影响因子：5.3
丹参（Salvia miltiorrhiza，DS）和赤芍（Radix Paeoniae Rubra，CS）药对（DS-CS）是一个著名的传统中药复方，已经作为抗血栓配方使用了几个世纪。然而，仍然缺乏足够的科学证据来解释其潜在机制。本研究的目的是在斑马鱼中研究DS-CS提取物的抗血栓效果并探索其可能的作用机制。
使用高效液相色谱法（HPLC）评估中药DS和CS颗粒的质量。随后，实验验证了在不同浓度下DS-CS组合及其成分丹酚酸A（SAA）和芍药苷（PF）对血栓的治疗效果。此外，通过网络药理学分析了DS-CS与血栓疾病靶标之间的相互作用，预测了DS-CS的潜在抗血栓机制。通过分子对接和体内斑马鱼实验验证了预测的靶标，并使用qRT-PCR进行了靶标验证。
在25至300 μg/mL的浓度范围内，DS-CS在斑马鱼中表现出抗血栓效果。在25 μg/mL的浓度下，PF和SAA的共同使用显示出超过单一成分的协同抗血栓效果。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析鉴定了与PF和SAA抗血栓作用相关的关键基因，包括白蛋白（ALB）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、基质金属蛋白酶-9（MMP9）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、表皮生长因子受体（EGFR）、成纤维细胞生长因子2（FGF2）、血管内皮生长因子受体2（KDR）、基质金属蛋白酶-2（MMP2）、凝血酶（F2）和凝血因子Xa（F10）。此外，KEGG通路分析表明涉及脂质代谢和动脉粥样硬化通路。分子对接显示PF和SAA与关键枢纽基因，如SRC、EGFR和F10，具有强结合力。实验结果表明，DS-CS能够上调EGFR的mRNA表达水平，同时抑制F10和SRC的mRNA水平，从而改善血栓情况。
本研究提供了有关DS-CS抗血栓活性潜在机制的有价值见解。我们的研究结果表明，PF和SAA可能是负责这种活性的关键活性成分。DS-CS的抗血栓效果似乎是通过调节SRC、EGFR和F10的mRNA表达来介导的。这些结果增强了我们对DS-CS治疗潜力的理解，并为未来进一步研究其作用机制奠定了基础。
血栓在心血管疾病中起着重要作用，严重威胁人类健康和生命。目前，最常用的抗血栓药物是阿司匹林、华法林和肝素，但它们伴随着出血和耐药性等不良反应。血栓形成是复杂的病理状况，需要能够作用于多种生物靶标的联合治疗。具有抗血栓特性的草药在通过预防血栓形成治疗心血管疾病（如动脉硬化、缺血性心脏病和中风）方面有着悠久的历史。
与单一草药和复杂配方相比，药对是研究成分之间相互作用的理想研究对象。根据中医配伍理论，单独使用草药可能效果有限，但特定组合可以显示增强或协同作用。配方是临床应用的主要类型，包含多种中药，遵循配伍理论的规则，但大多数包含的成分太多，难以说明其作用机制。药对不仅反映了中医的协同作用，还简化了复杂的配方，超越了单一草药或复杂多草药配方获得的见解。此外，一些中药药对进一步被简化为化合物对，呈现出与药对相同的药理效果，目的是阐明涉及的作用机制。
丹参（Salvia miltiorrhiza，DS）是中医中著名的草药，其活性成分已显示出多种药理作用，如抗炎、抗氧化、抗凋亡和神经保护活性。赤芍（Radix Paeoniae Rubra，CS）是另一种中药，属于毛茛科，在治疗心血管疾病方面具有显著疗效。在中医中，DS和CS的组合（DS-CS）作为一种典型且经常使用的配对。然而，现有科学文献表明，关于DS-CS机制研究的报道数量有限。
斑马鱼（Danio rerio）在研究人类疾病及相关病理方面广泛用作灵活的模式生物，尤其是在心血管疾病领域。相比于传统的哺乳动物体内模型，这些模型通常费力、昂贵且耗时，斑马鱼模式生物具有许多优势，包括高繁殖率、小体型、快速发育和快速世代时间。此外，斑马鱼胚胎的透明度使得能够以高分辨率在体内非侵入性地观察器官和生物过程。此外，斑马鱼的血栓细胞与哺乳动物的血小板同源，斑马鱼的止血机制与人类相似。所有这些特点使得斑马鱼成为研究心血管疾病和药物作用机制的优秀模型。
网络药理学是一种利用数据库分析和预测多种化合物靶标的研究方法。它可以同时分析多种药物与靶标之间的对应关系，并用网络图的形式展示这些关系。网络药理学具有多成分和多靶标的研究方法，与中医的整合特性一致。
在我们的研究中，我们确认了从DS和CS中提取的代表性化合物SAA和PF的抗血栓疗效。它们以25 μg/mL的浓度、1:1的比例混合使用。此外，我们通过网络药理学分析、分子对接和体内实验研究了潜在的靶分子。预计这些发现将提供有价值的数据，阐明DS-CS内化合物之间的协同作用，并揭示其可能的作用机制。
材料与方法
丹参颗粒（批号：0422005501）和赤芍颗粒（批号：0422002211）购自北京康仁堂有限公司。丹酚酸A（SAA）购自成都草药物质有限公司。丹酚酸B（SAB）购自上海溯源生物技术有限公司。芍药苷（PF）购自北京索莱宝生物科技有限公司。N-苯基硫脲（PTU）、苯肼（PHZ）、乙酰水杨酸（阿司匹林，ASP）、乙基3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（MS-222）和3,3'-二甲氧基联苯胺（O-二茴香胺）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙腈和磷酸购自上海麦克林生化科技有限公司。过氧化氢（30%，H₂O₂）（分析纯）购自成都科龙化学有限公司。无水乙酸钠（分析纯）购自天津致远化学试剂有限公司。乙醇（分析纯）购自重庆川东化工（集团）有限公司。其他用于斑马鱼系统日常维护的常规试剂购自武汉天正元生物技术有限公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实时聚合酶链式反应（实时PCR）试剂盒购自北京塔卡拉生物技术有限公司。所有缓冲液和其他试剂均为市售的最高纯度产品。
精确称量SAB和PF的参考化合物，溶于甲醇中，制备浓度分别为22.4 μg/mL和21.8 μg/mL的参考化合物溶液。在分析过程之前，这些溶液在4°C下严格保存。
分别制备三对1 g的DS和CS颗粒（DS与CS的比例为1:0、1:1和0:1）。首先，将1.0 g的颗粒对分散在20 mL的80%甲醇中，置于50 mL锥形瓶中并加盖。随后，将混合物在超声波容器中提取约20分钟。所得提取液进行过滤，然后通过0.22 μm膜过滤，为后续HPLC分析做准备。
用于斑马鱼处理的DS-CS提取物按以下方法制备：将DS和CS颗粒研磨成粉末并溶解在超纯水中，比例为1:1，最终浓度约为10 mg/mL。这些提取液在4°C、5000 g离心15分钟，重复两次。收集上清液，并通过0.45 μm和0.22 μm膜过滤。过滤后的溶液在-80°C下保存备用。
ASP的储备液（300 μg/mL）用二甲基亚砜（DMSO）制备。SAA和PF的储备液也用DMSO制备，浓度约为10 mg/mL，然后用水稀释至斑马鱼实验所需浓度。
使用岛津高效液相色谱LC-20AT系统在230 nm波长下进行HPLC分析。使用InertSustain C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行色谱分离。流动相由0.1%水溶性乙酸（A）和乙腈（B）组成，流速为1 mL/min。梯度程序如下：0-13 min，16% B；13-20 min，16%-18% B；20-25 min，18%-20% B；25-40 min，20%-23% B；40-50 min，23%-25% B；50-60 min，25% B。所有样品的进样量均为10 μL。
从上海FishBio有限公司购买4至6个月龄的野生型AB系成年斑马鱼（Danio rerio），并在自动鱼类养殖系统中饲养，温度为28.5±0.5°C，光暗周期为14:10小时，每天喂食三次新鲜孵化的盐水虾。根据标准斑马鱼繁殖协议，在繁殖箱中隔夜以2:1（雄对雌）的性别比例获得胚胎。开灯后40分钟内收集胚胎，并在28.5±0.5°C的E3培养基中冲洗。
使用1天后受精（dpf）的发育中斑马鱼胚胎进行斑马鱼存活率和孵化率测试。DS-CS提取物溶解在E3培养基中，浓度为0、100、200和400 μg/mL。SAA和PF的储备液溶解在E3培养基中，浓度为0、25、50、100和200 μg/mL。使用24孔板，每孔包含1 mL混有相应化合物的E3培养基和10个胚胎。每天密切观察胚胎有无异常。
在整个实验过程中，斑马鱼暴露在含有0.2 mM PTU的水中，从24 hpf开始。为了诱导血栓形成，将血栓诱导化学品PHZ给斑马鱼处理。在24孔板中，每孔含15个胚胎，每组设三个平行孔。对照组接受0.2 mM PTU，模型组暴露于1.5 μM PHZ和样品溶液，包括25 μg/mL的阿司匹林、各种浓度（12.5、25、50、100、200和300 μg/mL）的DS-CS以及25 μg/mL的PF与不同浓度的SAA（0-25 μg/mL）组合。在28°C的孵化器中孵育48小时后，丢弃所有孵育溶液，并用O-二茴香胺染液在28°C的黑暗环境中染色30分钟。然后快速用DMSO洗涤斑马鱼三次。通过观察和拍摄斑马鱼幼鱼心脏中的血栓，用Olympus-BX43正立荧光显微镜和cellSens Standard软件评估各种处理组的抗血栓效果。心脏染色面积（S）用Image-pro Plus 6.0软件定量。根据公式评估不同组的抗血栓效果：
为了获得全面的数据，我们首先从中药系统药理学数据库（TCMSP）检索化学成分信息。随后，使用SwissTargetPrediction和PharmMapper预测这些成分的靶标。通过UniProt数据库将识别出的成分与其对应的人类靶基因进行关联。
此外，我们访问GeneCards、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)、PharmGKB和DrugBank数据库，收集与血栓相关的靶标信息。通过将这些数据库与PF和SAA的靶标进行交叉引用，建立了一个包含与血栓和我们的研究化合物相关的共享因子的数据库。
为了揭示治疗靶基因之间的相互作用并识别关键基因，我们将共享的靶基因整合到STRING数据库中。我们指定“人类”作为有机体，并将置信参数设置为高水平（0.400）以获取PPI数据。通过拓扑分析识别关键基因。使用Cytoscape软件进行PPI网络的可视化和后续拓扑分析。结合PPI网络分析，筛选出与血栓无关的靶标，确定PF和SAA作为治疗血栓的核心靶标。
通过Metascape系统数据库对基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路进行富集分析，阐明通过生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）和关键信号通路的机制。物种聚焦在“人类”，当修正的费舍尔精确假发现率（FDR）小于0.01时，认为通路富集具有显著性。通过在线生物信息学平台对GO和KEGG结果进行可视化分析。
基于化合物和疾病之间的共同靶标以及最高度预测的通路，使用Cytoscape软件构建了一个“成分-靶标-通路”调控网络。
分子对接是预测配体和受体之间相互作用模式和亲和力的广泛使用的计算虚拟筛选技术，基于几何和能量匹配原理。在本研究中，使用TCMSP数据库获取活性成分的MOL格式文件。文件导入Sybyl-X 2.0能量优化软件程序，并保存为mol2格式供后续使用。在RSCB PDB数据库下载核心靶标蛋白的晶体结构PDB格式文件后，使用Sybyl-X 2.0软件进行配体提取和靶标蛋白脱水等一系列优化操作。使用Surflex-Dock GeomX模块观察受体蛋白和配体化合物的对接模式。使用Discovery Studio可视化和分析对接构象。然后，通过比较对接评分与原始配体，筛选出具有较高值的化合物。
在我们的研究中选择了十个靶标蛋白，包括：ALB（白蛋白，PDB ID：7X7X），SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src，PDB ID：2BDF），MMP9（基质金属蛋白酶-9，PDB ID：6ESM），CASP3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，PDB ID：1RHU），EGFR（表皮生长因子受体，PDB ID：7ZYM），FGF2（成纤维细胞生长因子2，PDB ID：2FGF），KDR（血管内皮生长因子受体2，PDB ID：6GQQ），MMP2（基质金属蛋白酶-2，PDB ID：8H78），F2（凝血酶，PDB ID：1DWC），和F10（凝血因子X，PDB ID：1XKA）。
为了阐明DS-CS对斑马鱼的分子效应，使用ABI QuantStudioTM 7 Flex实时PCR系统（美国，加州）进行qPCR实验。使用RNAiso Plus试剂提取斑马鱼的总RNA，并通过NanoDrop 2000分光光度计（美国，加州）测量RNA浓度。然后，使用Primescript RT主混合物（塔卡拉，中国）进行RNA逆转录，合成cDNA。根据制造商的协议，最终PCR反应体系为10 μL，包括5 μL HieffTM qPCR SYBR® Green主混合物，0.2 μL PCR反向引物，0.2 μL PCR正向引物，2 μL模板cDNA，和2.6 μL ddH2O。PCR的反应条件如下：95°C 5分钟初始变性，然后40个循环，95°C 10秒变性，60°C 30秒退火和延伸。β-actin被认为是参考基因，并使用2−ΔΔCT方法分析相对mRNA表达量。每个实验进行三次重复。
所有数据以三次不同实验的均值±标准偏差（SD）表示。多组比较通过IBM SPSS Statistics 19的一元方差分析（ANOVA）进行。p值小于0.05被认为具有统计学显著性。
结果
根据《中华人民共和国药典》的规定，本研究选择芍药苷（PF）和丹酚酸B（SAB）作为DS和CS配方颗粒质量评估的主要指标。在DS-CS提取物中定量测定了PF和SAB的含量，结果见表2。PF和SAB混合标准、DS颗粒、CS颗粒及两者按1:1比例混合（DS-CS提取物）的HPLC色谱图如图1所示。这种方法可以为DS和CS配方颗粒混合物中成分含量的定量提供参考。
我们评估了DS-CS提取物对斑马鱼存活率和孵化率的影响。结果发现，随着药物浓度从100 μg/mL增加到400 μg/mL，暴露时间从24小时后受精（hpf）延长到96 hpf，斑马鱼的存活率呈剂量依赖性下降。特别是当浓度达到400 μg/mL时，从72 hpf开始，存活率显著低于对照组（p < 0.05）。然而，在100 μg/mL和200 μg/mL浓度下，斑马鱼的存活率与对照组没有显著差异。此外，400 μg/mL浓度显著抑制了斑马鱼的孵化，而100和200 μg/mL浓度对孵化率没有显著影响。随后，我们评估了SAA和PF对斑马鱼存活率和孵化率的影响。结果显示，在25和50 μg/mL浓度下，PF和25 μg/mL浓度下的SAA，斑马鱼的存活率与对照组没有显著差异。在100和200 μg/mL浓度下，PF处理组在48、72和96 hpf时，孵化率与对照组相比有显著差异。此外，SAA在相同浓度下（100和200 μg/mL）显著抑制了斑马鱼的发育。以上结果表明，PF和SAA在较高浓度下显著影响斑马鱼的孵化率（图2）。
我们在体内斑马鱼血栓模型中评估了DS-CS提取物的抗血栓潜力，结果如图3B所示。25、50、100、200、300 μg/mL DS-CS提取物处理组的血栓抑制率分别为28%（P < 0.05）、37%（P < 0.001）、39%（P < 0.001）、40%（P < 0.001）和42%（P < 0.001），表明DS-CS提取物在PHZ诱导的斑马鱼血栓模型中具有显著的治疗效果（图3C）。通过显微镜检查进一步证实了抗血栓效果，观察到心脏区域内保留了深红色染色（图3A）。这种视觉确认强调了DS-CS提取物的抗血栓特性。
图4展示了在PHZ诱导的斑马鱼血栓模型中，25 μg/mL的PF，0、1.56、3.13、6.25、12.5和25 μg/mL的SAA，以及它们的组合在48小时后对斑马鱼的抗血栓活性。与模型组（PF和SAA浓度均为0 μg/mL）相比，SAA单独治疗在6.25、12.5和25 μg/mL浓度下显示出显著差异，并且呈现剂量依赖性。PF在25 μg/mL浓度下，无论单独使用还是与不同浓度的SAA组合使用，均对PHZ诱导的心脏红细胞减少表现出显著的救助效果。值得注意的是，当PF和SAA同时使用时，随着SAA浓度从1.56增加到25 μg/mL，抗血栓效果呈剂量依赖性反应，而PF保持在25 μg/mL浓度。最显著的救助效果出现在PF和SAA均以25 μg/mL浓度、1:1比例组合使用时。
单独使用SAA和PF治疗血栓的效果分别为21%和34%。当PF和SAA以25 μg/mL + 25 μg/mL和25 μg/mL + 12.5 μg/mL的浓度联合使用时，对血栓的治疗效果分别提高到43%和51%，显示出与单独使用PF相比显著增强的效率。此外，PF和SAA联合应用的抗血栓效率与DS-CS提取物组非常接近，表明PF和SAA可能是DS-CS中的关键活性成分。
利用传统中医药系统药理学数据库（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）提取了丹参（DS）和川芎（CS）的化学成分。通过PharmMapper和Swiss Target Prediction数据库获取了丹参酮IIA（PF）和川芎嗪（SAA）的潜在靶基因。经过UniProt标准化和去重处理，共识别出149个PF和SAA的潜在靶基因。
为了富集血栓形成相关的靶基因，进行“Thrombosis”关键词搜索，从GeneCards中获得了1123个血栓形成相关的靶基因。此外，从DrugBank中获得了34个，从PharmGKB中获得了63个，从OMIM数据库中获得了11个。去重后，共收集到1177个血栓形成相关的靶基因，用于进一步分析。
通过Venn分析，将PF和SAA的149个潜在靶基因与1177个血栓形成相关的靶基因进行交集分析。此分析揭示了56个药物-疾病交集靶基因，如图5所示，这些靶基因随后进行了进一步的分析。
对56个药物-疾病交集基因靶点使用STRING数据库构建了PPI网络，如图6A所示。该网络由56个节点和446条边组成，平均节点度数为15.9，PPI富集P值小于0.05。将STRING分析结果导入Cytoscape软件，使用网络分析插件统计网络图中的节点并根据节点度数分析其连通性。节点度数越高，网络中与该节点相关的生物功能越多。PPI分析结果显示，PF和SAA的治疗靶点具有多方面的网络和协同相互作用的显著特征。构建的网络如图6B所示。连接度最高的十个靶点是：ALB、SRC、MMP9、EGFR、FGF2、KDR、MMP2、F2和F10。
通过Metascape分析，获得了828个显著富集的基因本体论（GO）条目，包括714个生物过程（BP）、76个分子功能（MF）和38个细胞组分（CC）类别。在BP类别中，主要主题包括血管生成、血液凝固和血管生成调控。在CC类别中，突出的主题是细胞外基质、外包囊结构和囊泡腔，而在MF类别中，显著的功能有丝氨酸型内肽酶活性、蛋白激酶活性和肽酶活性。
这些发现表明，丹参酮IIA（PF）和川芎嗪（SAA）可能通过调节代谢过程、炎症因子、细胞增殖、蛋白质运输、转录因子活性和其他生物过程来发挥抗血栓作用。进一步的分析识别出总共123个富集通路，最显著的富集通路包括脂质代谢、动脉粥样硬化、流体剪切应力、PI3K-Akt信号通路和VEGF信号通路。这些通路主要与炎症、血管生成、免疫、激素调节等有关。基于FDR和命中基因数量，前10个GO条目和前15个京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路如图7A、B所示。
为了揭示丹参酮IIA（PF）和川芎嗪（SAA）在血栓管理中的复杂多成分和多靶点效应，并深入了解其作用机制，构建并分析了化合物-靶点-通路（C-T-P）网络。该网络由80个节点和306条边组成，如图8所示。评估网络拓扑参数有助于识别在网络中起重要作用的关键节点，包括在网络中起重要作用的化合物和靶点。在此背景下，使用节点度数来识别重要成分和核心靶点。值得注意的是，PF和SAA展示了同时影响多个靶点的能力，而某些靶点也可以同时被多种化合物调节。
分子对接分析揭示了丹参酮IIA（PF）和川芎嗪（SAA）与一组靶蛋白（包括ALB、SRC、MMP9、CASP3、EGFR、FGF2、KDR、MMP2、F2和F10）的对接评分，表明了其结合亲和力（见表3）。本文展示了评分最高的前三种对接构象的相互作用图，详细的氢键和氨基酸残基相互作用总结在表4和表5中。
SAA通过与GLN791、CYS775、MET790、ASP855、LYS745、MET793和ASP800的相互作用，表现出稳定的结合（图9A）。SAA在F10的活性位点内与ARG143、GLN192、GLU146、LYS147、GLY218、ASP189、ALA190、SER195、SER214和GLN61建立了氢键相互作用（图9B）。SAA与SRC的相互作用包括与ASP404、ASN391、LYS295、PHE278、ASP348、LEU273、MET341和CYS277形成氢键（图9C）。
PF通过与SRC靶蛋白上的ASP348、THR338、MET341和GLU339的相互作用，建立了稳定的结合（图10A）。在EGFR的活性位点内，PF与ASP800、SER797、THR854、LYS745和MET793形成氢键相互作用（图10B）。PF与F10的结合通过与GLN61、GLN192、TYR99、LYS96和GLU97形成氢键相互作用（图10C）。
为了验证分子对接分析筛选出的三个靶蛋白（EGFR、SRC和F10），研究了斑马鱼中的mRNA表达水平（图11）。提取斑马鱼组织的mRNA，并在不同浓度的DS-CS干预下进行检测。通过qRT-PCR分析发现，与正常对照组相比，EGFR的mRNA表达在PHZ组中下降。DS-CS上调了EGFR mRNA的表达水平，不同浓度的DS-CS处理显著提高了PHZ诱导的斑马鱼EGFR的mRNA水平（P < 0.05）。此外，与正常对照组相比，PHZ组中F10和SRC的mRNA表达水平升高。DS-CS下调了F10和SRC的mRNA水平（P < 0.05），从而改善了血栓形成。
本研究使用苯肼诱导的斑马鱼血栓模型，评估了丹参-川芎组合（DS-CS）及其活性成分川芎嗪（SAA）和丹参酮IIA（PF）的药理活性。结果显示，在12.5 μg/mL到200 μg/mL的浓度范围内，DS-CS显著改善了PHZ引起的心脏血流减少，特别是在较高浓度下，表明其具有显著的抗血栓作用。
此外，我们研究了SAA和PF的联合抗血栓活性，发现相比于单独使用PF，联合使用SAA和PF显示出显著差异。在25 μg/mL SAA和25 μg/mL PF的比例下，联合应用展示了明显的抗血栓效果，可能是通过加成机制实现的。联合使用PF和SAA的治疗效果优于单独使用PF，表明其具有增强的功效。
为了阐明SAA和PF的潜在靶点及其作用机制，我们利用了网络药理学的方法。通过综合分析，识别出了10个关键基因，即ALB、SRC、MMP9、CASP3、EGFR、FGF2、KDR、MMP2、F2和F10，这些基因与PF和SAA的抗血栓属性密切相关。结合PPI分析和KEGG通路探索，发现SAA和PF主要影响与炎症、血管生成、免疫、激素调节以及脂质代谢和动脉粥样硬化相关的通路。
分子对接研究证实，SRC、EGFR和F10与PF和SAA具有较强的结合亲和力。qPCR实验结果显示，DS-CS上调了EGFR的mRNA表达水平，同时抑制了F10和SRC的mRNA表达水平，从而改善了血栓形成的状况。
总之，本研究验证了DS-CS及其成分的抗血栓潜力，揭示了其潜在的作用机制。这些发现为血栓性疾病的潜在治疗开发提供了新的见解，强调了DS-CS在临床应用中的重要性。
