Cell Systems丨启动子 DNA 甲基化和转录因子凝聚与哺乳动物细胞的转录记忆有关

位于抑制性染色质中的合成报告基因具有转录记忆功能

    为了确定合成基因的输入-输出功能是否具有时间不变性（图 1A），作者需要一个符合几个关键标准的基因调控系统。该系统应独立于宿主生物体，合成转录因子专门调控其同源报告基因，而报告基因则编码无功能的蛋白质。此外，该系统应该是模块化的，允许组件互换，而且合成转录因子的活性应该可以由对宿主没有影响的外部物质控制诱导（以便在不受宿主潜在反馈影响的情况下量化输入-输出功能）。因此，作者选择使用基于反向 TetR（rTetR）的强力霉素（Dox）诱导系统（图 1B），该系统已被广泛用作基因调控模型系统，并符合必要的要求。

    作者首先生成了两种单克隆人骨肉瘤 U2OS 细胞系，每种细胞系都含有单拷贝的报告基因（表达融合了 RNA 干环阵列的 Citrine YFP，24×PP727），这些报告基因被整合到活性位点或相对抑制位点上（图 1B），使作者能够研究转录记忆的潜在顺式调控。同时，通过在细胞系中引入不同的 synTFs，作者可以研究转录记忆是如何被转调的。为了确认报告基因的功能是否符合染色质环境的预期，作者使用了延时成像技术来量化转录激活的速率。由于报告基因与RNA干环阵列融合，作者将PCP-3xCFP27导入细胞系，在rTetR-HSF1TAD（即rTetR与HSF1的反式激活结构域融合）的控制下监测报告基因的实时转录。作者观察到，与抑制区的报告基因相比，活性区的报告基因启动转录的速度更快。
    接下来，作者利用活细胞成像技术量化了剂量反应曲线，将细胞暴露于不同浓度的强力霉素中（以激活 rTetR-HSF1TAD），并在诱导后 72 小时测量报告基因的稳态荧光水平（YFP）。作者发现，与抑制区相比，位于活性区的报告基因对诱导剂的敏感性和最大表达水平都更高（图 1C）。此外，抑制区的希尔系数也更高（图1C）。这些结果表明，当报告基因位于开放程度较低的染色质区域时，其对强力霉素的反应变得不那么敏感，而且更加非线性。
    为了检测单拷贝报告基因细胞系中是否存在转录记忆，作者测量了无诱导和有诱导的剂量-反应曲线，并量化了各诱导剂量下的记忆（图 1D）。根据荧光信号清除的速度，两个诱导事件在时间上是分开的。记忆程度的量化方法是将有先期诱导（称为第二次诱导）条件下的稳态报告物表达水平除以无先期诱导（称为第一次诱导）条件下的稳态报告物表达水平。作者发现，对于活性区的报告基因，两条剂量反应曲线基本重叠，在所有诱导剂剂量下，记忆程度都接近于 1（即无记忆）（图 1E和 1G）。相比之下，抑制区的报告基因对中等诱导剂剂量表现出记忆，多西环素浓度在 0.001 至 0.1 ng/μL 之间时，记忆程度远高于 1（图 1F和 1G）。因此，转录记忆只对抑制区的报告基因明显，而且记忆程度与诱导剂剂量有关。值得注意的是，在较高的诱导剂水平（如 1 和 10 ng/μL）下，第二次诱导的表达水平较低，第二次诱导的剂量-反应曲线高度非单调，导致非希尔样反应函数。这种非单调的报告行为很可能发生在转录水平而非翻译水平，因为当报告位于抑制位点时，可以被激活到更高的蛋白质水平（图 1F）。非单调性可能源于高诱导剂水平下 synTF 的抑制作用，第一次诱导似乎增强了这种抑制作用。为了进一步研究在高诱导剂水平下第二次诱导期间反应降低的情况，作者测量了在 1 纳克/微升强力霉素条件下第一次和第二次诱导期间报告基因诱导的时间动态。作者发现，在第二次诱导过程中，虽然报告基因的表达达到最大值的速度比第一次诱导快，但似乎存在一种适应性反应，即表达水平先达到峰值，然后下降到一个较低水平的高点。这种适应性反应意味着存在两种可能的翻译后回路主题，一种是负反馈回路，另一种是不连贯的前馈回路，这需要进一步研究。
    通过观察剂量-反应曲线的差异，转录记忆是显而易见的，因为剂量-反应曲线在事先诱导的情况下向左移动（图 1H），表明抑制区的报告基因对诱导剂的敏感性增强（但活性区的报告基因对诱导剂的敏感性没有增强）。诱导剂的敏感性在有两个先前诱导的情况下会进一步提高。由于剂量-反应曲线提供了基因调控功能（即系统的输入-输出功能）的量化，这一结果表明转录记忆重塑了位于抑制染色质中的报告基因的基因调控。
    更广泛地说，这些研究结果表明，转录记忆可以发生在受其同源同步荧光蛋白调控的简单报告基因上，而且由于系统中没有设计转录反馈，这种记忆很可能是由转录反馈无关机制产生的。此外，由于只有抑制区的报告基因显示出记忆，转录记忆似乎是顺式依赖的，这意味着表观遗传调控的参与。

染色质环境的抑制性与转录记忆的程度有关

    转录记忆的顺式依赖性表明，靶基因的染色质环境可能在形成转录记忆方面起着关键作用。为了广泛分析染色质环境对转录记忆的作用，作者使用了大规模并行报告分析（MPRA）来同时量化许多分别整合的报告基因的转录 （图 2A）。这将使作者能够解决转录记忆如何受到潜在位置效应（顺式）的影响。为此，作者在同一 TetO 启动子控制的报告基因上附加了一个 20 nt 的 DNA 条形码。然后用 piggyBac 转座酶将得到的条形码报告质粒文库整合到野生型 U2OS 细胞中（图 2B）。然后用含有 synTF（rTetR-HSF1TAD）的慢病毒转导携带稳定整合报告基因的细胞。

    为了捕捉大多数报告基因的全部反应范围，作者将细胞暴露于广泛的强力霉素浓度范围，涵盖五个数量级。在报告基因达到稳态反应后，提取 mRNA，进行反转录，并通过二代测序进行定量。同时，对每个条形码报告基因的拷贝数和整合位点分别进行测序定量。作者进行了一项先导实验，以验证通过高通量测序可以重复量化整合到不同 DNA 位点的报告基因的基因表达量。作者总共获得了 1000 多个整合在所有染色体上的条形码报告基因的剂量反应曲线（示例见图 2C），证明了该检测方法的高通量特性，并允许作者比较基因组不同部位的报告基因的反应。
    通过分析剂量反应曲线，作者发现当报告基因整合到相对开放的区域时，报告基因对诱导剂的敏感性通常较高，这也是预料之中的（图 2D）。例如，整合到 CpG 甲基化水平相对较低区域的报告基因的 10%效应浓度（EC10）值（即灵敏度的衡量标准）较低。对另一种抑制标记 H3K9me3 也有类似的观察结果。同样，作者发现在 H3K27ac 和 H3K4me3 等活性标记水平较高的区域，敏感性更高（图 2D）。正如预期的那样，最大表达水平也因染色质状态而异，活性区域的报告者比抑制区域的报告者表现出更高的表达水平（图 2D）。此外，随着 H3K27ac 水平的降低，剂量反应曲线的非线性（以希尔系数衡量）也在增加。需要注意的是：(1) 所有的表观遗传标记都是使用相同的 U2OS 细胞系，通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）或 CUT&Tag 进行实验量化的；(2) 剂量反应曲线的参数对染色质标记的依赖性对于与同一类型染色质状态（活性或抑制性）相关的标记可能并不相同，这表明并非同一类型染色质的所有标记都以相似的方式影响剂量反应曲线； (3) CpG 数量（或 CpG 密度）的参数依赖性与开放染色质标记的参数依赖性基本相似，这与文献发现的高 CpG 密度通常与开放染色质相关；以及 (4) 与 EC50 或 EC90 相比，EC10 是比较不同基因组位点的更好的灵敏度测量值，这可能是因为 EC10 对希尔系数的同时变化不太敏感。总之，剂量-反应曲线的高通量剖析提供了对报告基因输入-输出曲线位置效应的定量洞察，为进一步分析这些曲线在先期诱导下是如何调节的奠定了基础。
    为了研究转录记忆，作者测量并比较了有无强力霉素诱导的细胞的剂量反应曲线（图 2A）。根据荧光信号清除率，两个诱导事件在时间上是分开的。通过比较在相同诱导剂剂量下整合到整个基因组的报告基因的表达水平，作者发现了记忆的证据，因为在几种诱导剂条件下，报告基因在第二次诱导期间被诱导到明显更高的水平（图 2E）。不过，需要注意的是，两次诱导之间表达水平的变化并不是衡量转录记忆的可靠指标，因为一些报告物（如图 1F中的报告物）在第二次诱导时显示出较高诱导剂水平下的表达量减少。于是，作者采用了一种更稳健的记忆测量方法，即诱导之间剂量-反应曲线的横向移动进行分析，结果证明了记忆的存在。更具体地说，作者发现 EC10 的折叠变化呈单峰分布，在 0.5 以下有一个突出的峰值（图 2F），这表明大多数报告基因在第二次诱导时对强力霉素的敏感性增强（即 EC10 下降）。这些结果共同表明，转录记忆对于受所选合成TF（rTetR-HSF1TAD）调控的报告基因是普遍存在的。
    通过分析报告基因整合位点的染色质状态，作者发现无记忆显示的报告基因（EC10 折变值超过 1 的报告基因）大多整合到了 CpG 甲基化水平较低和 H3K4me3 水平较高的基因组区域（图 2G）。相比之下，EC10 折变值在 0.5 左右的报告基因位于 CpG 甲基化水平（和 H3K9me3 水平）较高而 H3K4me3 水平较低的区域（图 2G）。与这些发现一致的是，与位于高 H3K4me3（或低 CpG 甲基化水平）区域的报告物相比，位于低 H3K4me3（或高 CpG 甲基化水平）区域的报告物最大表达水平的折叠变化更大。总之，这些结果与报告基因染色质环境的抑制性与转录记忆强度相关的情况一致。

报告基因的转录记忆依赖于 synTF 的反式激活结构域

    上述结果表明，synTF 与目的基因染色质环境之间的相互作用可能在形成转录记忆方面发挥作用。因此，作者试图通过替换 synTF 的 TAD（即使用 HSF1TAD 以外的 TAD）来研究 synTF 的作用。作者选择了合成生物学应用中常用的另外 8 个哺乳动物来源或病毒来源的 TAD，其中一些是由多个 TAD 结构域连接而成（如 VPH 和 VPR）。然后将这些合成TF 分别引入 2 个单拷贝报告细胞系（共 16 个细胞系），从而评估顺式和反式因子如何共同影响转录记忆。

    作者测量了每个含有 synTF 的细胞系的两条剂量反应曲线（无诱导和有诱导），与含有 rTetR-HSF1TAD 的细胞系类似（图 3A和 3B）。作者发现，对于活性区的报告基因，所有 synTF 几乎都没有转录记忆，因为在所有诱导剂剂量下，两个表达水平（第二次诱导与第一次诱导）之间的比率都接近于 1（变化小于 35%）（图 3C和 3D）。在研究剂量-反应曲线时，这种缺乏记忆的情况也很明显，因为所有同步荧光蛋白的两条曲线（来自第一次和第二次诱导实验）都是重叠的。与此相反，对于抑制性报告基因，在不同的诱导剂剂量范围内，几种被测试的同步荧光蛋白都有明显的记忆（即变化超过 35%），包括带有 E2F1TAD、p53TAD、VP16 和 VP64 的同步荧光蛋白（图 3C）。应该注意的是，确定是否存在记忆的阈值是基于两次诱导之间报告基因表达水平的折叠变化分布。这种记忆效应也可以从没有诱导和有诱导的剂量-反应曲线之间的横向移动中看出。对于其余的突触TFs，不同诱导剂剂量下的记忆并不明显（图3D），两条剂量反应曲线基本重叠，表明这些突触TFs总体上缺乏记忆。因此，似乎存在两种类型的 synTFs（即无记忆 synTFs 和有记忆 synTFs），根据它们对位于抑制性染色质中的靶基因所能引起的转录记忆程度来区分。需要注意的是，尽管作者使用天然 TF 的 TADs 来构建 synTFs，但在 synTFs 中观察到的记忆特征并不能固有地转移到它们的天然对应物上。

    接下来，作者试图检验无记忆 synTFs 对位于上述细胞系中使用的 ECT2 位点以外的抑制性染色质位点的靶基因是否有类似的表现。为此，作者对无记忆 synTFs 之一 rTetR-p65TAD 进行了上述高通量报告分析（图 3D）。通过分析高通量测序得到的剂量反应曲线，作者欣慰地发现，与 rTetR-HSF1TAD 相比，该检测捕捉到了 rTetR-p65TAD 增强的有效亲和力（图 3E），这与单报告基因细胞系的结果类似（图 3A和 3B）。与 rTetR-HSF1TAD 相比（图 2D），剂量反应曲线的大多数参数对染色质环境不敏感。接下来，作者比较了两次不同诱导实验中相同诱导剂剂量下整合在整个基因组中的报告基因的表达水平，结果发现没有证据表明与 rTetR-HSF1TAD 一样存在记忆（图 3F）。对剂量反应曲线横向移动的进一步分析表明，EC10 的折叠变化在 1 左右达到峰值（图 3G），表明与 rTetR-HSF1TAD 的结果相比，报告基因在第二次诱导时对强力霉素的敏感性总体上没有改变。此外，通过分析报告基因整合位点的染色质状态，作者发现位于活性位点和抑制位点的报告基因的 EC10 倍率变化相当（图 3H）。这些结果表明，对于无记忆同步荧光基因 rTetR-p65TAD，无论染色质环境如何，都能观察到报告基因总体上缺乏记忆。
    接下来，作者利用两种不同 synTF 的高通量剂量-反应数据，研究了两次诱导之间表达水平的折叠变化以及剂量-反应曲线的非单调行为（如图 1F）。作者首先关注的是第二次诱导时整个文库表达水平的变化，即基因表达水平在重复诱导过程中会受到怎样的影响（除了关注剂量反应曲线的敏感性之外）。为了便于比较相对报告表达量，作者还额外注意减少测序数据的批次效应。对于记忆合成TF、rTetR-HSF1TAD，当报告基因位点的抑制性较强时，表达量折叠变化较高，这表明第二次诱导往往会引起抑制性位点中靶基因表达量的增加。这一观察结果与作者早先的发现一致，即对于有记忆的 synTF，只对抑制性基因座中的报告基因有记忆，而对活性基因座中的报告基因没有记忆。对于无记忆同步荧光基因 rTetR-p65TAD，作者发现不同表达折叠变化的报告基因位点的表观遗传状态相似。因此，这种无记忆同步荧光基因诱导的表达折叠变化似乎不受报告基因表观遗传状态的影响，这与作者早先发现的整体缺乏记忆是一致的。
    关于非单调性，作者发现，对于有记忆突变基因 rTetR-HSF1TAD，在高诱导剂水平下，第一次和第二次诱导都有很大一部分报告物（∼65%）表现出非单调性反应。对于无记忆 synTF、rTetR-p65TAD，也有一部分报告物（∼30%）表现出非单调响应。然后，作者通过探索非单调性与表观遗传标记水平之间的潜在相关性来研究顺式依赖性，结果没有观察到显著的相关性。这些分析表明，在 YFP 剂量反应曲线（图 1F）中观察到的非单调行为（因此非希尔函数样）可能发生在转录水平，不同的 synTF 可能导致不同比例的非单调行为报告物，而这种行为的顺式依赖性需要进一步研究。
    总之，迄今为止的数据与转录记忆在顺式和反式中均受调控的情况一致。此外，这些数据还表明，转录记忆很可能来自转录因子与目标基因染色质环境之间错综复杂的相互作用，这促使作者进一步探索其中的潜在机制。

转录记忆可维持数周，并与启动子 DNA 甲基化的变化有关

    虽然抑制性染色质环境似乎促进了记忆同步荧光蛋白转录记忆的建立，但报告基因的表观遗传状态是否以及如何参与调控仍是一个未知数。为了解决这个问题，作者首先试图确定转录记忆的时间尺度，即记忆可以持续多长时间，这将有助于确定所涉及的表观遗传机制的类型。

    因此，作者对报告基因（位于 ECT2 基因座，受 rTetR-HSF1TAD 调控）进行了记忆量化实验，两次诱导事件之间的等待时间从 4 天到 30 天不等（图 4A）。通过比较剂量-反应曲线，作者发现记忆的强度在 30 天的时间过程中有所下降，前 20 天几乎没有变化（图 4B）。这种记忆的长期维持表明，一种稳定的表观遗传机制很可能已经实施。由于作者观察到转录记忆的强度（以 EC10 折数变化量化）与 DNA（CpG）甲基化水平以及高通量检测中的另一个抑制标记 H3K9me3 密切相关（图 2G），因此作者推测 DNA 甲基化的变化可能会促进转录记忆的建立、 作者推测 DNA 甲基化的变化可能促进了转录记忆的建立，因为已知 DNA 甲基化相对稳定，并被认为在转录记忆中发挥作用，而且已知 H3K9me3 与 DNA 甲基化密切相关，因为沉积 H3K9me3 的酶（如 SUV39H1 和 SUV39H2）促进了 DNA 甲基转移酶的招募。 

    为了验证这一假设，作者首先思考 synTF 诱导是否会改变靶基因的 DNA 甲基化水平。通过测量报告基因（抑制区）的 CpG 甲基化水平，作者发现 synTF 诱导明显降低了启动子区的甲基化水平，而基因体区的甲基化水平却没有降低（图 4C）。如果 CpG 甲基化水平确实与记忆有因果关系，作者预计在记忆的长期维持过程中，CpG 甲基化水平会随着记忆强度的变化而变化。通过量化上述 30 天时间过程中启动子 CpG 甲基化的情况，作者欣慰地发现，随着记忆强度的降低，CpG 甲基化水平也在逐渐增加（图 4D）。
    接下来，作者比较了两种不同类型的 synTF（有记忆 synTFs 和无记忆 synTFs）介导目标启动子 CpG 甲基化减少的能力。作者发现，与有记忆突触TF相比，无记忆突触TF在诱导前似乎会导致较低的CpG甲基化水平，而在诱导后，有记忆突触TF可以将CpG甲基化降低到与无记忆突触TF相同的水平。由于这两类synTFs介导DNA去甲基化的能力相当，因此转录记忆似乎并不依赖于synTF与启动子结合所介导的DNA去甲基化效应。因此，作者推测转录记忆可能依赖于 synTF 与甲基化启动子之间的相互作用。在这种情况下，当甲基化水平因第一次诱导而降低时，记忆 synTF 在第二次诱导时就更容易激活报告基因，从而导致激活阈值降低，即转录记忆的存在。相比之下，无记忆突触基因与启动子的结合不会受到甲基化水平降低的影响。为了验证这一观点，作者试图在第一次诱导过程中直接扰动 DNA 甲基化的降低程度，并量化这种扰动将如何改变转录记忆。
    作者首先通过改变第一次诱导的持续时间来扰动 DNA 的去甲基化程度，从而导致持续时间依赖性的 DNA 甲基化减少（图 4E、4F）。通过量化第二次诱导的剂量反应曲线并将其与第一次诱导进行比较，作者发现 DNA 甲基化水平最低的条件（细胞第一次诱导 8 天）产生的记忆程度最强，其次是 3 天和 5 天诱导条件（图 4G）。这一结果与作者的高通量检测结果一致，并支持 DNA 甲基化水平与转录记忆程度（记忆同步TF）呈负相关的观点。
    为了进一步检验 DNA 去甲基化是否与转录记忆存在因果关系，作者在第一次诱导过程中向培养液中添加了 DNA 去甲基化酶抑制剂 C35（一种通用的 TET 抑制剂），直接扰乱了 DNA 去甲基化（图 4H）。此外，还包括只添加 C35 而不添加诱导剂（强力霉素）的条件。与只添加诱导剂相比，在添加 C35 和诱导剂的同时，DNA 去甲基化的程度有所降低（图 4I）。作者推测这是由于在没有诱导剂的情况下，C35 可能无法抑制低水平的基础 DNA 去甲基化活性，因为在没有多克斯的情况下，CpG 被去甲基化的比例相对较低（即 20%）。然后，作者对相应的转录记忆进行了量化，发现 DNA 去甲基化的减少确实导致了记忆强度的降低（图 4J），这与第一次诱导过程中 DNA 去甲基化在介导转录记忆中发挥关键作用的情况一致。
    为了进一步研究 DNA 甲基化变化在介导转录记忆中的因果作用，作者试图验证启动子中的 CpG 位点是转录记忆所必需的这一假设。因此，作者构建了一种新的单克隆 U2OS 细胞系，将无 CpG 的 TRE3G 启动子驱动的改良枸橼酸报告基因整合到 ECT2 基因座中。更具体地说，TRE3G 启动子上共有 11 个 CpG 位点被突变为 CpC 或 GpG，从而驱动图 1B中描述的相同报告基因的表达（图 4K）。利用这种新的细胞系，作者在 rTetR-HSF1TAD 的调控下进行了图 1D所示的记忆实验，然后比较了无诱导和有诱导条件下的剂量反应曲线。在启动子 CpG 位点缺失的情况下，由于第二次诱导的剂量-反应曲线与第一次诱导的剂量-反应曲线几乎重叠，因此记忆在很大程度上被取消了（图 4L和 4M）。这一结果说明启动子 CpG 是建立转录记忆的必要条件。
    总之，这些数据表明，在初始诱导期间，记忆合成TF的招募导致启动子的DNA甲基化水平降低，这种降低可维持至少3周，从而使目标基因在随后的诱导中以较低的合成TF活性被诱导。与此相反，不具有转录记忆的合成TF虽然在第一次诱导过程中同样导致启动子甲基化水平降低，但在第二次诱导过程中它们与启动子的后续相互作用却不受影响，这就提出了潜在决定因素的问题。

调节转录因子的有效亲和力可塑造转录记忆

    在确定了转录记忆可以通过调节有记忆突触基因的顺式调控（即通过改变启动子DNA甲基化）来调整之后，作者接下来关注的是反式调控，解决有记忆突触基因和无记忆突触基因之间的区别。正如作者所展示的，这两种类型的同步荧光蛋白具有不同的 TAD，它们都能在招募时介导启动子 DNA 去甲基化。这些发现表明，对于无记忆 synTFs 而言，它们与基因的相互作用不受启动子甲基化状态的影响。因此，破译影响剂量-反应曲线对启动子甲基化水平敏感性的潜在因素是很有意义的。

    为了解决这个问题，作者绘制了所有九种 synTFs 的剂量-反应曲线（没有事先诱导）（图 5A）。作者发现，与有记忆的 synTFs（蓝色）相比，无记忆的 synTFs（橙色）的剂量-反应曲线整体左移，这一点在比较它们的半最大剂量（即 EC50）时也很明显（图 5B）。由此看来，合成TF 的有效亲和力（与 EC50 负相关）可能是转录记忆的决定因素。这一假设表明，与启动子有效亲和力高（即 EC50 值低）的合成TF 能够在类似程度上激活基因，而与启动子甲基化水平无关，而有效亲和力低的合成TF 则具有不同的基因激活能力，这取决于启动子甲基化水平。值得注意的是，由于所有 synTFs（有记忆或无记忆）都具有相同的 DBD（即 rTetR），因此观察到的有效亲和力差异是由 TADs 的差异造成的。

    鉴于作者之前的研究发现生物分子缩聚可有助于增强 synTFs 的有效结合亲和力，作者假设缩聚倾向可能是区分有记忆和无记忆 synTFs 的一个因素。具体来说，作者推测无记忆突触因子可能更有能力诱导生物分子凝聚。这种能力有可能使它们招募到更多的调控因子或加强与DNA的相互作用，从而增强它们的有效亲和力。为了探索这一假设，作者设计了实验来评估有记忆和无记忆合成TFs 的凝聚能力。
    作者采用了之前使用过的一种实验方法，通过将 TAD 与蓝光敏感的低聚结构域CRY240融合来鉴定 synTF 形成凝聚体的能力（图 5C）。这样做的理由是，如果 TAD 具有形成凝聚物的内在能力，那么光诱导的寡聚化将为 TAD 的凝聚或聚类提供外在触发因素。然后，作者使用共聚焦显微镜将细胞暴露在蓝光下，同时测量 CRY2 融合的 TAD（中间有 mCherry）在 180 秒内的荧光信号。请注意，作者检测了低、中、高起始 TAD 荧光水平（即 mCherry 强度）的细胞，以更系统地探索不同浓度下的 synTF 凝聚。
    作者发现，对于所有五种记忆同步荧光蛋白来说，在所研究的同步荧光蛋白荧光水平范围内，都检测不到蓝光诱导的同步荧光蛋白凝聚（图 5D）。相比之下，对于所有四种无记忆突触TF，作者可以在一种或多种突触TF荧光水平下检测到蓝光诱导的凝聚物（图 5D中的绿框表示）。这些新数据与无记忆同步荧光蛋白比有记忆同步荧光蛋白更能形成生物分子凝聚物，从而增强无记忆同步荧光蛋白的有效结合亲和力的观点一致。
    由于作者以前的研究表明，在合成TF上附加一个固有的无序结构域会增强其凝聚能力，从而提高有效结合亲和力，因此作者推测记忆合成TF可以通过附加一个固有的无序结构域而被设计成无记忆合成TF。为了验证这一假设，作者选择在 TAD 上附加一个来自 p300 的固有无序结构域（即 p300CTR），作者之前已经证明，这种结构域可以增强 synTF 的凝聚能力及其有效的结合亲和力。通过将 p300CTR 与 HSF1TAD 融合，作者发现修饰后的 synTF 如预期的那样表现出很强的凝集能力（图 5E），而且对于活性区或抑制区的报告基因，剂量反应曲线（无事先诱导）明显左移（图 5F），表明有效亲和力增强。对于抑制区的报告基因，修饰的 synTF 的 EC50 值大大降低，低于区分有记忆和无记忆 synTF 的阈值水平。使用修饰的 synTF，作者比较了抑制区报告基因的剂量-反应曲线，发现与未修饰的 synTF 相比，两种剂量-反应曲线变得更加相似，因此记忆几乎消失了（图1F-1H）。作为对照，对于开放区的报告基因，修饰的 synTF 没有观察到转录记忆（图 5G），与未修饰的 synTF 类似（图 1E和 1G）。
    通过将 FUS 的固有紊乱结构域（FUS_IDR）与 HSF1TAD 融合，对不同修饰的 synTF 也观察到了类似的结果（图 5H和 5I）。对于这种修饰的 synTF，其凝聚能力和有效亲和力都得到了类似的增强（图 5H、5I），转录记忆也被取消（图 5J）。值得注意的是，两种修饰的 synTF 在诱导抑制性目的基因时都会导致启动子 DNA 甲基化水平的类似降低，这与无记忆 synTF 早期的数据一致，而且两次诱导的剂量-反应曲线在很大程度上是重叠的，这进一步证明了无记忆 synTF 与抑制性目的基因之间的相互作用不受 DNA 甲基化水平的影响。
    总之，这些结果支持这样一种观点，即增强 synTF 的凝集能力会导致 synTF 的有效亲和力增加，从而消除转录记忆。