影响因子：6.6
原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种自身免疫性胆汁淤积性肝病，会逐渐破坏肝内胆管，进而导致纤维化和肝硬化。探索与PBC相关的遗传变异对于理解PBC的发病机制至关重要。本文识别了一个名为balloon dog（blg）的斑马鱼突变体，该突变体具有肝内胆管分支缺陷，表现出几种关键的PBC样病理特征，包括免疫优势抗原PDC-E2的产生、胆管细胞凋亡、免疫细胞浸润、炎症激活和肝纤维化。blg编码的蛋白磷酸酶1调节亚基21（Ppp1r21）在肝脏及其周围组织中富集，并在早期肝内胆管形成阶段发挥重要作用。进一步研究显示，突变体肝组织中PI3K/AKT/mTOR通路过度激活，而使用该通路抑制剂LY294002和雷帕霉素的治疗可以部分恢复肝内胆管分支缺陷并缓解PBC样症状。这些发现揭示了Ppp1r21介导的PI3K/AKT/mTOR通路在PBC病理生理学中的潜在作用。
原发性胆汁性胆管炎（PBC），以前称为原发性胆汁性肝硬化，是一种自身免疫性胆汁淤积性肝病，其特征是高滴度的血清抗线粒体抗体（AMA），以及选择性破坏肝内胆管细胞，最终导致胆管丧失和纤维化。尽管已经广泛报道了遗传易感性和环境因素结合导致的免疫耐受性破坏，但PBC的发病机制仍然未知。熊去氧胆酸（UDCA）是治疗PBC的标准和最初批准的药物，尽管已有其他新药如奥贝胆酸（OCA）和贝扎贝特作为辅助药物上市。然而，大约40%的患者对UDCA的反应仍然不足。鉴于PBC目前的治疗状况，探索与PBC病因学相关的遗传学病因是当务之急。
已经发表了几种PBC的实验小鼠模型，这些模型极大地促进了对病理生理学的研究。最近描述的模型包括自发性模型NOD.c3c4小鼠、dnTGFβRII小鼠、IL-2Rα−/−小鼠、Ae2a,b−/−小鼠，以及诱导模型如2-OA免疫小鼠、NOD.B6小鼠、芳香性诺沃氏菌（N. aromaticivorans）免疫小鼠。尽管这些小鼠模型在模拟人类PBC方面取得了一些成就，但其不理想的统计数据和不便的胚胎操作仍然限制了其在大规模遗传和治疗筛选中的应用。结合多种动物模型是获取PBC病理生理学互补见解的必要手段。
斑马鱼作为一种重要的模型生物，具有丰产的产卵能力、透明的体内胚胎可视化以及遗传和化学操作的便捷性。迄今为止，斑马鱼已被广泛用于研究病理过程、识别新的治疗靶点和测试候选化合物。在本文中，我们报告了一种ENU突变体，其发展出胆管异常，同时伴有线粒体丙酮酸脱氢酶复合物E2（PDC-E2）成分的高滴度表达、胆管细胞凋亡、免疫细胞浸润、炎症激活以及肝区域纤维化。这些表型大体上与人类PBC的病理特征类似。在这种突变体中，我们发现PI3K/AKT/mTOR通路的抑制剂可以恢复胆管异常的表型并缓解类似PBC的症状，揭示了该信号通路与PBC样疾病的潜在联系。
材料与方法
如先前所述（Solnica-Krezel等，1994年；Yang等，2021年），使用ENU（Sigma，美国）进行诱变。成年雄性Tg(tp1:Tomato)鱼每周用3.5 mM ENU处理一小时，持续六周。ENU停药两周后，雄性斑马鱼与野生型雌鱼交配以产生F1家系。F1代杂合blg品系与多态性SJD品系进行杂交以获得F2代，然后筛选F2代杂合子进行自交以产生后代作为作图群体。胆管异常的表型是初始选择标准，而胆道相关功能障碍是后续检测的一部分。染色体定位是通过使用标准的SSLP标记来实现的。对于精细作图，在关键间隔内用SSLP标记测试了287个突变体胚胎（图2A）。z-marker的引物序列可在http://www.zfin.org/上找到。使用QIAGEN（瑞士）的RNAeasy试剂盒按照制造商的说明从斑马鱼整个胚胎中分离出总RNA。cDNA的合成使用Invitrogen（瑞士）SuperScript III逆转录酶试剂盒按照说明书中的说明进行。PCR产物克隆到pCRII-TOPO载体（Clonetech）中。
将5天龄胚胎在4%多聚甲醛中于4℃固定一晚，用PBS洗涤3次，每次20分钟，然后用60%异丙醇洗涤3次，每次20分钟。在含有60%异丙醇的ORO工作溶液中孵育1小时，在28℃下避光，然后用H2O洗涤两次，每次20分钟。使用SteREO Discovery V20显微镜（Carl ZEISS，德国）进行图像捕获。
按照先前描述的方法（Carten等，2011），使用0.5 mM BODIPY FL C5（Life Technologies，Grand Island，NY）进行4小时的BODIPY FL C5检测。BODIPY FL C5检测的图像是通过共焦显微镜获得的。用BODIPY FL C5处理过的幼鱼需短暂洗涤3次，然后置于1%低熔点琼脂糖中用于共焦成像。
CRISPR/Cas9系统的操作如先前所述（Chen等，2021）。将Cas9 mRNA（300 pg）和ppp1r21 gRNA（50 pg）共注射到单细胞期胚胎中后，用一对基因特异性引物扩增基因组区域以验证gRNA靶位点；PCR引物如下：F：GACACATCCTGACCAGCTCC，R：GCTTGAGCGTGTCAATGGTCTC。验证后的胚胎被养至成鱼（F0）。筛选F0鱼以确定其后代在ppp1r21基因中是否存在插入/缺失突变。对于CRISPR胚胎的基因分型，用先前引物扩增基因组DNA。扩增的DNA片段经高分辨率凝胶电泳和测序后进行检测。
全胚胎原位杂交（WISH）如先前所述（Liu等，2016；Thisse和Thisse，2014）。幼鱼用4%多聚甲醛（PFA）在PBS中于4℃固定一晚。WISH使用dlat、tnfa、il1b、nfkbiab、tgfb1a、cyp7a1、fgf15和abcd11b反义探针进行。荧光原位杂交（FISH）和FISH与抗体染色的结合如先前所述（He等，2014；Yang等，2021），使用dlat探针。用地高辛或荧光素标记的反义探针以及抗地高辛-POD（1:1000，Roche）、抗荧光素-POD（1:1000，Roche）、抗GFP（1:1000，Abcam）抗体、酪酰胺信号放大和荧光检测系统（TSA，PerkinElmer）。全胚胎抗体染色使用6G5（1:500，#73823，Abcam）、抗p-AKT（1:250，#9271S，Cell Signaling）、抗pRS6（S240/244）（1:1000，#2215，Cell Signaling Technology）、抗gH2AX（1:500，#127342，GeneTex）、抗DsRed（1:1000，#101526，Santa Cruz）、抗GFP（1:1000，#ab6658，Abcam）、抗PDC-E2（1:50，#166899，Santa Cruz）和抗Collagen 1a（1:250，#23730，Abcam）。核用DNA荧光染料DAPI（Sigma）染色。本研究所用的次级抗体包括驴抗山羊IgG Alexa Fluor 488偶联物（1:1000，Invitrogen）、驴抗山羊IgG Alexa Fluor 633偶联物（1:1000，Invitrogen）、驴抗小鼠IgG Alexa Fluor 568偶联物（1:1000，Invitrogen）、驴抗小鼠IgG Alexa Fluor 647偶联物（1:1000，Invitrogen）和驴抗兔IgG Alexa Fluor 488偶联物（1:1000，Invitrogen）。
将总蛋白收集在50 mL RIPA裂解缓冲液中。如之前所述的Western blot（Hnasko和Hnasko，2015；He等人，2019），PVDF膜用甲醇活化1分钟，并在制备堆栈之前用转移缓冲液冲洗。膜转移在30 V下进行50分钟。在室温下阻断膜1小时，然后与一抗在4℃下孵育一夜，与二抗在室温下孵育1小时。用TBST洗涤膜3次，并获取化学发光图像。所涉及的抗体如下：抗PDC-E2（1:200，#166899，Santa Cruz）、抗α-微管蛋白（1:2000，Santa Cruz）、抗小鼠HRP（1:2000，Abcam）和抗兔HRP（1:2000，Abcam）。TUNEL试验根据原位杂交过程对胚胎进行固定和复水。去除皮肤后，用PBT中溶解的10 mg/mL蛋白酶K消化胚胎18分钟，用醋酸和酒精的1:2溶液在-20℃下处理1小时，然后用4% PFA在室温下重新固定20分钟。按照制造商的说明使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）进行凋亡检测。
为了分析肝脏组织学，5天大的胚胎在4℃下用4% PFA固定一整夜，然后逐渐在乙醇中脱水，用二甲苯清除并最终嵌入石蜡中。肝组织切片（7μm）按照制造商的说明用HE染色，或用Sirius红染色溶液在室温下染色1小时。
Tg(hsp70l:ppp1r21-HA-P2A-DsRed)转基因胚胎在指定阶段于38.5℃下进行热休克处理40分钟，然后在分析时间点之前在28.5℃下孵育。幼鱼分别用0.2% DMSO中的10 mM雷帕霉素（Selleck）或8 mM LY294002（Selleck）处理，并每天更新一次。以含0.2% DMSO的蛋水作为对照。
blg纯合子可存活至15天，而杂合子则发育成成年鱼。为了进行特定杂交，使用了超过8对鱼。在blg杂合子亲本之间的杂交中，每个处理组中用于分析的胚胎或幼鱼数量超过45个。blg突变体的遗传比率符合孟德尔遗传，基因型分析在纯合子和杂合子分析中先于表型分析进行。所有比较处理样本的实验均采用随机分配的同批胚胎进行，无需研究者盲法。所有数据均以平均值±平均标准误差（SEM）的形式提供。所有数据均采用双尾学生t检验进行统计分析。所有分析均使用GraphPad Prism 9.0软件（GraphPad，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行。P值小于0.05被认为具有统计学意义。3D重建和树突平均直径彩色图通过Imaris 9.1.2软件的表面模块和丝状模块进行处理。
本研究生成或分析的所有数据均可在文章和补充材料中找到。本研究中生成的斑马鱼品系和质粒均可使用。
结果
为了识别调节胆管发育和功能的因素，我们在Tg(tp1)cq109 转基因背景下进行了斑马鱼N-乙基-N-硝基脲（ENU）正向遗传筛选，其中胆管上皮细胞（BECs）被Notch响应元件Tp1驱动的Tomato标记。一个名为balloon dog（blgcq148）的隐性突变体被识别出来，表现出肝内胆管的异常形态。与5天孵化后的野生型幼鱼相比，blg 突变体的异常胆管呈现肥胖和组织不良的状态，失去了分支形态发生（图1A和1B）。时间进程分析显示，这些肝内胆管树的分支缺陷在3天孵化后就已出现（图S1A和S1B）。在明场显微镜下，5天孵化后的blg突变体在肝区表现为深色病变，可能是由于胆管分支缺陷引起的肝胆功能障碍（图1C）。此外，我们进行了油红O（ORO）染色和荧光BODIPY FL C5分析，以检测blg突变体中的脂质代谢和胆汁传导功能，发现突变体幼鱼中明显的肝脂质沉积、胆汁流动受损和胆囊萎缩（图1D和1E）。另外，涉及胆汁酸代谢的基因cyp7a1、fgf15和abcd11b的表达在blg突变体中显著下调（图S1C）。这些结果表明，blg胆管的分支缺陷可能导致胆管系统的功能崩溃。blg突变体能够存活到15天，但在13天孵化后死亡率达到高峰（图1F），这可能是由于肝胆功能衰竭，导致幼鱼在卵黄耗尽和开始外源性进食阶段无法正常吸收和代谢食物。这些数据表明，blg突变体中的突变基因编码调节胆管发育和功能的关键因子。
图1 blg突变表现为肝内胆管异常
图2 blg表型是由ppp1r21基因突变引起的
图S2 ppp1r21CRISPR突变体表型可复制blg突变体的异常胆管
为了确定Ppp1r21在胆管形成过程中的功能时间窗，我们使用了热休克诱导的Tg(hsp70l)cq150 系列在不同阶段过表达Ppp1r21（图S3A和S3B）。结果显示，blg突变体的胆管分支缺陷可以通过在14、36、48和60 hpf时进行热休克恢复，所有显示在6 dpf时的正常胆管分支（图S3C）。但在72 hpf时进行热休克，超过一半的blg突变体仍然表现出缺陷的胆管，表明Ppp1r21在72 hpf之前的功能对于正常胆管形成至关重要 。由于在14 hpf时热休克的高效率，我们选择在这个阶段在blg突变体中过表达Ppp1r21以检测胆管的功能。数据显示，胆管的平均直径（图2F和S3D）、通过ORO染色指示的脂质代谢（图S3E）和通过BODIPY FL C5检测的胆汁传导功能（图S3F）在热休克诱导条件下都恢复到一定程度。这些结果表明Ppp1r21对于斑马鱼胆管的形成和功能至关重要。
图S3 热休克诱导Ppp1r21过表达可挽救blg突变体胆管形态和功能缺陷
作为蛋白磷酸酶1（PP1）的一个调节亚基，Ppp1r21在内涵体分选过程和内涵体成熟途径中发挥作用。编码这种蛋白的ppp1r21是一个广泛表达的基因（UEG），主要在斑马鱼胚胎发育的24 hpf和5 dpf检测到富集在头部区域（图S3G）。有趣的是，ppp1r21在50 hpf时出现在肝脏及其周围组织，ppp1r21突变导致3 dpf时肝内胆管分支缺陷（图S1A和S1B）。从50 hpf到72 hpf（3 dpf）的时间窗恰好是肝内胆管形成的早期阶段。这些结果表明Ppp1r21可能参与建立早期肝内胆管网络。
Biallelic 失活型变体 ppp1r21 引起内质体调节紊乱。内质体是胆汁管生成所必需的，内质体转运的失败会导致肝内胆管缺陷。此外，内质体还参与了人类树突状细胞对 PDC-E2 自身抗原抗体复合物的加工和呈递。AMA 针对 PDC-E2 并作为原发性胆汁性肝硬化（PBC）的典型生物标志物，约 90% 的患者中存在 AMA。因此，我们推测 blg/ppp1r21 肝内胆管异常可能与人类 PBC 有关。通过检测编码免疫显性自身抗原 PDC-E2 的 dlat 的转录水平，我们发现 dlat 在 blg 突变体的肝区表达显著上调（图 S4A），并与肝内胆管细胞重叠（图 S4C）。Western blotting 和免疫荧光染色显示 PDC-E2 蛋白在 blg 整个胚胎中呈现较高滴度（图 S4B），与 5 dpf 时肝脏其他细胞类型相比，blg 胆管细胞中 PDC-E2 的表达有特异性上调（图 3A）。这些结果表明在 blg 突变体的胆管细胞中检测到高水平的 PDC-E2。
在PBC患者中，另一个典型的组织学特征是肝内小、中胆管进行性破坏，这引发了BECs非内源性凋亡。据报道，PBC中的这种凋亡是由TUNEL和gH2AX信号检测引起的DNA损伤诱导的细胞死亡。在blg突变幼鱼中，我们通过TUNEL染色在胆管细胞中发现了明显的凋亡信号（图S4D和S4E）。blg胆总管细胞的DNA损伤也通过gH2AX免疫荧光检测到（图3B和S4E）。这些数据表明，肝内胆管异常伴随着blg突变体中胆总管细胞的凋亡。
PBC是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫介导的胆汁损伤，其重要的病理特征是免疫细胞浸润于肝组织中。PBC中的自身免疫包括T细胞介导的适应性免疫和以巨噬细胞和中性粒细胞为主的固有免疫。斑马鱼的适应性免疫系统在受精后4-6周才成熟，因此我们利用Tg(coronin1a:DsRed)cq28转基因系标记巨噬细胞和中性粒细胞，以检测blg突变体肝区是否发生免疫细胞浸润。表型分析显示，coronin1a阳性细胞分布在blg胆管上皮细胞附近（图3C），随着发育进展，blg肝区逐渐增多（图3D），在Tg(lyz:DsRed2)nz50和Tg(mpeg1:EGFP)gl22背景下也得到了验证（图S5A和S5B）。这些数据表明，blg突变体的肝脏和胆管持续被免疫细胞浸润。
为了研究blg/ppp1r21突变引起的胆道病变是否会引发炎症反应，我们通过全胚胎整体原位杂交（WISH）检测了il1b、tnfa、nfkbiab和tgfb1a的转录水平。结果表明，与野生型相比，blg突变体在5天龄时的肝脏区域中这些与炎症相关的因子的表达显著升高（图3E）。此外，基于Collagen1a免疫荧光染色，观察到blg肝内胆管周围有活跃且密集的胶原沉积（图3F）。苏木精-伊红（HE）染色和Sirius红染色显示blg突变体的肝脏中存在一定程度的纤维化（图S5C）。这些数据表明，blg突变体的胆道缺陷会引发炎症激活和肝组织纤维化。
在斑马鱼中，肝原基中的肝细胞分化发生在24小时后和50小时后之间。随后肝细胞增殖加速，肝部开始生长。在此过程中，随着肝脏的发育，肝内胆管逐渐形成，直到在5天龄时胆管网络完成建立并开始胆汁排泄功能。我们的数据显示，blg/pp1r21突变体在3天龄时就已经出现肝内胆管分支缺陷（图S1A和S1B），而与野生型相比，在3天龄时功能肝细胞标记物gc和bhmt的表达没有差异，但在4天龄时下调，在5天龄时更为显著（图S6A）。这些结果表明，blg突变体中的肝内胆管异常是初始缺陷，并最终导致肝功能障碍。此外，时间过程分析显示，blg/ppp1r21突变体的PDC-E2产生和胆道细胞凋亡发生在4天龄（图S6B和S6C）。这些可检测到的症状晚于胆管异常表型的出现，表明ppp1r21突变引起的胆道发育缺陷是导致类似PBC的胆管病变的关键原因。
此外，我们用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂处理blg突变体，以检验胆管异常的病理表型是否可以恢复。LY294002和雷帕霉素分别作为PI3K和mTOR的抑制剂，它们共同调节PI3K/AKT/mTOR通路。由于p-RS6信号在4 dpf时出现升高（图S7B），因此我们选择在一天前用LY294002和雷帕霉素处理ppp1r21突变体。这些抑制剂在3dpf处理48 h后(图4A)， blg胆管的分支结构变得与野生型胆管相似(图4B和图4C)， AMA靶点PDC-E2的表达下降到接近野生型/DMSO组的对照水平(图4D)。这些结果表明，抑制PI3K/AKT/mTOR通路可以挽救blg的肝内胆管分支缺陷并缓解PBC样胆管病变。由于ppp1r21突变也可能导致肝内PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活，我们用LY294002和雷帕霉素处理blg/ppp1r21突变幼鱼，发现功能性肝细胞标记物gc和bhmt的表达部分得到恢复（图S7C）。这些结果表明，抑制PI3K/AKT/mTOR通路有助于缓解PBC样胆管病变和并发肝功能衰竭，这表明Ppp1r21功能障碍引起的PI3K/AKT/mTOR通路过度激活可能参与了PBC的发病机制。
本研究通过ENU筛选鉴定出一种斑马鱼突变体blg，该突变体表现出与人类原发性胆汁性肝硬化相似的几个关键病理特征。这些特征包括肝内胆管异常、免疫显性自身抗原PDC-E2的产生、胆道细胞凋亡、免疫细胞浸润、炎症激活和肝纤维化。人类和斑马鱼的胆管系统结构不同，blg突变体可能不能完全反映人类原发性胆汁性肝硬化的进展，但仍有助于原发性胆汁性肝硬化的研究。斑马鱼在5dpf时，其肝胆系统已完全具备功能，这有助于可视化及针对肝胆研究的胚胎操作。PBC小鼠模型主要通过组织学分析显示共同胆管（CBD）增厚和扭曲扩张。在blg突变体中，我们可以在体内实时观察肝内胆管的病理过程，这是其他模型动物所不能比拟的。PBC的病因尚不清楚，其发病机制以免疫介导的胆道损伤为特征。遗传变异和基因多态性会增加PBC的易感性，并与发病机制密切相关。利用斑马鱼突变体揭示PBC中更多的遗传关联对于研究PBC的病因具有重要意义。
在建立肝内胆管树时，基底外侧膜面向血窦，一个或多个顶端结构与相邻的肝细胞共同参与形成胆小管。其中，内体循环系统是顶端胆管表面结构发育过程中的重要事件。在斑马鱼中，胆小管的形成始于36-60 hpf，导管网络的形成始于约70 hpf。我们的数据显示，Ppp1r21在50 hpf时在肝脏及其周围组织中富集（图S3G），并在72 hpf之前促进肝内胆管形成（图S3C）。鉴于Ppp1r21在内体系统中的作用以及Ppp1r21功能障碍引起的肝内胆管异常（图1A、1B、S1A、S1B），我们推测Ppp1r21是建立和功能驱动肝内胆管树过程中的关键因素。
一些研究表明，在原发性胆汁性胆管炎（PBC）患者中，免疫显性自身抗原PDC-E2在胆小管细胞质中过度表达，特别是在BECs（胆道上皮细胞）的顶端侧。产生PDC-E2的胆管细胞随后在PBC患者中启动由巨噬细胞、BEC细胞和抗线粒体抗体（AMA）组成的独特三联体，导致炎症细胞因子爆发和随后的纤维化病变。PBC的这些进行性病理变化与我们的blg/ppp1r21突变的一系列表型非常相似（图3、S4、S5）。据报道，内体在PDC-E2自身抗原抗体复合物的加工和呈递中是必不可少的。我们推测，由ppp1r21突变引起的内体失调可能导致肝内胆管暴露免疫显性自身抗原PDC-E2，从而触发类似PBC的症状。然而，Ppp1r21导致类似PBC症状的详细机制仍需进一步研究。
除了T细胞介导的适应性免疫外，固有免疫也可驱动PBC小鼠模型的启动并加重小鼠自身免疫性胆管炎和纤维化。我们的数据显示，巨噬细胞和嗜中性粒细胞在3天鱼龄后持续浸润blg突变体的肝脏和胆管（图3C和3D），这表明这两种固有免疫细胞可能是调节自身免疫性胆管炎的重要成分。由于blg突变体的寿命较短（图1F），因此难以研究PBC成年人的适应性免疫介导的胆汁损伤或与PBC相关的性别差异。因此，为成年斑马鱼建立Ppp1r21突变的可诱导模型有助于PBC的组织病理学研究。
在人类患者中，Ppp1r21的截短变异体与大脑异常、肌肉无力、肌张力低下、发育迟缓等有关。本研究表明，Ppp1r21对肝内胆管的形成和功能具有调节作用，Ppp1r21功能障碍会引发类似PBC的症状，这补充了之前未知的可能是由ppp1r21突变引起的症状。在blg/ppp1r21斑马鱼突变体中，可在肝内胆管及其周围肝组织中检测到PI3K/AKT/mTOR途径的过度激活（图S7A和S7B）。迄今为止，尚未直接证明Ppp1r21的功能作用与任何细胞信号传导途径有关。由于Ppp1r21含有蛋白磷酸酶对接基序，我们推测它可能直接与PP1结合，通过使AKT失活来抑制AKT信号传导，或者其功能可能与蛋白磷酸酶调节家族的其他成员相似，如Ppp1r7和Phlpp1，通过使AKT去磷酸化来抑制PI3K/AKT/mTOR信号传导途径。此外，用LY294002和雷帕霉素处理可以挽救肝内胆管分支缺陷，并缓解类似PBC的胆管病变及伴随的肝功能不全（图4Be4D、S7C）。一方面，我们的数据表明PI3K/AKT/mTOR途径可能是PBC的潜在治疗靶点；另一方面，Ppp1r21在PI3K/AKT/mTOR途径中的潜在作用为未来揭示PBC的发病机制提供了新的线索。
