【文献解读】斑马鱼Foxc1a通过直接调节wwtr1和nkx2.5的表达来控制心室腔的成熟

影响因子：6.6

心腔成熟是心脏发育过程中的一个重要过程。这一关键过程的紊乱会导致一系列先天性心脏缺陷。Foxc1a是一种关键的转录因子，据报道可调节心脏祖细胞的特异性。然而，关于Foxc1a在调节心腔成熟中的作用知之甚少。之前，我们报道了foxc1a基因敲除的斑马鱼胚胎存在心脏结构和功能异常。本研究中，我们观察到在心腔成熟过程中，foxc1a基因敲除的斑马鱼胚胎的心室结构和心肌细胞增殖消失。为了观察Foxc1a在活体胚胎心脏中的内源性定位，我们使用TALEN在foxc1a基因组位置插入了eyfp。敲入斑马鱼的分析表明，foxc1a在心腔发育过程中广泛表达于心室心肌细胞中。通过心脏RNA测序分析发现Hippo信号效应物wwtr1表达下调。双荧光素酶和染色质免疫沉淀分析表明，Foxc1a可直接结合到wwtr1启动子区域的三个位点上。此外，wwtr1 mRNA的过度表达足以在心腔成熟过程中逆转心室缺陷。条件性过表达nkx2.5也可部分挽救心腔发育过程中的心室缺陷。这些发现表明，在心室心腔成熟过程中，wwtr1和nkx2.5是Foxc1a的直接靶点。

在脊椎动物胚胎发育过程中，心脏是第一个形成功能的器官。了解心脏发生对于发现治疗心脏疾病的新疗法至关重要。最近利用人类、小鼠和鸡胚胎的研究使我们极大地加深了对心脏发育的理解。斑马鱼（Danio rerio）已成为研究心脏发育的强大模式生物，因为这种动物可以直观地观察活体生物中的心脏发育过程，并具有遗传可塑性。心脏腔室成熟涉及三个相互关联的过程，即小梁的形成、传导系统的建立和致密心肌的形成，这增加了心肌表面血液氧交换的面积。涉及产生壁成熟模式的过程在不同物种之间高度保守。

FOXC1基因突变或拷贝数变化的患者表现出多种先天性心血管疾病，如主动脉缩窄、二尖瓣发育不良和房间隔缺损。Forkhead box（Fox）基因无义突变动物模型中的心脏表型与人类FOX基因突变患者有诸多相似之处。在H9c2大鼠细胞和小鼠中的研究表明，FOXC1蛋白通过直接与Tlr3/4启动子结合来调节心肌缺血。Foxc1/Foxc2双敲除小鼠表现出产前或围产期的致命性，并表现出涉及流出道、淋巴管和房室瓣膜的各种心血管缺陷。

斑马鱼携带有两个foxc1基因，即foxc1a和foxc1b。从斑马鱼获得的数据支持Foxc1在心脏发育中的作用。在所有报道的foxc1a敲除系中均可观察到明显的心脏水肿，包括foxc1a^p162、foxc1a^ua1017、foxc1a^el542和foxc1a^nju18。我们对foxc1a^nju18的研究表明，foxc1a通过直接调节心脏谱系主调控因子nkx2.5的表达来影响心脏祖细胞发育。然而，对foxc1a在斑马鱼心脏生成中的作用，特别是在心室腔发育中的角色，仍知之甚少。

Hippo通路是一种在脊椎动物中高度保守的信号通路，可介导下游基因表达和心肌细胞的增殖、分化和凋亡。YAP1和WWTR1（又称TAZ）是Hippo通路两个重要的下游效应物，可抑制心肌细胞的再生活性。当Hippo信号被激活时，MST1、MST2和SAV1形成复合物，磷酸化并激活与MOB1相互作用的LATS1和LATS2激酶。后者进一步磷酸化转录共激活因子YAP1和WWTR1。YAP1和WWTR1可阻断组织器官中与生长相关的基因转录。小鼠YAP1/WWTR1可促进心脏相关基因的转录，包括Pik3cb、Dhrs3、Sox17等。之前对斑马鱼的研究表明，wwtr1在心室致密壁表达。wwtr基因缺陷的斑马鱼不形成成熟的梳状脊，这通常是对Nrg2a刺激和tp1 Notch报告基因表达调节的反应而发育形成的。

Nkx2-5是小鼠原发性和继发性心脏领域中心脏祖细胞的进化保守标记基因。此外，据报道Nkx2-5在小鼠胚胎心脏的心外膜中胚层和心肌中表达。对人类先天性心脏病发病机制的研究记录了NKX2-5突变的作用。此外，在E12.5（心室小梁开始出现时）敲除Nkx2-5的小鼠表现出心脏异常，包括结构、传导和收缩缺陷。这些研究表明，Nkx2.5可能通过响应Foxc1a参与心室的成熟调节。

本研究中，我们观察到foxc1a^nju18突变斑马鱼中异常小梁形态的减少。我们将增强型黄色荧光蛋白（Eyfp）整合到foxc1a的终止密码子上游，并构建了敲入系foxc1a^nju80，以追踪foxc1a⁺细胞系。我们观察到foxc1a在受精后26至63小时内表达于心内膜细胞中。随后，foxc1a在64小时后开始在心肌细胞中表达，并通过直接调节wwtr1和nkx2.5维持心室成熟后期的心肌细胞增殖。我们的研究证明了Foxc1a作为心室腔发育的关键调节因子所起的前所未知的作用。

材料与方法

所有程序均经过南京大学模式动物研究中心机构动物关怀和使用委员会的审查和批准。

本项目中使用的斑马鱼在南京大学模式动物研究中心的斑马鱼设施中饲养，饲养条件如之前所述（Li等，2015a）。斑马鱼品系包括foxc1a^nju18、foxc1a^nju80、foxc1a^nju81、Tg(myl7:eGFP)^m225、Tg(myl7:nDsRed)、Tg(kdrl:ras-mCherry)和TU。

转基因斑马鱼的心脏使用ZEISS LSM880共聚焦显微镜（Carl Zeiss，德国奥伯科亨）进行拍照。胚胎在胚胎培养基中培养至所需发育阶段（超过24小时的胚胎需添加0.003% 1-苯基-2-硫脲[PTU]以防止色素沉着）。然后将活胚胎嵌入含有0.2 mg/mL三卡因（Sigma，美国圣路易斯）、25 mM 2,3-丁二酮单氧化物（BDM）（Sigma）的1%低熔点琼脂糖中，置于玻璃底培养皿中。

斑马鱼心脏的选择如之前所述（Jie等，2015），简要描述如下。我们从Tg(myl7:eGFP)^m225;foxc1a^nju18/+自交胚胎中选择GFP+胚胎。当它们发育至96 hpf时，我们选择出现心包积液的胚胎，并将其置于1.5 mL EP管中。用10%胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）清洗胚胎三次，然后用5 mL注射器泵快速冲洗5至6次，再转移至新的6 cm培养皿中。我们使用荧光显微镜识别并选择心脏，将其放入新的培养基中，并重复该过程三次。最后，我们将心脏转移到1.5 mL EP管中，在室温下以1000 g离心3分钟，去除培养基，每80个心脏加入100 mL Trizol（Invitrogen，美国圣地亚哥）。转录组测序由上海生信生物信息科技有限公司（中国上海）进行。

我们进行了实时定量PCR，以检测wwtr1、nkx2.5和Notch信号基因的相对表达水平。使用Direct-zol RNA MiniPrep（Zymo Research，美国加利福尼亚州欧文）提取了如上所述解剖的96小时斑马鱼胚胎中的总RNA。使用HiScript II 1st Strand cDNA合成试剂盒（南京Vazyme）进行cDNA逆转录。所有基因的表达水平均以gapdh mRNA的观测水平进行标准化。

RNA探针的序列如表S1所示，并如先前所述进行合成（Li等人，2015a）。整体原位杂交如先前所述进行（Zhao等人，2005）。杂交后，使用DP70数码显微镜（日本东京奥林巴斯）对每个胚胎进行拍照。每个胚胎通过表S1中描述的PCR扩增进行基因型鉴定（Yue等人，2018）。

我们使用逆转录PCR和表S1中列出的引物从96小时斑马鱼胚胎的总RNA中克隆了wwtr1 CDS。在正向引物上游的5'端添加T7启动子后，扩增wwtr1 mRNA模板。使用mMassage T7试剂盒和Poly（A）Tail Kit（Invitrogen，美国圣地亚哥）进行体外合成。每个单细胞斑马鱼胚胎显微注射约50 pg wwtr1 mRNA。

斑马鱼胚胎通过Tg(myl7:nDsRed); foxc1a^nju18进行自交。突变体和野生型胚胎通过心包水肿表型进行区分。在83 hpf时，将胚胎暴露于5 mM EdU/ 10% DMSO中1小时，然后用4%多聚甲醛固定一夜。使用Baseclick EdU-Click Assays（BCK-EdU488-1，Sigma）评估细胞增殖情况。然后，将胚胎装入1%低熔点琼脂糖中，并使用Zeiss LSM880进行可视化。EdU指数计算为EdU阳性细胞和myl7阳性细胞之比。

我们合成了1550 bp的wwtr1启动子（NM_001037696.1）（南京Genescript公司），并通过一步克隆试剂盒（南京Vazyme）将启动子序列重组到pGL3-Basic荧光素酶报告载体中，如表S1中列出的引物所示。重组质粒被命名为pGL3-1.5 kb-wwtr1。从pGL3-1.5 kb-wwtr1中扩增出935 bp和662 bp的wwtr1启动子，并使用表S1中列出的引物以相同的方式重组到pGL3-Basic质粒中。pGL3-P1-wwtr1、pGL3-P2-wwtr1、pGL3-P3-wwtr1和pGL3-P123-wwtr1也通过重叠PCR从pGL3-1.5 kb-wwtr1中扩增出来。将约20 pg fxc1a mRNA、50 pg pGL3-wwtr1启动子质粒和1 pg Renilla质粒显微注射到每个单细胞斑马鱼胚胎中。然后我们在14 hpf时收集胚胎并如先前报道的那样进行双荧光素酶报告试验（Yue等人，2018）。

H9c2细胞系（美国ATCC）在含有10%胎牛血清（FBS）（美国Gibco）和1%青霉素/链霉素（Gibco，美国）补充的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Gibco，美国）中进行培养。经过两代培养后，将细胞接种到新的10厘米培养皿中，并使用Lipofectamine 3000（美国Invitrogen）进行pCMV-foxc1a-p2A-eyfp和pGL3-1.2 kb-wwtr1的转染。

染色质免疫沉淀-PCR按照制造商的协议（美国Millipore，Burlington，MA）使用EZ ChIP进行。简而言之，将8毫克pCMV-foxc1a-p2A-eyfp质粒和4毫克pGL3-1.2 kb-wwtr1转染到H9c2细胞中。大约48小时后固定并收集约107个细胞。使用抗FOXC1抗体（ab5079，Abcam，剑桥，英国）作为主要抗体。半定量PCR条件为：95℃ 5分钟，27个循环（95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 5秒），72℃ 3分钟。使用2%琼脂糖凝胶进行电泳以呈现结果。PCR引物见表S1。

将斑马鱼幼鱼在室温下浸入0.04毫克/毫升乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（Sigma）中5分钟，然后使用3%甲基纤维素（Sigma）从侧面观察。测量从心室中心到心脏边缘的距离（a）和从心室中心到心包膜边缘的距离（b）。水肿指数计算为b/a。为了量化缩短分数，我们拍摄了每个108 hpf斑马鱼心脏的10秒电影。使用Adobe Photoshop CS6测量数据（如之前报道的Yue等人，2018年所述）。为了确定心率，每个胚胎均安装在3%甲基纤维素中并计数20秒。然后通过将计数乘以三来计算心率（次/分钟）。

foxc1a^nju80系的构建是根据已报道的方法（Li等人，2015b）进行的。敲入质粒的构建可以简单地描述为：foxc1a上游序列（停码前1646 bp）作为左臂；p2A和增强型黄色荧光报告基因（eyfp）作为插入序列；foxc1a下游序列（停码后698 bp）作为右臂。我们将供体质粒和foxc1a TALEN1 mRNA注射到单细胞斑马鱼胚胎中。饲养至性成熟后，G0代分别与WT斑马鱼交配。发育至10e12 hpf时，从每个G0中筛选出48个F1胚胎进行YFP荧光筛查。YFP+胚胎发育至性成熟后进行尾鳍基因分型。基因分型引物序列见表S1。选择foxc1a编码序列未被破坏且p2A-eyfp正常插入的F1个体饲养为foxc1a^nju80。foxc1a^nju81的构建和筛选策略基本与foxc1a^nju80一致。供体质粒包含同源左臂（1167 bp）、p2A-nkx2.5 CDS（1005 bp）和同源右臂（698 bp）。表S1列出了两对基因分型引物。

将96小时大斑马鱼在4%多聚甲醛中于4℃过夜固定。然后，它们在30%蔗糖中平衡数小时，并使用最佳切削温度化合物（OCT）进行包埋。冰冻切片的厚度为5毫米。按照先前描述的方法进行麦胚凝集素染色（Sarmah等人，2010）。

每个实验独立进行两到三次。使用Adobe Photoshop CS6处理图像数据。所有图像仅调整亮度和对比度。使用GraphPad Prism 7软件（GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）进行统计分析。数据以平均值±标准差（SD）的形式表示，并使用双尾非配对学生t检验进行统计评估。

结果

为了准确追踪Foxc1a的内源性表达，我们在Foxc1a终止密码子上游整合了增强型黄色荧光蛋白（Eyfp），并利用TALEN技术构建了Foxc1a^nju80敲入品系（图S1）。在30个G0个体中，有1个G0亲代产生了YFP阳性F1后代，其比例为约3.3%。荧光表达模式与通过整体原位杂交（WISH）观察到的内源性表达相似（图S2AeS2F）。我们使用两种方法在50hpf观察到心脏中的YFP表达（图S2F和S2G）。我们还通过将Foxc1a^nju80品系与Tg（myl7：nDsRed）品系进行杂交来确认这一结果。我们没有检测到在预定的19ss阶段心脏中胚层（cardiac mesoderm）的Foxc1a表达（图2A）。相反，Foxc1a在26小时胚胎体节期（hpf）开始在心内膜细胞核内表达，并持续表达至63hpf（图2B-2E）。从64hpf至108hpf，Foxc1a主要定位于心室心肌细胞的核内（图2F-2I）。在108hpf胚胎的心脏中观察到的绿色信号是由于BDM处理心脏中积聚的血细胞自发荧光引起的。自64小时胚胎体节期起，心内膜细胞不再表达Foxc1a，这一观察结果部分支持Tg（kdrl：ras-mCherry）;foxc1a^nju80胚胎中的观察结果（图2J和2K）。这些结果表明，Foxc1a作为一种转录因子，可能直接调节心室成熟。

为了进一步阐明foxc1a在心室发育中的分子和细胞效应，我们收集了Tg(cmlc2:eGFP)^m225;foxc1a^nju18胚胎96hpf的心脏，并进行了RNA测序(RNA- seq)分析(图3A)。共鉴定出2761个差异表达基因（log2[FC] > 1.5或< 1.5；FDR < 0.05），其中包括987个上调基因和1774个下调基因。所有差异表达基因均通过Gene Ontology（GO）和KEGG数据库进行映射，以确定其预测功能。GO富集分析表明，涉及细胞间粘附介质活性（GO:0098632）、肌肉调节（GO:0006937）和肌肉结构成分（GO:0008307）的基因在foxc1anju18心脏中发生改变（图3B）。KEGG富集分析显示，差异表达基因在肌小节相关疾病中显著富集，包括扩张型心肌病（DCM）（ko05414）、肥厚型心肌病（HCM）（ko05410）和致心律失常性右心室心肌病（ARVC）（ko05412）（图3C）。Wwtr1是Hippo信号通路的效应因子，据报道可参与心肌的生长和再生。

根据RNA-Seq数据，wwtr1在foxc1a^nju18胚胎心脏中96 hpf时显著下调（log2[FC] = -1.7044；图3D）。此外，qRT-PCR和WISH证实，wwtr1的表达不仅在96 hpf时下调，而且在72 hpf时也下调，这是肌小节发育的重要阶段（图3E）。先前的研究表明，Wwtr1在斑马鱼心室心肌细胞核中定位在30至119 hpf。在肌小节形成阶段，致密层心肌细胞中Wwtr1免疫染色较低，这些心肌细胞有脱离并播种到肌小节的趋势。wwtr1缺失的斑马鱼胚胎表现出肌小节心肌细胞减少和心室结构紊乱，这与我们对foxc1a^nju18胚胎的观察相似。我们还检测到几个Notch信号相关基因减少，包括fezf2（log2[FC] = -2.2326）、epas1b（log2[FC] = -1.8674）、bbs1（log2[FC] = -2.6727）、pkd2（log2[FC] = -1.6133）、nrarpb（log2[FC] = -1.6543）、neurod1（log2[FC] = -1.8836）和mecom（log2[FC] = -1.6927）。qRT-PCR分析表明，wwtr1^-/-突变体中报道的调控机制也可能存在于foxc1a缺陷胚胎中（图3F）。在这些基因中，fezf2、pkd2和neurod1已被报道可促进癌细胞增殖。

为了检验wwtr1是否是斑马鱼胚胎中foxc1a的直接靶点，我们进行了双荧光素酶报告分析。将wwtr1转录起始位点上游1552 bp的序列(-1016 ~ -1007 bp的Foxc1a结合位点)插入到pGL3-Basic质粒中。我们观察到，当foxc1a mRNA表达量过高时，不同长度的wwtr1启动子（1552 bp、935 bp和662 bp）被激活（图4A）。值得注意的是，662 bp启动子的活性明显弱于935 bp启动子。然而，935 bp启动子的活性与1552 bp启动子的活性相似（图4A）。这些结果表明，在935 bp的wwtr1启动子中至少存在两个Foxc1a结合位点。为了进一步确定结合位点，我们通过在H9c2细胞系中过表达pGL3-wwtr1-1189 bp启动子和pCMV-foxc1a-p2A-eyfp质粒，进行了染色质免疫沉淀PCR试验。结果表明，Foxc1a蛋白在P1（约1189 bp至约958 bp）、P2（约828 bp至约636 bp）和P3（约662 bp至约485 bp）片段处显著富集。NC（约181 bp至约1 bp）作为此实验中的阴性对照片段（图4B）。通过生物信息学分析，我们在P1中鉴定出一个典型的结合位点“TGTTTATTT”（图4C）。进一步分析表明，其他两个区域（P2和P3）包含一个富含T的序列（图4C）。为了确认Foxc1a在wwtr1启动子中的结合位点活性，我们使用不同突变的启动子进行了双荧光素酶报告基因试验。结果表明，Foxc1a的转录活性因任何三个结合位点中任何一个的突变而显著降低。这三个结合位点的所有突变完全消除了wwtr1启动子对Foxc1a的响应（图4C）。

为了证实心室心肌细胞中wwtr1减少部分导致的心室发育缺陷，我们将wwtr1 mRNA显微注射到单细胞期Tg(myl7:eGFP)^m225;foxc1a^nju18/+杂交胚胎中，并进行了缩短分数（SF）和水肿指数测定。我们对Tg(myl7:nDsRed);foxc1a^nju18/+杂交胚胎进行了相同的操作并计数了心室细胞的数量。胚胎生长到96小时后，我们测量了心室舒张期和心室收缩期的心室短轴长度并计算了SF。结果表明，foxc1a^nju18胚胎的SF显著降低（P=0.0007），但可以恢复到与WT胚胎相当的水平（P=0.0471）（图4D和4E）。此外，wwtr1 mRNA的过表达部分增加了96小时foxc1a^nju18胚胎中的心室细胞数量（P=0.6099；图4F和4G）。我们观察到，与WT胚胎相比，foxc1a^nju18胚胎在108小时后的水肿指数显著升高（P<0.0001），如之前报道的那样。尽管如此，心包积液表型在wwtr1注射的foxc1a^nju18胚胎中部分降低（P=0.0003；图4H）。最后，小梁结构缺陷也部分得到改善（图4I）。这些结果综合表明，wwtr1是Foxc1a的直接靶标，其过表达可以减轻因Foxc1a缺乏而导致的心室腔发育缺陷。

之前有报道称，nkx2.5的正常功能对斑马鱼二次心脏发育至关重要。尽管我们之前的研究报告了nkx2.5表达水平的早期下降，但在WISH检测中，WT和foxc1a^nju18胚胎在60小时后心脏中仍表达nkx2.5（图S4A）。然而，我们观察到在72和96小时后，使用qRT-PCR和WISH检测到的foxc1a突变体心脏中nkx2.5的表达水平降低（图S4A和S4B）。我们之前已经证实，Foxc1a直接调节nkx2.5的表达并影响心脏祖细胞的分化。为了探索这种调控机制是否也存在于心室成熟晚期，我们以foxc1a^nju80细胞系为参考构建了foxc1a^nju81。nkx2.5的编码序列被整合到foxc1a终止密码子的上游，foxc1a被截短为942bp，导致foxc1a条件性敲除和foxc1a阳性细胞中nkx2.5的敲入（图S3）。剩下的942bp的foxc1a编码序列没有编码功能性蛋白，就像之前描述的foxc1a^nju19突变体一样，也保留了942bp的foxc1a编码序列，表现出与foxc1a^nju18突变体相同的表型。我们通过PCR扩增筛选了40条斑马鱼，鉴定出一对始祖鱼，筛选率为约5%。雌性始祖鱼用于建立foxc1a^nju81品系。

为了验证敲入的存在，我们在6小时胚胎期（hpf）使用nkx2.5探针进行了WISH。在foxc1a^nju81杂交胚胎中，nkx2.5复制了foxc1a的表达模式，这在野生型同窝中无法检测到（图5A）。这与之前关于nkx2.5在10.5 hpf开始表达的报告一致。此外，在72和96 hpf的foxc1a^nju81杂交胚胎中，nkx2.5的表达也被挽救（图5A）。随后，我们进行了形态学和功能分析。在形态学上，Tg(myl7:nDsRed);foxc1a^nju81胚胎中心室心肌细胞的数量可以恢复到与野生型同窝中观察到的数量（P=0.3248；图5B和5C）。108 hpf的foxc1a^nju81胚胎的水肿指数明显低于foxc1a^nju18胚胎（图5D和5E）。96 hpf的foxc1a^nju81胚胎的网状结构也部分得到恢复，尽管一些foxc1a^nju81胚胎显示出两层或三层心肌细胞（图S4CeS4E）。在功能上，96 hpf的foxc1a^nju81胚胎的SF水平恢复到与野生型同窝相当的水平（P=0.1784；图5F和5G）。为了评估功能，我们还评估了108 hpf的foxc1a^nju81胚胎的心率，并确定其与野生型胚胎相比显著降低（P<0.0001；图S4F），而foxc1a^nju18胚胎的心率与野生型胚胎相当。这可能与nkx2.5过表达引起的应激反应有关。综上所述，nkx2.5的条件性敲入能够充分减少foxc1a缺陷胚胎的腔室成熟缺陷。

Foxc1a是斑马鱼叉头（forkhead）转录因子超家族的成员，在斑马鱼早期发育中起着至关重要的作用。Forkhead超家族的直系同源物已被证明在心血管系统发育中起关键作用。在Foxc1/Foxc2双基因敲除小鼠中，流出道、右心室和房室瓣膜均消失。这表明FOXC1影响心内膜和心肌的发育。然而，关于Foxc1如何调节脊椎动物心室发育的机制仍不清楚。在这项工作中，我们揭示了斑马鱼Foxc1a在心室腔成熟中的作用，并确定了两个直接靶基因。然而，其潜在的分子机制仍需进一步深入探索。

转基因是一种强大且广泛使用的技术，用于遗传标记细胞和信号通路。基于Tol2的转位策略对于研究特定基因在体内的功能很有用。然而，这项技术存在两个主要局限性：插入位点未知，并且额外的DNA构建物的整合可能会影响邻近基因的表达。最近，TALEN技术克服了这些不足。它已成功用于构建双链断裂（DSBs），具有高效率，从而允许在斑马鱼中进行同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）介导的敲入。本研究中，我们构建了foxc1anju80品系，使我们能够观察到内源性foxc1a的表达模式（图S1和S2）。在这里，我们证明了Foxc1a在斑马鱼中定位于核内，并表现出时空特异性，其在心室内成熟过程中尤其明显地表达于心肌细胞中（图2）。

Hippo通路对于心肌细胞的增殖和分化至关重要。它有助于维持心脏的正常大小和结构，增强心肌细胞对压力的耐受性，并有助于心肌细胞的存活。在这里，我们报告Foxc1a是一种重要的转录因子，并推测Foxc1a和Hippo通路效应基因wwtr1参与了心室的成熟。然而，通过mRNA注射法评估wwtr1的功能仍存在一些挑战。具体而言，注射的野生型胚胎中只有一小部分表现出心室结构的缺陷，包括小梁形成和心包水肿（图4H和4I）。这可能是由于显微注射引起的细胞毒性所导致的。建立持续的wwtr1过表达可能是一种更好的替代方法。例如，可以构建由myl7驱动的wwtr1编码序列表达的转基因斑马鱼。除了wwtr1之外，我们还观察到erbb4a（log2[FC]= -9.740）在RNA-Seq数据中的下调（图3D）。心肌和心内膜Nrg/Erbb信号之间的相互作用对于诱导小鼠小梁肌肉分化很重要。Erbb2/4的缺乏导致小梁结构减少。Erbb4还被报道为多囊卵巢综合征中wwtr1的上游基因。然而，未来仍需对Erbb4的潜在调控机制进行进一步研究。

Notch信号通路对于哺乳动物胚胎心脏发育也至关重要。在斑马鱼中，Notch被广泛报道可促进心脏再生过程中的心肌细胞增殖。然而，我们没有进一步探讨Foxc1a与Notch信号之间的关系。仍需进行其他研究，例如探索Foxc1a与Notch报告基因的共定位。

最近，功能丧失等位基因的生成已大大促进了基因功能的研究。然而，基因的持续破坏往往伴随着各种副作用，如补偿机制和胚胎致死性。在这里，我们采用了一种创新的TALEN介导的敲入策略，在foxc1a⁺细胞中实现nkx2.5的条件性过表达。该策略利用细胞特异性启动子来控制nkx2.5的时空表达，并证明foxc1aþ细胞在心室内成熟过程中对心肌细胞的增殖有贡献（图5和S3）。另一方面，nkx2.5和nkx2.7的双重敲低导致52 hpf的心房细胞数量增加而心室细胞数量减少，这表明nkx2.5在早期心脏发育中不影响心室增殖。因此，在斑马鱼心脏发育的不同阶段，nkx2.5的作用似乎有所不同。在心脏发育的后期阶段，nkx2.5在心室腔成熟中起着至关重要的作用。然而，nkx2.5的条件性过表达仅具有有限的效果。一些突变体仍表现出严重的心脏水肿，这可以在突变体心脏的代表性图像和水肿指数数据中观察到（图5D和5E）。

最后，在foxc1a⁺细胞中条件性拯救nkx2.5导致在其他组织如视网膜、咽弓和肾脏中nkx2.5过表达。例如，WISH显示，在72 hpf和96 hpf时，nkx2.5在咽弓区域的表达显著下调（图S4A）。然而，在foxc1aþ细胞中条件性过表达nkx2.5后，该区域未观察到nkx2.5表达的恢复，这表明nkx2.5可能不介导foxc1a对咽弓发育的调节。此外，foxc1a基因缺失突变体中的眼缺陷无法像foxc1a^nju81胚胎中那样得到恢复（图5D）。在foxc1a^nju81品系中，我们观察到除血流增加外其他组织畸形变化很小（图5D）。关于Xenopus胚胎的研究表明，Nkx2.5与C/EBPa合作调节髓样细胞分化。这表明nkx2.5也可能在斑马鱼髓样细胞分化中发挥作用。