 T169A MEFs在用细胞凋亡诱导剂TNF-α和线粒体衍生的caspases(smac)类似物35处理后死亡动力学降低,这与添加Nec-1后的情况类似。然而,在RIPK1 T169A MEFs中,作者观察到在TNF-α、smac模拟物和zVAD(通常诱导坏死性凋亡)处理后,细胞死亡被添加RIPK3抑制剂GSK'872显著抑制,这表明这些细胞仍然能够强烈激活RIPK3依赖性坏死性凋亡。
在体内,耶尔森菌以巨噬细胞为攻击目标,因此作者试图了解这种突变对目标细胞的影响。作者利用B6、RIPK1 T169A和Ripk1D138N/D138N(RIPK1 D138N)小鼠制备了BMDMs,这些小鼠在LPS和5z7的作用下表达RIPK113的催化失活形式。不出所料,RIPK1 D138N激酶失活型BMDMs与B6相比,动力学延迟,存活率增加。值得注意的是,RIPK1 T169A原代BMDMs对LPS/5z7的保护程度甚至高于激酶失活型细胞(图2F)。在感染Y.ptb时,BMDMs也表现出类似的抑制作用。(图2G),而加入zVAD后则被消除(图2H),表明存活率的提高依赖于半胱天冬酶。这些死亡动力学差异取决于细菌效应子YopJ的表达(图2I)。此外,RIPK1 T169A或RIPK1 D138N激酶失活小鼠的巨噬细胞在感染Y.ptb.或用LPS诱导后用5z7处理时,与B6相比,上清液中IL-1β的释放也显著减少(图2J),且IκBα降解和NF-κB p65磷酸化没有差异(图2K),表明这种变化不是由于炎症信号,而是细胞死亡激活和释放IL-1β引起的。与B6相比,感染Y.ptb.或用LPS诱导后用5z7处理后,IL-1β释放到上清液中的量显著减少(图2J),IκBα降解和NF-κB p65磷酸化没有差异(图2K),表明这种变化不是由于炎症信号,而是细胞死亡激活和释放IL-1β引起的。综上所述,这些数据表明,RIPK1 T169A突变在耶尔森菌感染模型中表现出对CASP8依赖性焦亡的强烈抑制作用,同时在体外坏死性凋亡模型中保持激活RIPK3的能力。
实验结果3
RIPK1 T169A BMDMs形成延迟死亡复合物,但不诱导半胱天冬酶裂解
为了进一步研究RIPK1 T169A抑制机制,作者比较了B6和RIPK1 T169A BMDMs在LPS或LPS/5z7处理后的半胱天冬酶激活情况。B6 BMDMs在LPS/5z7刺激2和3小时后,出现CASP8和下游效应子CASP3和CASP7的裂解;相比之下,RIPK1 T169A BMDMs的CASP8以及CASP3和CASP7几乎完全丧失活性(图3A)。鉴于CASP8向p18的成熟需要通过其与FADD和RIPK1的聚合作用和复合物进行自裂解,作者接下来评估了死亡复合物的形成。为此,作者用LPS/5z7处理B6、RIPK1 T169A和RIPK1 D138N小鼠的BMDM,用抗体通过FADD沉淀死亡复合物,并使用免疫印迹法检测RIPK1在复合物中的存在。处理两小时后，作者在B6 BMDMs中观察到RIPK1与FADD结合,这进一步证实了输入的RIPK1裂解,表明与非活性半胱天冬酶同源物cFLIPL(细胞FLICE样抑制蛋白)结合的CASP8部分激活,而CASP8在2和4小时完全成熟为p18(图3B)。与之前的报告一致,RIPK1 D138N BMDMs未显示FADD与RIPK1的结合,且RIPK1裂解片段几乎完全缺失,CASP8也未激活(图3B)。值得注意的是,RIPK1 T169A BMDMs在2小时时FADD和RIPK1的结合减少,但在4小时时增加。这与裂解的RIPK1片段的形成相吻合,但并未导致裂解和CASP8完全激活至p18片段(图3B)。
作者还证实,当这些BMDMs在体外感染Y.ptb时,也会出现类似的复合物形成动力学(图3C)。在感染Y.ptb 1小时后,作者在B6 BMDMs中观察到RIPK1与FADD复合。在输入中,作者观察到RIPK1被完全成熟为p18的CASP8切割,并在3小时后激活GSDMD形成孔状p30片段(图3C)。与作者之前发表的文章一致，这也与 ZBP1 被募集到该复合体中相吻合（图 3C）。RIPK1 D138N BMDMs未显示FADD与RIPK1或ZBP1的结合,且RIPK1裂解片段、CASP8活化或GSDMD裂解几乎完全缺失(图3C)。RIPK1 T169A BMDMs在3小时后显示FADD与RIPK1和ZBP1的延迟结合,这与裂解的RIPK138的形成相吻合,但并未导致CASP8裂解并完全激活至p18片段(图3C)。此外,RIPK1 T169A感染细胞无法形成GSDMD的活性p30片段,表明这些细胞中的焦亡受到抑制(图3C)。这些数据表明,T169的磷酸化调节复合物形成的动力学,这似乎是CASP8非经典激活和执行焦亡的关键。总之,这些结果表明,尽管T169A突变能够促进死亡复合物的形成,但它显著延迟了FADD、ZBP1和RIPK1之间的相互作用,最终抑制了CASP8的下游激活和细胞死亡,即使FADD-ZBP1-RIPK1死亡复合物成功形成也是如此。
实验结果4
T169A小鼠在体内更容易感染Y.ptb.,这对应于早期感染期间脾脏IL-1β的减少
根据作者的体外数据(图2G),与野生型和RIPK1 D138N激酶失活型巨噬细胞相比,RIPK1 T169A巨噬细胞对耶尔森菌诱导的细胞毒性具有高度耐受性。值得注意的是,这种保护并不会像RIPK1 D138N等位基因那样以抑制死亡复合物的形成为代价。这为作者提供了一个独特的模型,作者可以确定T169A小鼠中CASP8的减弱激活是否由体内其他细胞死亡模式所补偿,正如之前在其他模型中所示。为此,作者静脉注射 向B6、RIPK1 T169A和RIPK1 D138N小鼠静脉注射鼠伤寒沙门氏菌,并监测其存活情况,以体重下降15%为需要实施人道安乐死的阈值。超过80%的B6小鼠在感染后4至7天内死于Y.ptb。其中,84.2%的小鼠因体重下降15%而牺牲,10.5%的小鼠在体重严重下降之前死亡(图4A和4B)。有趣的是,RIPK1 T169A小鼠的体重减轻致死率与B6小鼠非常相似(图4B),但它们对Y.ptb.感染的易感性明显更高(图4A),在感染后3至5天内死亡,这表明缺乏焦亡细胞死亡和IL-1β的产生可能是它们在体内易感的原因。RIPK1 D138N激酶失活小鼠与RIPK1 T169A小鼠一样极易感染,并在4天内死亡(图4A)。相比之下,大多数RIPK1 D138N小鼠在体重下降15%之前就死亡了,这表明RIPK1 T169A和D138N小鼠在死亡方面的生理差异(图4B)。最后,存活率的变化与YopJ有关,因为感染了YopJ缺陷型耶尔森菌的B6、RIPK1 T169A和D138N小鼠在存活率上没有差异,都在第5天左右死亡(图4C)。综合这些数据,可以得出结论,促死亡复合物的延迟组装及其对CASP8成熟度的抑制对耶尔森菌的易感性有显著影响,这与激酶失活小鼠的情况类似,激酶失活小鼠中RIPK1激酶依赖性死亡的所有模式均被消除。这些数据进一步强调,死亡复合物组装的时间是宿主与病原体相互作用的关键因素。
为了进一步了解RIPK1 T169A动物的易感性,作者比较了感染后前三天细菌在肝脏和脾脏中的滴度(菌落形成单位[CFU]),肝脏和脾脏是细菌传播的目标。作者发现,虽然所有三个基因型在感染后的第1天和第2天的组织中CFU值相似,但感染3天后,RIPK1 D138N激酶失活小鼠和RIPK1 T169A小鼠的脾脏和肝脏中的细菌负荷与B6小鼠相比显著增加(图4D)。为了确定T169A小鼠中相对较高的细菌生长是否可能是由招募吞噬细胞所需的低水平细胞因子引起的,作者比较了在CFU出现差异的前一天即第2天对耶尔森菌感染的细胞因子反应。在第2天,所有小鼠的肝脏中细胞因子产生没有显著变化。除了RIPK1 D138N激酶失活小鼠脾脏中TNF-α的产生显著增加外,与B6小鼠相比,IL-1β、IL-6或CXCL1没有显著变化(图4E)。相比之下,RIPK1 T169A小鼠的IL-1β水平与B6小鼠相比显著降低(图4E)。作者还试图确定这些小鼠在第3天(CFU出现分化时)的脾脏中可能发生的变化。作者发现,RIPK1 T169A和RIPK1 D138N小鼠的脾脏中CXCL1水平显著升高,而RIPK1 T169A小鼠的IL-1β水平与RIPK1 D138N小鼠相比略有降低。综上所述,这些数据支持以下模型:RIPK1 T169A小鼠体内复合体II未能及时组装,导致其巨噬细胞对YopJ介导的焦亡具有相对抵抗力,无法产生足够的抗菌反应所需的IL-1β,并且随着疾病的发展,RIPK1 T169A小鼠无法控制耶尔森菌感染。
实验结果5
RIPK1 T169A小鼠在早期Y.ptb.病灶形成后,脾脏细胞死亡延迟,并迅速增加到与B6小鼠相似的级别
由于RIPK1 T169A小鼠的脾脏细菌负荷增加,IL-1β释放减弱,作者重点关注脾脏,以研究耶尔森菌感染期间细胞死亡与细菌病灶形成之间是否存在关联。作者利用表达绿色荧光蛋白的Y.ptb菌株,首先通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)染色,比较了B6、RIPK1 T169A和RIPK1 D138N小鼠在感染3天时脾脏中的细胞死亡总数。在B6小鼠中,直到第3天,B6小鼠的脾脏中都没有观察到GFP+ Y.ptb.病灶(图5A)。在第2天,这些相同的B6小鼠的脾脏出现了TUNEL+染色,这发生在细菌病灶形成之前,并在第3天进一步扩展,在TUNEL+染色附近观察到GFP+ Y.ptb.(图5A-5C)。在RIPK1 D138N小鼠的脾脏中,GFP+ Y.ptb.病灶在第2天可见,并在第3天数量大增(图5A)。这些小鼠在第2天或第3天从未观察到TUNEL+细胞数量显著增加(图5A-5C)。相比之下,RIPK1 T169A小鼠脾脏的TUNEL+细胞出现显著延迟(图5A)。在这些脾脏中,与B6小鼠脾脏相比,第2天的TUNEL+细胞显著减少,第3天出现大量TUNEL+细胞,与B6小鼠脾脏中的TUNEL+细胞数量相当。有趣的是,在TUNEL+染色延迟的第二天,RIPK1 T169A小鼠的脾脏中出现了GFP+ Y.ptb.病灶,这些病灶在第三天与新上调的TUNEL+信号相邻,且其大小显著增大(图5A-5C)。综合来看,这些数据表明,与B6小鼠相比,RIPK1 T169A小鼠的脾细胞经历延迟细胞死亡,但与RIPK1 D138N激酶失活小鼠相比,细胞死亡程度显著更高。尽管如此,RIPK1 T169A细胞死亡延迟与细菌病灶形成增加相一致,这表明正是早期细胞死亡抑制了细菌的生长,而细菌病灶形成扩大后发生的细胞死亡不足以抑制进一步的细菌负荷。
实验结果6
RIPK1 T169A小鼠在体内感染Y.ptb期间,激活脾脏中的p-MLKL,而不是CASP8
鉴于RIPK1 T169A BMDM在体外对LPS/5z7表现出近乎完全的防护,这与体内TUNEL染色延迟相关,因此确定T169脾脏在感染3天后如何启动与B6脾脏相当的细胞死亡似乎很重要。为了确定细胞死亡的机制以及正在经历这种细胞死亡的细胞,作者对未感染小鼠和感染Y.ptb. 3天的脾脏切片进行了免疫荧光染色,以观察裂解的CASP8与CD68或Ly6G的共定位。正如预期的那样,B6小鼠脾脏中CASP8与CD68的共定位非常明显,表明脾脏中的单核细胞和巨噬细胞正在激活CASP8。虽然Ly6G染色在B6小鼠脾脏中与CASP8+染色没有明显的共定位,但作者确实观察到Ly6G+中性粒细胞募集增加和中性粒细胞群的形成41(图6A-6C)。有趣的是,RIPK1 T169A或RIPK1 D138N小鼠脾脏的裂解CASP8染色均未出现显著增加(图6A和6B),表明作者通过TUNEL+染色测量的细胞死亡(图6C)与CASP8无关。在RIPK1 T169A或RIPK1 D138N脾脏中,作者也没有观察到中性粒细胞聚集,这表明细胞死亡延迟会对中性粒细胞的募集或活化产生负面影响(图6A)。为了了解RIPK T169A小鼠中观察到的死亡机制,作者研究了感染Y.ptb 3天后的小鼠脾脏裂解液中焦亡和坏死性凋亡效应子的激活情况。通过蛋白质印迹法分析B6小鼠脾脏的CASP8裂解,发现CASP8裂解程度符合预期,表明这些脾脏中CASP8依赖性死亡的正常执行(图6D)。此外,感染的B6小鼠体内磷酸化RIPK3和磷酸化MLKL水平升高,表明RIPK3-MLKL依赖性坏死性凋亡被激活(图6D)。相比之下,感染的RIPK1 T169A小鼠体内CASP8没有明显激活,表明这些小鼠没有激活CASP8依赖性焦亡(图6D)。然而,作者确实观察到RIPK1 T169A小鼠的脾脏中磷酸化RIPK3和磷酸化MLKL的增加(图6D),这表明细胞死亡机制可能从焦亡转变为坏死性凋亡。在RIPK1 D138N激酶失活小鼠中,作者没有观察到CASP8的裂解或磷酸化RIPK3或磷酸化MLKL的增加(图6D)。综上所述,这些数据强调了早期依赖CASP8的焦亡对宿主控制Y.ptb.在体内传播的重要性;然而,RIPK1 T169A小鼠形成死亡复合物的能力可能使这些细胞参与延迟的坏死性凋亡,这不足以保护这些动物免受易感性增加的影响。
