文献：Xin S, Zhang M, Li P, Wang L, Zhang X, Zhang S, Mu Z, Lin H, Li X, Liu K. Marine-Fungus-Derived Natural Compound 4-Hydroxyphenylacetic Acid Induces Autophagy to Exert Antithrombotic Effects in Zebrafish. Mar Drugs. 2024 Mar 27;22(4):148. doi: 10.3390/md22040148. PMID: 38667765.
杂志：Marine Drugs
海洋天然产物是新型药物的重要来源。本研究从海洋源真菌Emericellopsis maritima Y39-2中分离得到4-羟基苯基乙酸(HPA)，首次报道HPA的抗血栓活性及其作用机制。利用斑马鱼模型，我们发现HPA具有较强的抗血栓活性，因为它可以显著增加心脏红细胞、血流速度和心率，减少尾侧血栓，并逆转花生四烯酸(Arachidonic Acid, AA)引起的炎症反应。进一步的转录组分析和qRT-PCR验证表明，HPA可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路调节自噬发挥抗血栓作用。
介绍
血栓可导致急性心肌梗死、缺血性心脏病、瓣膜病、外周血管疾病和其他心血管疾病(CVDs)，每年约有2000万人死于心血管疾病。由于老龄化、生活方式的改变和人口的扩张，血栓性疾病对医疗系统的负担正在增加。现有研究表明，NF-κB、Toll样受体、MAPK、mTOR、PI3K、自噬等信号通路与血栓形成相关。乙酰水杨酸(ASA)、华法林和肝素是目前应用最广泛的抗血栓药物;然而，它们也有副作用，包括出血和耐药性。因此，迫切需要比现有药物更安全、更可靠的新型抗血栓药物。
天然产物是发现抗血栓药物的重要来源。海洋的低营养环境、低温、高盐度、高压和低氧含量使生物具有特殊的代谢适应机制，并产生新颖的结构和多种生物活性。海洋真菌是天然产物的丰富来源。目前已发现的Emericellopsis真菌属有27种，包括23种4变种。近年来，从Emericellopsis sp.中分离出大量的次生代谢物，如多肽、萜类、蒲公英、生物碱、黄酮类等。到目前为止，关于Emericellopsis的次生代谢产物的生物活性研究主要集中在抗炎、抗菌、抗肿瘤等方面，但关于其抗血栓活性的研究较少。
斑马鱼是一种小型水生脊椎动物，已成为筛选天然活性化合物的广泛应用的模式生物。斑马鱼模型具有高通量的特点，已成为药物筛选和评价体系中连接细胞模型和哺乳动物模型的重要纽带。斑马鱼的血栓形成机制与人类相似，其血小板表达血小板糖蛋白GPIIb/IIIa和GPIb，同时具有内源性和外源性凝血途径。实验表明，临床常用的一些抗血栓药物对斑马鱼的疗效与哺乳动物相似，表明在斑马鱼模型中筛选抗血栓药物的可靠性。在蛋白质水平上，斑马鱼与人类关键部位的同源性接近100%，因此斑马鱼也非常适合用于信号通路的研究和靶向药物的筛选。AA和苯肼(phenyl hydrazine, PHZ)是构建斑马鱼血栓模型的常用方法，用于抗血栓活性成分的筛选和机制研究。
之前，我们利用斑马鱼模型研究了来自11种不同海洋来源真菌的小规模发酵提取物的抗血栓活性。结果表明，海洋源真菌Emericellopsis maritima Y39-2提取物具有抗血栓活性。在本研究中，我们重点从Y39-2中分离出具有生物活性的天然产物，并分离出代谢物4-羟基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid, HPA)(图1)，表明其具有显著的抗血栓活性。机制研究表明，HPA可通过抑制mTOR信号通路激活自噬，从而发挥抗血栓作用。
HPA是一种酚类化合物，最初是从病原植物Hypochnus sasakii[26]中分离出来的，随后在真菌oiddendron sp.和Neofusicoccum parvum、褐藻Undaria、结肠微生物、中草石菖蒲和人唾液中发现。该化合物具有广泛的作用，如减轻脓毒症诱导的急性肾损伤，预防急性对乙酰氨基酚诱导的肝损伤，减轻肺损伤的炎症和水肿，以及调节生长、抗焦虑、抗氧化、抗菌和杀线虫活性。这是首次探讨HPA的抗血栓活性及其机制。本研究结果拓宽了潜在抗血栓药物的资源，为开发新型抗真菌药物奠定了基础。
材料与方法
采用SZX16荧光显微镜、DP2-BSW图像采集系统(Olympus, Tokyo, Japan)和AXIO-V16荧光显微镜(Zeiss, Oberkochen, Germany)观察和捕捉图像。给药后使用HPG280-BX照明培养箱(中国哈尔滨东联电子科技发展有限公司)进行斑马鱼培养。采用斑马鱼培养系统(中国北京伊森科技发展有限公司)培养斑马鱼。在Bruker Avance光谱仪(Bruker, Billerica, MA, USA)上记录NMR谱，操作频率为400 (1H)和100 (13C) MHz，以TMS作为内标准。在Agilent 6210 ESI/TOF质谱仪(Agilent, Santa Clara, CA, USA)上获得ESI-ms数据。
真菌材料
从2013年印度洋(88°59′51″E, 2°59′54″S)海水样本中分离到该真菌，通过ITS序列分析和rDNA扩增鉴定为Emericellopsis maritima (GenBank: MH871998.1)。菌株放置于山东省科学院生物研究所药物筛选研究实验室。
发酵培养基由50 g大米和75 mL海水组成，置于500 mL Erlenmeyer瓶中，在40瓶发酵培养基中室温培养60 d。用乙酸乙酯及二氯甲烷:甲醇(1:1)混合物萃取所有发酵材料两次。然后将提取物减压浓缩，用水分散，用等体积乙酸乙酯萃取4次，得到乙酸乙酯相，再减压浓缩得到粗提物。粗提物经硅胶柱层析(CC)，石油醚:乙酸乙酯(100:0:100)洗脱，分为7个组分(Frs. 1 ~ 7)。将Fr. 6施加到二氧化硅CC并且然后使用HPLC使用30% MeOH-H2O纯化，得到化合物HPA。
HPA:白色结晶粉末，ESI-MS m/z: 151 [m-H]-。13C NMR (100 mhz, CD3OD) δC: 175.0 (C-8)，156.0 (C-4)，129.9 (C- 2,6)，125.6 (C-1)， 114.8 (C-3,5)， 39.9 (C-7);1H NMR (400 MHZ, CD3OD) δH: 7.09 (2H, d, J=8.8 Hz, H-2,6)， 6.72 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3,5)， 3.47 (2H, s, H-7)。以上数据与文献报道一致。
在立体显微镜下选取72 hpf的健康斑马鱼幼鱼，转移至24孔板(每孔10条幼鱼)，用不同浓度(0、164.3、328.6、657.2、1314.5、1971.7、2629.0、3286.2、3943.5、5258.0µM)的HPA处理6 h。所有治疗均重复进行，每种情况的受试者数为30。使用奥林巴斯显微镜对斑马鱼进行观察和成像，并测定各组斑马鱼死亡率。采用GraphPad Prism 9.0软件(GraphPad Software, Inc.，San Diego, CA, USA)分别以HPA浓度和死亡率为横坐标和纵坐标绘制死亡曲线，通过非线性回归(曲线拟合)计算LC1。
生物测定方案
本实验使用的斑马鱼(Danio rerio)品系为AB野生型和Tg (zlyz:EGFP)转基因品系。雄性和雌性斑马鱼分别在具有14/10小时光/暗周期的自动循环水族馆中维持在28.0°C±0.5°C。胚胎取自自然产卵。受精后将卵收集、清洗、亚甲蓝溶液消毒后，置于含5.0 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.4 mM CaCl2、0.16 mM MgSO4的斑马鱼胚胎培养水中，置于28.0℃±0.5℃恒温光培养箱中。每24 h更换1次培养水。
于受精后72 h (hpf)选取健康斑马鱼幼鱼，置于24孔板中(每孔10条幼鱼)。将植物随机分为7组:空白对照组、血栓模型组(80µM AA)、阳性对照组(80µM AA + 125.0µM ASA)和不同浓度HPA处理组(80µM AA + 82.2、164.3、328.6、657.2µM HPA)。用ASA和HPA处理6 h后，吸入溶液，空白对照组用养鱼用水处理，其余各组用80µM AA处理。培养板在28±0.5℃下孵育1小时。所有处理均重复3次，每种情况的受试者人数为30。
药物处理结束后，将溶液移出，然后用1.0 mg/mL的邻苯二胺染液在避光条件下染色10 min。用斑马鱼培养液冲洗3次后，每条斑马鱼用4%多聚甲醛固定，然后在蔡司荧光显微镜下观察并拍摄斑马鱼尾血栓。使用Image-Pro Plus 5.0软件(Media Cybernetics, Inc.， Bethesda, MD, USA)测量并计算斑马鱼尾侧血栓的染色面积和强度。
染色、漂洗、固定后，在蔡司荧光显微镜下观察并拍摄每条斑马鱼。采用Image-Pro Plus 5.0软件，根据染色面积定量血栓密度，并分析心脏内红细胞的强度。
药物处理后，每组斑马鱼用斑马鱼培养水冲洗3次，用奥林巴斯荧光倒置显微镜观察。获取斑马鱼的心率，并使用血流系统Zebralab (ViewPoint, Lyon, France)从斑马鱼泄殖腔后血管记录一段15 s的血流视频。采用MicroZebraLab BloodFlow 3.4.6软件(ViewPoint, Lyon, France)进行血流速度分析。
选取携带绿色荧光蛋白(EGFP)标记巨噬细胞的转基因斑马鱼Tg (zlyz:EGFP)进行实验。药物处理后，在Olympus倒置荧光显微镜下记录斑马鱼尾侧炎性细胞图像。计数向尾脊索及以上部位迁移的尾侧炎性细胞数量。
在72 hpf时，选取正常斑马鱼幼鱼，转移至6孔板。随机分为空白对照组、血栓模型组(80µM AA)和HPA组(80µM AA + 164.3或328.6µM HPA)，每组50条幼鱼。各组的药物治疗遵循与前面相同的策略。所有治疗均重复三次。TRIzol试剂提取斑马鱼总RNA。我们使用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)评估了RNA的完整性。RNA样品制剂的原料为总RNA。简单地说，利用聚t寡聚磁珠将mRNA从总RNA中分离出来。利用二价阳离子在第一链合成反应缓冲液(5X)中进行高温片段化，然后使用NEB常用建库方法建立文库。接下来，诺和金公司(北京)进行了转录组测序和分析。
采用DESeq2 (version 1.20.0)软件(诺和金有限公司，天津，中国)进行两种比较组合(AA vs. control和HPA vs. AA)之间的差异表达分析。采用基于负二项分布的模型识别基因表达数据中的DEGs。P < 0.05为差异表达基因。对差异表达基因进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。
根据转录组分析结果，选择7个关键差异表达基因进行qRT-PCR分析。所用引物的名称和序列见表1。样本处理和收集方法与前面相同，使用RNA提取试剂盒(Vazyme，南京，中国)从样本中提取总RNA。用Vazyme逆转录试剂盒(南京，中国)逆转录总RNA获得cDNA。每孔的qRT-PCR体系由2µL的cDNA (10 ng/µL)、0.4µL的正向引物、0.4µL的反向引物、7.2µL的ddH2O和10µL的SYBR qPCR主组合(Vazyme，南京，中国)组成。qRT-PCR在LightCyler 96系统(罗氏，巴塞尔，瑞士)中进行，反应条件为95℃30 s，然后在95℃15 s和60℃30 s中循环40个周期。β-actin表达水平作为其他基因表达的标准化对照。qRT-PCR数据采用比较阈值循环法(2-ΔΔCt)进行分析，计算各组基因的相对表达量。
采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。所有实验数据均显示为平均值±SEM。组间比较采用单因素方差分析和Dunnett′st检验。当p值小于0.05时，认为组间差异有统计学意义。
结果
我们用不同浓度的HPA处理受精后72小时(hpf)的幼虫6小时，结果如图2所示。暴露后6小时(hpe)，暴露于0 ~ 657.2µM HPA的斑马鱼幼虫未检测到死亡。当HPA处理浓度从1314.5µM增加到3943.5µM时，斑马鱼幼鱼死亡率从6.67%急剧增加到100%。根据斑马鱼幼鱼死亡率绘制致死曲线，计算出HPA 1%致死浓度(LC1)为914.6µM。所有HPA治疗组均未观察到畸形。根据检测结果，选择82.2、164.3、328.6、657.2 μ M浓度用于HPA的抗血栓活性评价。
如图3所示，模型组斑马鱼尾侧血栓面积和染色强度明显大于对照组，说明AA可显著诱导尾侧血栓形成。当HPA浓度在82.2µM ~ 328.6µM范围内时，ASA组和所有HPA处理组尾端血栓面积和染色强度均呈浓度依赖性减少。
心脏红细胞染色结果示于图4中。与空白对照组相比，AA显著降低斑马鱼心脏红细胞的染色面积和染色强度。当HPA浓度为164.3和328.6µM时，心肌红细胞染色面积和染色强度明显增加，表明HPA具有较强的抗血栓活性。结合斑马鱼尾血栓实验的结果，尾血栓的面积和染色强度与斑马鱼尾血栓的染色面积和染色强度成反比，这与以往的研究一致。
各组迁移的炎性细胞数量如图5所示。我们计数了斑马鱼泄殖腔后向侧线迁移的巨噬细胞的数量，即图5A中红色虚线区域中的绿色荧光点的数量。AA引起迁移的炎症细胞数量显著增加。与ASA组相似，在82.2 ~ 657.2 μ M浓度范围内，HPA可显著减少斑马鱼体内炎症细胞的迁移，逆转AA引起的炎症反应。
我们分析了每组斑马鱼的血流速度，并统计了1分钟内的心率(图6)。AA组斑马鱼的血流速度和心率大幅下降。与AA组相比，HPA 164.3、328.6、657.2µM暴露组斑马鱼的血流速度和心率明显大于AA组。HPA浓度为657.2µM时，斑马鱼血流速度和心率低于HPA浓度为164.3µM和328.6µM时，这表明HPA的作用具有非典型的剂量效应。
图7显示了差异表达基因(DEGs)的分布。与对照组相比，在AA组中发现了5090个显著差异基因，包括2572个上调基因和2518个下调基因。与AA组相比，HPA组有2641个差异表达基因(DEGs)，其中1452个上调，1189个下调。两种比较组合(AA vs对照和HPA vs AA)共有1035个DEGs共表达，其中101个DEGs在AA vs对照中表达上调，在HPA vs AA中表达下调，90个DEGs在AA vs对照中表达下调，在HPA vs AA中表达上调。总之，在上述两次比较中，191个DEGs的表达趋势相反。
对191个DEGs进行基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析，得到30个最显著的词条如图8所示。这些显著差异表达基因在转录负调控、脊索发育、反式高尔基体网络运输囊泡膜、RNA聚合酶结合和转录激活因子活性等基因功能中富集。
为了验证转录组分析的结果，我们选择了mTOR和自噬信号通路中的基因进行qRT-PCR。如图10A所示，与对照组相比，AA显著增加了PI3K/AKT/ mtor信号通路中pik3r1、pik3r3b、akt1和mtor基因的表达。与HPA孵育后，这些基因的表达水平均降低。对于自噬信号通路，结果显示(图10B) AA处理下调了斑马鱼中ulk1b、eif2ak3、becn1和ambra1a的表达水平，而HPA处理上调了它们的表达水平。因此，HPA抗血栓活性的机制涉及pik3r1、pik3r3b、akt1和mtor的下调，以及ulk1b、eif2ak3、becn1和ambra1a的上调。
血栓形成是全球发病率和死亡率的主要原因，迫切需要安全可靠的抗血栓药物。海洋天然产物是很有前景的药物来源，已经从海洋中分离出许多具有抗血栓活性的天然产物。在斑马鱼模型中，AA可用于诱导实验性血栓形成。本文以aa诱导的AB系斑马鱼为模型，研究HPA的抗血栓作用。为了确定HPA用于斑马鱼抗血栓活性评价的安全浓度，我们进行了HPA的安全浓度试验，得到HPA的LC1为914.6µM。
血栓形成可阻止血液回流心脏，降低心脏红细胞数量，与AA治疗组结果一致，提示AA诱导血栓形成。HPA显著缩小了尾侧血栓面积，并恢复了回心血量。血栓形成会减慢血流量，降低心率。在本研究中，我们发现HPA组的血流速度和心率显著大于AA组。血栓形成可引发免疫反应，而免疫反应又伴有炎症。我们的实验还表明，AA处理组的迁移炎症细胞数量显著增加，而HPA处理组的迁移炎症细胞数量明显减少。生物检测方案的结果表明，HPA的抗血栓活性存在非典型剂量效应。尾血栓试验结果表明，浓度为82.2 ~ 328.6µM的HPA具有抗血栓活性，且呈剂量依赖性。在另一实验中，我们发现当HPA浓度为82.2µM时，心脏红细胞、尾侧血流速度和心率与AA组相比无显著性差异。这可能是由于HPA在82.2µM时的抗血栓作用有限，导致这些指标的意义不大。657.2µM HPA处理组的抗血栓活性低于328.6µM HPA处理组，这可能是由于自噬过度所致。与适当增强的自噬相比，过度的自噬可导致细胞死亡，而巨噬细胞自噬性死亡释放炎症因子，触发炎症反应，平滑肌细胞和血管内皮细胞自噬性死亡降低斑块稳定性，促进血栓形成。
根据转录组分析和qRT-PCR验证，HPA通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路和增强自噬发挥其抗血栓作用。既往研究表明，血小板活化和聚集是血栓形成的病理基础，动脉粥样硬化斑块的破裂或侵蚀触发血小板聚集，导致局部凝血激活和血栓形成。PI3K/AKT/mTOR信号通路在血栓形成过程中发挥重要作用。抑制PI3K/AKT通路可抑制血小板活化和黏附，从而抑制血栓形成，mTOR被PI3K/AKT信号通路磷酸化Ser2448，在血小板聚集中起关键作用。在本研究中，HPA显著下调pik3r1、pik3r3b、akt1和mtor的mRNA表达水平，提示HPA抑制PI3K/AKT/ mtor信号通路。此外，抑制PI3K/AKT/mTOR通路可诱导自噬，适当增强巨噬细胞自噬可抑制动脉粥样硬化斑块的形成和发展，促进斑块稳定，防止斑块破裂，从而抑制血栓形成[7,52,59,60]。ulk1b基因在自噬中起重要作用，作为ulk1b下游基因的becn1、ambra1a可参与自噬膜分离过程，eif2ak3可诱导自噬。在我们的研究中，164.3µM和328.6µM HPA上调了ulk1b, eif2ak3, becn1和ambra1a的mRNA表达水平，表明HPA可以诱导自噬。
综上所述，从海洋真菌Emericellopsis maritima Y39-2中分离得到4-羟基苯乙酸，并利用斑马鱼模型测定其抗血栓活性。HPA显著改善斑马鱼AA诱导的血栓形成。具体而言，它可以增加斑马鱼心脏红细胞、血流速度和心率，减少尾部血栓，逆转AA引起的炎症反应。进一步研究表明，HPA通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路和诱导自噬发挥其抗血栓作用。
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