【文献解读】用于高通量药物发现的斑马鱼脓毒症模型的开发

文献：Philip AM, Wang Y, Mauro A, El-Rass S, Marshall JC, Lee WL, Slutsky AS, dosSantos CC, Wen XY. Development of a zebrafish sepsis model for high-throughput drug discovery. Mol Med. 2017 Jul;23:134-148. doi: 10.2119/molmed.2016.00188. Epub 2017 Jun 7. PMID: 28598490; PMCID: PMC5522968.

杂志：

MOLECULAR MEDICINE

摘要

脓毒症是世界范围内导致死亡的主要原因。目前的治疗方式在很大程度上是支持性的。由于对先天免疫反应的复杂性和异质性认识不足，专注于抑制炎症宿主反应特异性介质的干预策略在很大程度上是不成功的。此外，传统的药物开发管道耗时且昂贵，并且与基于细胞的筛选相关的低成功率强调了对整个生物体筛选策略的需求，特别是对于复杂的病理过程。在这里，我们建立了脂多糖(LPS)诱导的斑马鱼内毒素血症模型，该模型表现出人类脓毒症的主要特征，包括水肿和组织/器官损伤，血管通透性增加和血管渗漏，伴随着细胞连接蛋白表达改变，细胞因子表达增加，免疫细胞活化和活性氧(ROS)产生，循环减少和血小板聚集增加。我们使用三个主要读数:死亡率、血管渗漏和ROS产生，测试了该模型用于基于表型的药物筛选的适用性。初步筛选确定法舒地尔，一种在小鼠模型中防止血管泄漏的药物，作为先导打击，从而验证了我们的模型在败血症药物筛选中的实用性。该斑马鱼脓毒症模型具有快速分析整个生物体中脓毒症相关病理和细胞过程的潜力，以及筛选和验证许多可以在体内改变脓毒症病理的化合物。

介绍

败血症被定义为由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。对感染的全身反应在生物学上是复杂的、冗余的，可由感染性和非感染性触发因素激活，对人类的了解很少。此外，由于某些组织或细胞类型无法进入，许多免疫生物学不能在人体中进行生理学检查。依赖先验的生物学知识和干预措施的可用性来改变临床前模型的结果在转化为临床时失败了。

虽然对培养细胞的研究已经带来了新的见解，但对假定的候选者的更深入了解需要开发实验系统，以便在更相关的器官背景下分析细胞间通信和组织-组织相互作用。尽管“芯片上的器官”等替代方法为研究不同细胞类型之间的相互作用提供了独特的机会，但这些方法与整个动物的相关性仍然不足，在整个动物中，先天免疫功能障碍的影响可以在生物体水平上进行研究。

传统的发现靶点的方法是缓慢的，通常需要几年的时间。可能的靶点列表是巨大的，而瞄准其中任何一个靶点导致生存率显著提高的机会很小。因此，需要更好的方法来加快药物发现的管道。在整个生物体中基于表型的筛选允许对新化合物进行测试，同时以无监督和系统的方式在整个生物体水平上评估复杂的生物过程，从而增强了为临床前和机制研究检测更合理靶点的潜力。虽然小鼠在临床前研究中仍然不可或缺，但小鼠生物学的几个方面，如药物发现和开发阶段所需的成本、时间和药物数量，限制了其在药物发现的大规模遗传和治疗筛选中的常规使用。

斑马鱼最近成为研究人类病理的强大脊椎动物模型。通过基因组测序，斑马鱼为疾病建模提供了独特而强大的原型，因为:其在基本细胞生物学过程中与人类具有显著的生理相似性和功能保守程度，相对容易的胚胎操作和全身成像，高繁殖力，低成本和透明度，各种分子工具的可用性，用于正向反向遗传学和基因组编辑。斑马鱼和人类参考基因组之间的比较表明，大约70%的人类基因至少有一个明显的斑马鱼同源基因。在药物研究中，斑马鱼胚胎是高通量体内药物筛选的理想选择，并且易于自动化。斑马鱼结合了体内模型的生物复杂性，以及高通量筛选和快速评估潜在毒性和脱靶效应的便捷性。预计从这种针对整个疾病途径的体内筛选中鉴定出的先导化合物将比基于细胞的体外筛选具有更高的成功率。

在过去的十年中，斑马鱼作为研究传染病、炎症性疾病、癌症和其他免疫相关疾病的优秀模型被广泛应用于免疫学的各个领域。斑马鱼拥有与哺乳动物相同的主要血统。它们的先天免疫系统在发育过程中变得活跃，在受精后16小时(HPF)和26小时(HPF)分别出现功能齐全的巨噬细胞和中性粒细胞。此外，它们的先天免疫反应的转录特征类似于在哺乳动物和细胞培养系统中看到的。斑马鱼的适应性免疫反应直到发育大约三周后才变得活跃，这意味着在没有T细胞和b细胞反应的早期幼鱼阶段可以对其进行分离研究。主要病原体识别受体(PRRs)及其下游信号通路和先天效应机制在人和斑马鱼之间是保守的，这使得斑马鱼成为研究先天免疫系统疾病的绝佳模型。然而，关于鱼类内毒素识别的机制一直存在争议。尽管脂多糖(LPS)在鱼类研究中是一种公认的免疫刺激剂，但有报道称，与人类不同，鱼类对LPS的识别并不通过TLR4进行。事实上，大多数鱼类(斑马鱼除外)缺乏TLR4，因此硬骨鱼模型中涉及LPS信号传导的分子机制尚不清楚。然而，下游信号分子如NFκB和MyD88的激活以及由此产生的促炎细胞因子的释放似乎是硬骨鱼和哺乳动物之间的保守反应。

脓毒症包括一系列反应，从全身炎症反应到器官功能障碍，再到多器官系统衰竭，最终死亡。在疾病的最初阶段，患者对感染表现出压倒性的炎症反应。这主要是由于免疫细胞的激活和促炎细胞因子(IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)和IL-8)在这一阶段的释放。这种系统性炎症级联是由各种细菌产物引发的，如内毒素。这些反过来又在微血管和细胞水平上带来许多变化，包括炎症和凝血级联的弥漫性激活、血管舒张、毛细血管内皮渗漏、血管分布失调以及由此导致的细胞水平上对氧气和营养物质的不正常利用。最终导致微血管血栓形成和微血管堵塞、灌注不足、缺血和组织损伤，进而发展为多器官系统功能衰竭，最终死亡。虽然机体确实试图通过产生抗炎介质(IL-10)来调节初始的高炎症状态，但临床观察到这是一段免疫抑制期，这种低反应状态的持续与继发感染和死亡的风险增加有关。

内毒素概括了脓毒症的许多重要特征，包括血管完整性丧失、渗出性水肿的产生、中性粒细胞外渗、免疫细胞活化、促炎和活性氧(ROS)合成增加、微循环和凝血功能障碍。在这里，我们提出并验证了一种新的内毒素血症斑马鱼模型，我们希望它可以加速败血症药物的发现，用于基于表型的化学筛选，以确定具有疾病改善潜力的新治疗靶点和化合物。

材料与方法

斑马鱼品系与护理

成年和胚胎斑马鱼使用标准实验室程序饲养和维持。斑马鱼在28.5±0.5°C的光照/黑暗周期中饲养14 h/10 h。通过自然交配获得胚，在胚培养基中培养。本研究中的所有实验均按照圣迈克尔医院动物委员会制定的伦理准则进行，并批准了动物协议ACC660。大于24 HPF的胚胎用200µM 1-苯基-2-硫脲处理以阻止色素沉着

lps诱导的斑马鱼脓毒症模型:生存曲线和表型分析

常用的小鼠脓毒症模型是LPS和盲肠结扎穿刺模型。考虑到实用性，本研究采用LPS制作斑马鱼脓毒症模型。暴露于不同浓度LPS(大肠杆菌0111:B4;Sigma)。采用浸渍法将受精后3 d的幼鱼暴露于LPS环境中。分别用25、50、75、100和200µg/mL LPS(溶解于胚液中)浸泡，在28.5℃下静置2、7、9和24 h，每次处理的总容积为2 mL。对照幼鱼暴露于胚培养基中。试验采用3个重复组，每个处理10只幼鱼。在LPS暴露6小时后，对40只幼鱼/LPS浓度进行表型分析。

测量lps诱导的血管渗漏

微血管造影剂量子点(QD605)和异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖(4kd)用于观察内皮屏障功能丧失和血管渗漏。

将3只DPF Tg (flk1: GFP)和Tg (kdrl: mcherry)幼鱼暴露于LPS(100µg/mL)中，在28.5℃下静浸6 h。对照幼鱼暴露于胚培养基中。然后用丁香油和QD605麻醉幼鱼(平均3次，每次处理9-14只幼鱼)或FITC葡聚糖(4KD;采用标准显微注射方案，将Tg (flk1: GFP)或Tg (kdrl: mcherry)幼鱼分别注射到总主静脉(CCV)中，每次处理平均3次，每次10-15只幼鱼。将注射后的胚胎转移到胚胎培养基中并使其恢复，然后在注射后30分钟使用徕卡荧光显微镜(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)成像。为了实时观察血管渗漏，注射fitc -葡聚糖恢复后，对照和lps处理的幼鱼立即固定在低熔点琼脂糖中，使用徕卡荧光显微镜进行延时成像。

细胞因子和细胞连接蛋白表达的测定

以伸长因子1α (EF1α)作为管家基因对照，采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)评估细胞因子(平均3个试验，每个试验20只幼鱼/处理)和细胞连接蛋白(平均3 - 5个试验，每个试验20只幼鱼/处理)的相对表达。

RNA提取和cDNA合成。将3只DPF野生型斑马鱼幼鱼暴露于LPS(100µg/mL)中，在28.5℃下静浸6 h。对照幼鱼暴露于胚培养基中。采用RNeasy提取试剂盒(Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada)提取总RNA，每组20只，DNase处理。用NanoDrop™分光光度计在260/280 nm处测定总RNA的浓度。使用Superscript II逆转录酶试剂盒(Invitrogen)根据制造商的说明，从1µg总RNA合成第一链cDNA。

PCR条件。感兴趣的基因和使用的引物对如表1所示。cDNA扩增在94°C初始变性2分钟后进行40个循环，分别为变性(94°C 30秒)、退火(58°C 30秒)和延伸(72°C 1分钟)，最后在72°C延伸10分钟后终止。PCR总容积为20µL，包括1 × PCR缓冲液，1.25 mM MgCl2, 0.25 mM dNTP, 1 U Taq聚合酶，0.5µM正向和反向引物，1µL cDNA。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。每个PCR产物的大小通过与100个碱基的DNA阶梯进行比较来确定。采用凝胶记录系统和Fiji分析软件对SYBR安全染色凝胶进行密度分析，定量PCR产物。对于每个样品处理，获得的目标基因特异性带的综合密度值除以EF1α带获得的信号，得到相对mRNA丰度值。EF1α波段的综合密度值随处理无显著变化。每个基因至少重复实验3次。结果以n次试验的相对强度±平均值的标准误差(SEM)表示。

ZO-1免疫荧光分析

将3只DPF Tg (kdrl: mcherry)幼鱼暴露于LPS(100µg/mL)中，在28.5℃下静浸6 h。对照幼鱼暴露于胚培养基中。胚胎在2%多聚甲醛(PFA)的PBST(磷酸盐缓冲盐水+ 0.1% Tween 20)中于4°C下固定过夜。然后胚胎在室温下PBST中洗涤4次，5分钟，在PBST + 0.5% TritonX-100中透性30分钟。然后将胚胎用PBST + 0.1% TritonX-100 + 10%正常山羊血清(NGS) + 1%牛血清蛋白(BSA)在室温下封闭2小时。胚胎用一抗(兔抗zo -1 mid;Invitrogen #40 2200)在阻断溶液(1:200)中，在4°C下过夜。然后在RT下PBST中洗涤6次，20分钟，用二抗(山羊抗兔IgG Alexa flu488;1:1000)在阻断液中孵育2小时。胚胎在PBST中孵育3次，孵育10分钟，然后置于4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI) Vectashield中。图像由蔡司共聚焦显微镜拍摄。平均3次试验，4 ~ 6只/处理，获得定量数据。

测量免疫细胞的活化和ROS的产生

为了观察中性粒细胞的活化和转运，将3只DPF Tg (mpx: GFP)幼鱼在28.5°C下静浸LPS(100µg/mL) 4 h，使用徕卡荧光显微镜(n = 7/处理)成像。为了可视化中性粒细胞和巨噬细胞在lps诱导的组织损伤中所起的作用，3 DPF Tg (coro1a: eGFP;lyz: Dsred)双转基因幼鱼(巨噬细胞显示绿色荧光，中性粒细胞显示绿色和红色荧光)在28.5°C下静态浸泡LPS(100µg/mL) 6 h，使用徕卡荧光显微镜(n = 7/处理)成像。使用Fiji分析软件统计中性粒细胞和巨噬细胞数量。

用2 '，7 ' -二氯二氢荧光素(DCFH-DA;Sigma-Aldrich)， ROS指标(n = 4/组)。将野生型斑马鱼置于LPS(100µg/mL)中，在28.5℃下静浸5 h，然后与100µM DCFH-DA一起在28.5℃下黑暗孵育1h，用胚水洗涤3次，孵育5 min。DCFH- da扩散到细胞内，被细胞酯酶去乙酰化为非荧光DCFH，后者被ROS迅速氧化为高荧光的2’，7’-二氯荧光素。荧光强度与胞浆内ROS水平成正比。为了证明观察到的对ROS产生的影响是LPS特异性的，我们还进行了LPS剂量反应和由此产生的ROS产生的变化。野生型斑马鱼暴露于不同浓度的LPS(0、25、50、75和100µg/mL;n = 3/处理)在28.5°C下静浸5 - 6 h，然后与100µM DCFH-DA在28.5°C下黑暗孵育1 h，用胚水洗涤3次，孵育5 min。使用徕卡DFC 300-FX相机和徕卡荧光显微镜拍摄照片，并使用Fiji分析软件进行处理。

校正总荧光(CTF)的计算公式如下:CTF =积分密度-(选定细胞面积×背景读数的平均荧光)

测量循环缺陷

为了可视化lps诱导的循环变化，3 DPF Tg (flk1: GFP;gata-1: Dsred)双转基因幼鱼在28.5°C下静浸LPS(100µg/mL) 6 h，用徕卡荧光显微镜成像(平均3次试验，7只幼鱼/处理)。对照幼鱼暴露于胚培养基中。结果用邻二苯胺(OD)染色技术对血红蛋白进行了验证。简单地说，将LPS处理后固定在4% PFA中的幼鱼在PBST中洗涤，然后在o- diisidine (OD)染色液(10 mL溶液中含有6 mg OD, 4 mL EtOH, 100µL 1M乙酸钠和5.9 mL水)中黑暗孵育6分钟。然后在PBST中洗涤3次，5分钟，用明视野显微镜成像。

为了测量lps诱导的血管狭窄，使用徕卡荧光显微镜测量背主动脉(卵黄延伸尖端正上方)直径的像素距离，然后使用斐济分析软件转换为µm (n = 5-8 /处理)。

测量血小板聚集

为了观察血小板，相当于人类血小板(招募，聚集和可能形成微血管血栓)，将3只DPF Tg (CD41: GFP)幼鱼在28.5°C下静态浸泡6小时，暴露于LPS(100µg/mL)中，并使用徕卡荧光显微镜成像(平均3次试验，5-7只幼鱼/处理)。

脓毒症中免疫抑制状态的表征

为了描述脓毒症晚期常见的免疫抑制状态，在lps治疗后6-7小时对中性粒细胞数量进行计数。将3只DPF Tg (mpx: GFP)幼鱼在28.5°C下静浸LPS(100µg/mL) 6-7 h，使用徕卡荧光显微镜(n = 7-12 /处理)成像。晚期炎症介质HMGB1的转录水平也通过定量实时PCR测定，如前几节所述。

斑马鱼脓毒症+和NFκB的LPS信号传导

TLR4a、TLR4b和MyD88的转录本丰度通过实时荧光定量PCR检测，如前几节所述。利用Encinas等人的改进方案，通过全胚胎免疫荧光观察NFκB蛋白表达和核易位。简单地说，将3只DPF幼鱼暴露于LPS(100µg/mL)中，在28.5°C下静态浸泡2小时。对照幼鱼暴露于胚培养基中。胚胎在2% PFA的PBST中于4°C下固定过夜。在PBST + 0.5% TritonX-100中，胚胎在RT下洗4次，5分钟，RT下透性30分钟。胚胎在PBST + 0.1% TritonX-100 + 10% NGS + 1% BSA中封闭2 h。胚胎用一抗(NFκB/p65 [Rel A] Ab-1，兔多克隆抗体;RB-1638-P0)在阻断溶液(1:200)中在4°C下过夜。然后在RT下PBST中洗涤6次，20分钟，用二抗(山羊抗兔IgG Alexa flu488;1:1000)在阻断液中孵育2小时。胚胎最后在PBST中孵育3次，孵育10分钟，并在DAPI Vectashield中孵育。图像由蔡司共聚焦显微镜拍摄。平均3次试验，每次处理3 - 4只幼鱼，获得定量数据。

验证斑马鱼脓毒症模型在高通量药物筛选应用中的实用性

内部组装的小分子药物文库与适当的阳性和阴性对照一起，最初溶解在100%二甲基亚砜(DMSO)中，浓度为10 mg/mL，然后用无核酸酶的水进一步稀释。3只DPF野生型斑马鱼幼鱼与LPS(100µg/mL)和小分子文库(终药浓度为1µg/mL;DMSO <0.01%)在28.5°C下，96孔设置过夜(暗壁板，底部透明;1幼鱼/;实验重复3次)。在同一盘子上也设置了适当的对照。筛选是使用我们内部的高通量机器人药物发现平台完成的。初步筛选涉及96个小分子(分子量250-500)靶向表观遗传调节剂、免疫调节剂及其类似物(生命化学品)。这些分子既满足Lipinski的“五法则”，也满足Veber准则和差异性评价。

在我们的高通量筛选中使用的三个主要读数是:(1)小分子提高存活率的能力，(2)小分子挽救lps诱导的血管渗漏和由此导致的尾鳍水肿的能力(通过明场显微镜观察)和(3)小分子挽救lps诱导的系统性ROS产生的能力(见上面的方案);使用ImageXpress Ultra共聚焦高含量分析系统(Molecular Devices)进行成像和定量。

为了进一步测试法舒地尔对LPS诱导的死亡、血管渗漏和ROS产生的影响，将3只DPF斑马鱼幼鱼与LPS(100µg/mL)共孵育，在不同浓度的法舒地尔(0.01 ~ 75µM)下，获得该药物相对于生存的EC50(处理采用3个重复组，每个处理10只幼鱼)。fitc -葡聚糖注射(平均3次试验，每处理10只幼鱼)和活性氧产生测定(见上面的方案;平均3个试验(3只幼鱼/处理)来评估法舒地尔对lps诱导的血管渗漏和ROS生成的拯救能力。

统计分析

数据以平均值±SEM表示。采用T检验(对照与LPS实验)和Tukey事后检验的双向方差分析(药物抢救实验)进行统计比较，以确定治疗差异。当需要满足正态性和等方差假设时，对原始数据或转换数据进行统计分析。概率水平P < 0.05为显著性。所有统计分析均使用graphpad Prism软件进行。

暴露于LPS引起的尾鳍水肿和死亡率

暴露于LPS的三只DPF斑马鱼幼鱼显示出剂量依赖性的死亡率增加(图1A)。虽然较低浓度的LPS(25或50µg/mL)在前24小时内没有导致死亡，但50µg/mL组中5%的幼鱼出现了肿胀的心包囊(图1B)。暴露于75或100 μ g/mL的中高剂量LPS分别导致40%和93%的死亡率。暴露于50和75µg/mL LPS的幼鱼心包肿胀。75µg/mL LPS组只有7.5%的幼鱼出现尾鳍水肿和组织损伤，而100µg/mL LPS组92.5%的幼鱼出现尾鳍损伤和水肿。此外，暴露于100µg/mL LPS下的幼鱼尾鳍水肿和损伤随着时间的推移而恶化(图1C, D)。暴露于LPS后，最高剂量200µg/mL导致心包出血，2小时死亡率为37%，7小时死亡率为100%。所有后续实验均使用100 μ g/mL LPS剂量进行，因为该剂量导致适合基于表型的药物筛选的尾部表型，如果不进行干预，也会导致死亡率。

lps诱导斑马鱼幼鱼血管渗漏

注射量子点(QD605)提供了明亮的生命标记，显示暴露于LPS(100µg/mL)后47%的斑马鱼幼鱼(Flk1: GFP)血管渗漏增加(图2A, B)。最明显的QD渗漏发生在卵黄延伸尖端正上方的区域(图2A)，沿着后基数静脉(PCV)。由于量子点相对较大(约为大分子的大小~ 15-20 nm)，因此使用该方法无法识别较小的泄漏。为了解决这个问题，我们使用了分子量为4 KD(~ 14埃)的绿色标记的fitc -葡聚糖来证明lps诱导的血管渗漏通过节间血管(isv)和fitc -葡聚糖在尾部尖端的积累，这与尾鳍中看到的水肿和组织损伤相对应(图2C)。fitc -葡聚糖注射后lps诱导的血管渗漏延时成像可以实时显示体内血管渗漏(见补充数据)。注射fitc -葡聚糖检测到97%的幼鱼有血管渗漏，与量子点注射相比，这是一种更可靠的检测lps诱导血管渗漏的方法(图2D)。

LPS改变细胞连接蛋白的表达和分布

内毒素血症后，血管渗漏被认为是由微生物或/和宿主因子对内皮细胞和/或其紧密和粘附连接的直接作用引起的(TJs和AJs，图3A)。AJs是组织完整性的基础，而tj则与屏障功能有关(27)。将斑马鱼幼鱼暴露于100µg/mL LPS中，显著降低TJ蛋白occludin A的转录水平(2.7倍;图3B)， occludin B(2.4倍;图3C)， claudin 5a(1.9倍;图3D)和claudin 5b(1.8倍;图3E)， claudin 2的表达增加(4倍;图3F)，对AJ蛋白VE钙粘蛋白的转录水平没有影响(图3G)。LPS也显著降低(2.6倍;ZO-1是一种与跨膜TJ蛋白、细胞骨架和信号转导分子相关的支架连接蛋白。ZO-1蛋白表达也明显降低(图3I)，并且在lps诱导的尾部水肿和组织损伤部位出现断裂/碎片化(图3J)。

LPS诱导中性粒细胞和巨噬细胞血管外迁移

通过使用带有荧光标记的中性粒细胞和巨噬细胞的转基因斑马鱼系，我们量化了白细胞从限定血管中的迁移。中性粒细胞在未处理的3 DPF幼鱼中处于静止状态，主要位于主动脉背侧(DA;图4 Ai)。在炎症的早期阶段，暴露于LPS导致嗜中性粒细胞从DA迁移到间隙(图4i, B)。LPS还诱导巨噬细胞从血管内空间迁移到水肿尾的血管外液体中(图4C, D)。

暴露于LPS后ROS和炎症介质表达增加

它们的快速扩散和多样的生物活性使ROS成为确定弥漫性损伤和伤口到白细胞信号的存在和程度的良好候选者。LPS以剂量依赖的方式诱导ROS生成增加(补充图S1)。LPS暴露后，与对照组相比，斑马鱼幼鱼(暴露于100µg/mL LPS)的ROS产量迅速显著增加(34倍)(图5A, B)。LPS处理的幼鱼尾部ROS产量增加与观察到的尾部和组织损伤相对应。间质水肿和ROS生成的增加与关键促炎细胞因子表达的适度增加和抗炎细胞因子IL-1表达的较大增加进一步相关(1.2倍;图5C)， IL-6(1.3倍;图5D)， TNF(1.6倍;图5E)， IL-8l1(1.5倍;图5F)， IL-8l2(1.3倍;图5G)和IL-10(5.5倍;图5 h)。

LPS诱导血管狭窄，血流减少和血栓细胞聚集

通过转基因斑马鱼系和血红蛋白染色，暴露于LPS后，>86%的3只DPF幼鱼表现出脑毛细血管微血管循环减少，主要是在中央动脉(图6A, B)。我们还通过DA和PCV观察到循环不良和缺陷(图6C)，并伴有DA狭窄(图6D)。在超过80%的斑马鱼幼鱼中，我们还观察到与对照组相比，DA和PCV之间的CCV和胚胎尾侧区域的血栓细胞聚集增加，这表明斑马鱼幼鱼尾侧区域有少量循环血栓细胞(图6E, F)。

中性粒细胞数量减少和HMGB1表达增加提示斑马鱼脓毒症模型处于免疫抑制状态

在我们的斑马鱼脓毒症模型中，我们观察到炎症后期(LPS治疗后6-7小时)中性粒细胞数量减少(补充图S2A, S2B)， HMGB1表达增加(2.5倍)(补充图S2C)，表明该模型的免疫抑制状态与临床脓毒症中观察到的相似。

斑马鱼脓毒症模型中的LPS信号通路包括nf - κ b上调、核nf - κ b易位和升高MyD88表达式

lps诱导的斑马鱼脓毒症模型内毒素血症是通过NFκB和MyD88信号通路介导的。NFκB荧光主要定位于对照斑马鱼幼鱼的细胞质中。然而，荧光也出现在细胞核中，并且在LPS处理的幼鱼(处理后2 h)中荧光强度增加，提示诱导了斑马鱼NFκB的易位和新合成(补充图S3A, S3B)。这也与MyD88表达增加(2.8倍;补充图S3C)，但TLR4转录物水平没有变化(补充图S3D, S3E)。

内毒素诱导的高通量药物筛选参数评价

我们建立了一个方案，将健康的3只DPF幼鱼分布在96孔板中，暴露于LPS和内部组装的不同药物库中14-16小时，以检测候选化合物对LPS诱导的死亡、血管渗漏(以尾鳍水肿为特征)和ROS产生的影响。根据可重复性、易检测性、可视化、量化和与脓毒症病理生理的相关性，选择内毒素血症严重程度的替代标记物作为我们表型筛选的基础。各种先导候选物降低了lps诱导损伤的主要(尾鳍水肿和ROS产生)和次要(死亡率)结果标志物。从我们96个专有小分子化合物的初步筛选中，鉴定出10个化合物可以挽救所有三种表型。其中一种被确定的药物是法舒地尔(图7A, B)，一种已知可以挽救实验性脓毒症小鼠模型中脂多糖诱导的血管渗漏的药物。对法舒地尔的反应被用来验证我们的模型在确定死亡率、血管泄漏和活性氧产生的新修饰因子方面的实用性。该药物在斑马鱼中的进一步测试表明，法舒地尔对lps诱导的死亡具有剂量依赖性，对存活的EC50为3.852µM(图8A)。此外，虽然所有暴露于LPS并接受载药处理的幼鱼都出现尾部水肿和肿胀，并伴有血管渗漏和尾部fitc -葡聚糖的积累，但法舒地尔和LPS处理的幼鱼中，88%的幼鱼完全恢复了尾部表型和fitc -葡聚糖渗漏(图8B, C)。法舒地尔本身对血管渗漏没有影响，对斑马鱼幼鱼没有毒性作用。法舒地尔还能挽救脂多糖诱导的尾部ROS生成(图8D、E)。有趣的是，与对照组、法舒地尔处理和脂多糖+法舒地尔处理的幼鱼相比，脂多糖处理的幼鱼鱼鳔中的ROS减少(图8F)。

讨论

在这里，我们建立了一种新的内毒素诱导的炎症和损伤斑马鱼模型，概括了人类败血症的主要生理和细胞特征。将斑马鱼幼鱼暴露于高剂量LPS会导致血管渗漏，导致尾鳍水肿和组织损伤，并随着时间的推移而恶化，在没有干预的情况下，与高死亡率相关。尾巴表型还与量子点和葡聚糖从血管内渗漏到间隙的增加有关，主要是沿着尾巴。血管通透性的丧失与紧密连接蛋白基因表达减少、水孔基因claudin2表达增加、巨噬细胞和中性粒细胞浸润增加、细胞因子表达增加和ROS产生增加有关。LPS暴露也与背主动脉收缩有关，有证据表明流向大脑的血流量受损，血小板聚集增加，表明大动脉血管收缩和血小板功能障碍。

PRRs及其下游信号通路和先天免疫效应机制在人类和斑马鱼之间是保守的。脂多糖是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。它是一种强效免疫刺激剂，已知在脊椎动物模型中可诱导器官功能障碍、血管麻痹甚至死亡。此外，大多数人类败血症病例与细菌感染有关，革兰氏阴性菌常与严重败血症和感染性休克的发病机制有关。虽然最近的研究使用微生物注射细菌提取物来诱导斑马鱼的炎症和败血症样病理生理，但我们使用了一种更简单的技术(水媒暴露于LPS)，它更适合高通量药物筛选。

血管通透性增加有助于脓毒症的病理生理，以及多种其他疾病状态。对内毒素诱导的间质水肿形成的更深入的了解可能为屏障功能丧失的机制提供基本的见解。微注射量子点(QD605)和fitc -葡聚糖等微血管造影造影剂，可以实时直接观察血管通透性的变化，并在体内对靶向血管通透性的药物进行评价。在lps诱导的斑马鱼脓毒症模型中，我们实时观察到血管完整性的广泛丧失和随之而来的血管泄漏的增加。注射QD605有助于检测主要渗漏，而注射fitc -葡聚糖有助于观察isv的轻微渗漏，以及泄漏的fitc -葡聚糖在尾鳍的积累，这与这些幼鱼的尾鳍水肿相吻合。

屏障完整性的破坏至少部分归因于细胞连接蛋白的表达和分布的改变。在我们的模型中，血管通透性增加伴随着紧密连接蛋白occludin a和b、claudin 5a和b及其细胞内伙伴ZO-1的表达减少。虽然在斑马鱼中claudin 5被认为对内皮细胞更具特异性，但其表达仅限于中枢神经系统和玻璃状血管。相反，claudin 5b在整个血管系统中表达。其他紧密连接蛋白如occludin和许多claudin家族成员不仅存在于内皮细胞中，也存在于上皮细胞中。在这些细胞中，TJs有助于生成主要屏障，阻止溶质通过细胞旁途径扩散)。

值得注意的是，我们测量了全身连接蛋白的表达，在我们的表达分析中没有区分上皮和内皮连接蛋白。我们的结果与小鼠脓毒症模型的研究一致，也显示occludin和claudin 5水平显著降低。对脓毒症小鼠的研究也表明，ZO-1表达减少，模式紊乱，碎片化程度更高，这与我们在斑马鱼脓毒症模型中的发现相似。我们还发现，在小鼠多微生物脓毒症模型中，形成孔隙的紧密连接蛋白claudin 2表达上调)。有趣的是，我们没有检测到VE钙粘蛋白表达的任何显著差异，尽管这种AJ蛋白广泛参与调节内皮完整性和通透性。这种差异可能是由于我们测量了VE钙粘蛋白的总转录水平，而VE钙粘蛋白介导的内皮通透性的大多数变化是翻译后变化的结果，即VE钙粘蛋白磷酸化和快速内化和裂解，这并不一定反映转录水平的变化。

诱导炎症介质IL-1、IL-6、TNF及IL-8的两种同源物在处理后6 h暴露于病理浓度LPS的斑马鱼幼鱼中表达适度升高。众所周知，细胞因子水平在对感染的反应中是暂时调节的，我们可能错过了通常在免疫损伤后最初几个小时观察到的促炎细胞因子表达的峰值水平。此外，抗炎细胞因子IL-10的显著高表达表明进展为免疫抑制表型，通常与败血症后期继发感染的原因有关。本研究中测量的细胞因子和趋化因子通常被用作硬骨鱼免疫反应的测量方法，并且先前已证明斑马鱼和哺乳动物之间相当保守(序列保守和/或结构保守)。然而，斑马鱼的许多细胞因子基因在进化过程中独立复制和分化，其功能含义尚不完全清楚。在人类以及内毒素血症和败血症的非灵长类动物模型中，这些促炎介质已被证明协同作用，诱导以血管通透性增加、严重肺水肿和出血为特征的休克样状态。这些细胞因子和趋化因子以自分泌和旁分泌的方式激活巨噬细胞，促进中性粒细胞募集，激活凝血途径并放大炎症级联反应。在我们的模型中，促炎介质的上调与中性粒细胞和巨噬细胞迁移的增加有关，同时伴随着ROS产生的增加，尤其是在尾部。在脓毒症中，中性粒细胞在脉管系统和外周器官的积聚可导致肺、肾、膈、肝和肠等多个器官的非特异性细胞和组织损伤。此外，中性粒细胞还通过与内皮壁的结合和血小板-白细胞聚集体的形成，促进败血症相关的血液凝固和微血管堵塞。进一步的研究将探讨循环细胞和实质细胞在内毒素诱导的组织损伤发病机制中的具体作用。

在败血症/感染性休克期间微循环发生巨大改变。局部小动脉收缩和内皮通透性增加会破坏正常的血流。我们观察到斑马鱼脓毒症模型中通过脑毛细血管的循环非常少。血流分流可能导致毛细血管血流减慢，并与微血栓引起的毛细血管阻塞一起，可能减少向组织输送氧气，损害二氧化碳和废物的清除。我们还观察到主要血管(如DA和PCV)的循环减少，DA变窄。这伴随着脉管系统中血小板的聚集，这可能是lps诱导的微血管血栓和与败血症相关的微血管堵塞的形成的指示，可能导致组织灌注减少。未来的机制研究旨在阐明与病理性暴露于LPS相关的血流动力学损害，目前正在进行中。

死于败血症的患者也表现出免疫抑制状态。这种全身性免疫抑制状态不仅导致无法根除原发感染，还会导致致命的继发感染。脓毒症的免疫抑制与免疫细胞的衰竭和免疫调节分子如细胞因子水平的改变有关。在我们的模型中，虽然我们观察到炎症早期中性粒细胞外渗增加，但在lps诱导的炎症后期，中性粒细胞数量明显减少。这与先前的数据一致，显示严重脓毒症患者中性粒细胞数量显著减少。有人提出，中性粒细胞数量的减少可能是由于中性粒细胞对抗入侵细菌的自我牺牲机制，称为“NETosis”(NET:中性粒细胞胞外陷阱)。作为对炎症刺激的反应，中性粒细胞从循环中渗出到被感染的组织，并启动NETosis，由此它们释放颗粒蛋白，如中性粒细胞弹性酶和髓过氧化物酶，其作用是降解毒力因子和杀死细菌。在严重脓毒症的情况下，许多中性粒细胞因此被消耗以消除细菌。虽然NETs通常被认为是有益的，但过度形成也可能通过激活血小板对宿主造成意外伤害，导致微血管堵塞。中性粒细胞数量减少也可能为继发性机会性感染铺平道路。

HMGB1主要以其作为dna结合蛋白促进基因转录的作用而闻名，现在已被认为是一种促炎细胞因子和炎症的晚期介质。有趣的是，在我们的斑马鱼脓毒症模型中，HMGB1的表达在炎症后期也显着增加。已知HMGB1在人类败血症晚期的积累在败血症后免疫抑制的发展中起主要作用。此外，在小鼠脓毒症模型中，治疗性阻断HMGB1已被证明可以提高死亡率。斑马鱼是否也有同样的情况还有待研究。

硬鱼体内脂多糖信号传导的机制存在广泛争议。许多硬骨鱼缺乏TLR4受体，但仍然对LPS有反应，这强调了硬骨鱼中LPS信号传导不是通过传统的TLR4信号传导途径发生的事实。我们也没有看到TLR4在LPS刺激下的表达有任何变化。然而，我们在此表明斑马鱼脓毒症模型中对LPS的识别确实需要NFκB易位和MyD88，与之前的研究相似。

利用我们的斑马鱼内毒素血症模型，我们建立了一种新的筛选方案来筛选许多抗血管渗漏/抗内毒素特性的化合物。所使用的三个主要读数(挽救死亡率、挽救尾部表型和挽救ROS产生)非常直接，不需要侵入性手术。法舒地尔是一种RhoA/ rho激酶途径的抑制剂，与内皮屏障功能丧失和血管通透性增加有关，与内毒素诱导的败血症有关。此外，法舒地尔在小鼠模型中也被证明可以挽救lps诱导的血管渗漏。

法舒地尔同时暴露于LPS可减少斑马鱼幼鱼尾部水肿、葡聚糖泄漏和ROS产生。有趣的是，与其他三组相比，暴露于LPS的幼鱼在鱼鳔中产生的ROS减少。鱼的鱼鳔与四足动物的肺是同源的。在鱼类中，这主要与流体静力作用有关。氧气是鱼鳔中的主要气体，该器官的组织经常暴露于持续的高氧，导致ROS的产生增加。这可能解释了我们在对照鱼中观察到的ROS产量增加。鱼鳔也被认为是氧气储存库，血液可以在需要的时候从中吸取额外的氧气。这也许可以解释在脂多糖处理的斑马鱼幼鱼中看到的低ROS水平，这表明氧气可能来自鱼鳔，以补偿脂多糖引起的身体不同部位和远处组织的缺氧。

结论

综上所述，给斑马鱼幼鱼施用水性脂多糖可重现与人类败血症相关的许多表型和细胞变化。这些可以可靠地可视化，量化和逆转管理的抗血管渗漏化合物，如法舒地尔。重要的是，临床相关结果(如死亡率、血管渗漏和ROS产生)可以利用高通量方法筛选斑马鱼幼鱼的各种化合物。