Chestnut Studying
摘要
Deficiency of the epigenome modulator histone deacetylase 3 (HDAC3) in brown adipose tissue (BAT) impairs the ability of mice to survive in near-freezing temperatures. Here, we report that short-term exposure to mild cold temperature (STEMCT: 15°C for 24 h) averted lethal hypothermia of mice lacking HDAC3 in BAT (HDAC3 BAT KO) exposed to 4°C. STEMCT restored the induction of the thermogenic coactivator PGC-1α along with UCP1 at 22°C, which is greatly impaired in HDAC3-deficient BAT, and deletion of either UCP1 or PGC-1α prevented the protective effect of STEMCT. Remarkably, this protection lasted for up to 7 days. Transcriptional activator C/EBPβ was induced by short-term cold exposure in mouse and human BAT and, uniquely, remained high for 7 days following STEMCT. Adeno-associated virus-mediated knockdown of BAT C/EBPβ in HDAC3 BAT KO mice erased the persistent memory of STEMCT, revealing the existence of a C/EBPβ-dependent and HDAC3-independent cold-adaptive epigenomic memory.
棕色脂肪组织(BAT)中表观基因组调节因子组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)的缺乏会削弱小鼠在接近冰点温度下的存活能力。在此,我们报告了短期暴露于轻度寒冷温度(STEMCT:15°C,持续24小时)可避免BAT中缺乏HDAC3的小鼠(HDAC3 BAT KO)在4°C下出现致命的低温。在22°C时,STEMCT恢复了生热协同因子PGC-1α和UCP1的诱导,而HDAC3缺陷的BAT中PGC-1α和UCP1的诱导能力严重受损,UCP1或PGC-1α的缺失会阻止STEMCT的保护作用。值得注意的是,这种保护作用可持续长达7天。转录激活因子C/EBPβ在小鼠和人类BAT中通过短期低温暴露诱导,并且在STEMCT后7天内保持高水平。在HDAC3 BAT KO小鼠中,通过腺相关病毒介导的BAT C/EBPβ敲除消除了STEMCT的持久记忆,揭示了存在一种C/EBPβ依赖且HDAC3无关的冷适应表观遗传记忆。
实验结果1
STEMCT通过促进适应性生热来克服HDAC3的缺失
如前所述,在无冷应激的情况下,将小鼠置于热中性(TN,30°C)环境中7天,在BAT中几乎检测不到UCP1 mRNA和蛋白的表达(Ucp1-cre/Hdac3flox/flox)。HDAC3 BAT KO小鼠(以下简称HDAC3 BKO)的BAT中脂质堆积增加。HDAC3 BKO小鼠还表现出严重的耐寒性,在4°C的急性寒冷暴露中,小鼠在不到4小时内体温严重过低,无一存活。UCP1 KO小鼠的体温过低可通过在数天内逐步降低环境温度,并利用Ucp1独立途径来缓解,因此作者测试了逐步暴露于轻度低温是否可通过UCP1依赖性和/或非依赖性产热来缓解HDAC3 BKO小鼠的耐寒性。
首先将小鼠置于室温(22°C)下,然后将其转移到15°C下24小时(称为STEMCT),然后立即将其暴露在4°C下(图1A)。与在TN饲养的小鼠类似,HDAC3 BKO小鼠从22°C直接移至4°C后,3小时内核心体温急剧下降(图1B),大多数小鼠在4°C下6小时内死亡,而对照组小鼠全部存活(图1C)。所有暴露于干细胞移植术的HDAC3 BKO小鼠均存活,并在24小时内维持了核心体温,与对照组小鼠相似(图1D)。组织学分析显示,HDAC3 BKO小鼠在22°C时具有正常的棕色脂肪库,但脂滴略大,而在干细胞移植术后,HDAC3 BKO小鼠的BAT脂滴大小略有减小(图1E)。
与HDAC3 BKO小鼠从22°C直接进入4°C时严重的不耐寒形成强烈对比的是,所有在4°C挑战之前接受过STEMCT的HDAC3 BKO小鼠都能维持核心体温,并成功经受住了4°C挑战(图1F和1G)。需要注意的是,虽然米色脂肪在适应性生热中发挥作用,但HDAC3 BKO小鼠腹股沟白色脂肪(iWAT)中的HDAC3蛋白在22°C和15 °C，STEMCT对iWAT形态和UCP1表达的影响很小,表明STEMCT不足以诱导iWAT的变白。
接下来,作者考虑了STEMCT对耐寒性的有益影响是否能够超越将环境温度从15°C直接降低到4°C。为了验证这一点,HDAC3 BKO小鼠和对照组同窝小鼠均暴露于STEMCT,然后在4°C的急性挑战前返回到之前的22°C环境条件中1天(图1A)。值得注意的是,HDAC3 BKO小鼠在暴露于STEMCT后耐寒性得到改善,即使在22°C下放置1天后,这种耐寒性仍得以维持,无论是在核心体温(图1H)还是存活率(图1I)方面。重要的是,在STEMCT后,雌性HDAC3 BKO小鼠以及通过将Adipoq-cre小鼠与HDAC3 floxed小鼠杂交产生的泛脂肪基因KO模型均观察到了耐寒性的这种获得性改善。这些数据共同表明,STEMCT能够有效促进与HDAC3无关的产热,且不受性别和BAT KO遗传模型的影响。
实验结果2
STEMCT可恢复HDAC3 BKO小鼠BAT中Ucp1和OXPHOS相关基因表达的缺失
为了深入了解HDAC3 BKO小鼠对耐寒性表型的强效恢复的分子机制,作者对在22°C下饲养的对照组和HDAC3 BKO小鼠的BAT进行了RNA测序(RNA-seq),并在干细胞移植后恢复1天。差异表达基因(DEG)的鉴定表明,在22°C下,对照组和HDAC3 BKO小鼠之间存在显著差异(图2A)。干细胞移植后恢复1天后,差异表达基因的数量减少(图2A)。与HDAC3在BAT中的协同激活功能一致,22°C下饲养的HDAC3 BKO小鼠的BAT中出现了许多下调的mRNA转录本,包括预期的Ucp1几乎不存在(图2B,左)。令人惊讶的是,在干细胞移植后,HDAC3 BKO小鼠的BAT中Ucp1的表达被诱导并恢复到与对照组同辈小鼠相似的表达水平(图2B,右侧)。事实上,在干细胞移植后,HDAC3 BKO小鼠的BAT中Ucp1 mRNA(图2C)和UCP1蛋白表达(图2D)均被诱导。
通过无偏倚的层次基因聚类分析对RNA-seq数据进行进一步分析,发现两个不同的基因簇,由大量基因组成,这些基因在BAT HDAC3 BKO小鼠中表现出与Ucp1相似的表达模式(在22°C时受抑制;在STEMCT后的恢复期恢复表达),而在对照小鼠中,在STEMCT后诱导或保持不变。基因本体分析显示,参与线粒体结构和功能的基因(包括电子传递和脂肪酸氧化)富集。对HDAC3 BKO小鼠BAT中与氧化磷酸化相关的基因进行生物信息学分析,发现22°C时基因表达显著下调,而干细胞移植后转录恢复迅速且持续时间长。
实验结果3
STEMCT后HDAC3独立的热生成依赖于UCP1
STEMCT诱导Ucp1和OXPHOS相关基因的表达,并恢复了HDAC3 BKO小鼠对寒冷的耐受性。为了研究STEMCT触发的寒冷适应机制对UCP1的依赖性,作者在C57BL/6小鼠的基因组上构建了Adipoq-cre HDAC3/UCP1双基因敲除(dKO)小鼠。值得注意的是,作者尝试过但未能成功培育出Ucp1-cre HDAC3/UCP1 dKO小鼠。因此,作者在STEMCT后1天恢复期对Adipoq-cre HDAC3/UCP1 dKO小鼠进行了耐寒性测试(CTT)。Adipoq-cre HDAC3 KO小鼠和对照小鼠在急性寒冷刺激下存活,并维持了核心体温(图2E和2F)。值得注意的是,尽管HDAC3/UCP1 dKO和UCP1 KO小鼠都经历了干细胞移植,但Ucp1基因缺陷的小鼠体温过低(图2E和2F),这表明UCP1 KO小鼠短暂暴露于轻度寒冷不足以诱导生理功能上独立的UCP1 生热途径,这与利用长时间、渐进式适应严寒的其他适应模式所诱导的途径不同。因此,STEMCT提供的保护可能通过未被发现的分子途径发挥作用,这些途径以HDAC3独立的方式重新激活UCP1的表达。
实验结果4
STEMCT通过ERRα富集增加eRNA转录本
为了了解HDAC3 BKO小鼠在干细胞移植后表型恢复的潜在原因,作者进行了全基因组运行测序(GRO-seq),以评估全基因组新生RNA转录。对非编码增强子RNA(eRNA)转录的生物信息学分析显示,有7856个差异eRNA的倍数变化大于2,其中3963个在HDAC3 BKO或对照同卵孪生动物中在STEMCT后上调(图3A中的红色框)。对上调的增强子RNA进行从头和已知主题分析,揭示了ERR结合的最强富集主题(图3B),ERR在生热中发挥关键作用,在29°C的环境温度下,HDAC3在BAT中调节Ucp1时,非典型地与ERR共同激活。
对BAT中的ERRα进行染色质免疫共沉淀(ChIP-seq)后,在STEMCT后,对照组和HDAC3 KO小鼠中ERRα结合的增强子上的转录活性均增加(图3C)。重要的是,ERRα与HDAC3在Ucp1增强子中共同定位(图3D)。ERRα结合的Ucp1位点增强子在22°C下HDAC3 KO小鼠BAT中的eRNA转录水平低于对照组,而在STEMCT后,这些增强子中的eRNA表达水平升高(图3D),表明STEMCT恢复了这些位点的增强子活性。在22°C下,BAT HDAC3 BKO中ERRα mRNA水平略有下降,在STEMCT后,两种基因型之间表现出类似的诱导表达,但两种基因型和温度下的核ERRα蛋白水平相当。Ucp1增强子中ERRα的ChIP-qPCR结果显示,在22°C时,对照组和HDAC3 BKO小鼠的BAT中ERRα的富集程度相同,在STEMCT后富集程度略有增加(图3E)。
为了研究干细胞移植是否改变了ERRα增强子全基因组染色质结构,作者对干细胞移植后恢复1天的HDAC3 BKO小鼠和对照组小鼠的BAT进行了转座酶可及染色质高通量测序(ATAC-seq)。在ERRα结合增强子位点,ATAC-seq峰的出现表明,与22°C相比,STEMCT后对照组和HDAC3 BKO小鼠的染色质可及性增加(图3F)。这些结果表明,STEMCT可增加ERRα结合位点的增强子活性,从而控制Ucp1的表达。
实验结果5
STEMCT以HDAC3独立的方式诱导PGC-1α的表达
核受体共激活因子PGC-1α(Ppargc1a,也称为Pgc-1α)的功能是ERRα最大转录活性的必要条件, 其功能可通过赖氨酸乙酰化抑制,并可通过HDAC3介导的去乙酰化激活。利用基于句子的文本挖掘(TRRUST)揭示的转录调控关系进行的富集分析显示,预测BAT中由STEMCT诱导的许多基因受PGC-1α调控(图4A)。事实上,对暴露于寒冷环境的小鼠的PGC-1α BAT cistromes的分析表明,从头ERR主题在PGC-1α ChIP-seq结合位点高度富集(图4B),并且大多数PGC-1α峰值与ERRα峰值重叠(图4C),包括与ERRα共同占据Ucp1增强子(图4D)。
在HDAC3 BKO小鼠的BAT中,PGc-1α基因位点的新生转录被下调,但通过STEMCT恢复到接近对照水平(图4E)。事实上,HDAC3 BKO小鼠BAT中PGc-1α的mRNA水平低于对照小鼠,而STEMCT在对照和HDAC3 BKO小鼠中均诱导了表达(图4F)。在STEMCT后,对照组和BAT组HDAC3 BKO小鼠的PGC-1α蛋白水平也升高。有趣的是,PGC-1α的诱导发生在外部温度为15°C或更低时,这与哺乳动物认为的寒冷温度相对应。一项较短时间的研究表明,仅暴露于15°C 2小时即可强烈诱导PGC-1α。这些数据表明,通过低温诱导PGC-1α的表达,STEMCT绕过了HDAC3共激活因子功能所需的遗传要求,从而实现了基础产热基因的表达。
实验结果6
干细胞移植后,HDAC3独立的热生成依赖于PGC-1α
接下来,作者通过产生BAT特异性HDAC3和PGC-1α基因敲除(HDAC3/PGC-1α dKO)小鼠,评估了PGC-1α是否是STEMCT对适应性生热和急性寒冷反应产生有益作用所必需的。不出所料,在22°C下饲养的HDAC3/PGC-1α dKO小鼠在暴露于4°C时无法耐受寒冷,并出现体温过低(图4G)。值得注意的是,尽管通过干细胞移植技术(STEMCT)进行了寒冷适应,但仍有约50%的HDAC3/PGC-1α dKO小鼠在4°C时严重体温过低,无法抵御寒冷(图4H)。因此,作者得出结论,在干细胞移植技术(STEMCT)之后,BAT中的PGC-1α对于HDAC3 BKO小鼠的耐寒性表型恢复是必不可少的。
实验结果7
STEMCT后的低温环境记忆持续7天
考虑到STEMCT对BAT产热的有益影响(在22°C下恢复24小时后仍能维持),作者接下来通过遵循相同的STEMCT模式,将22°C下的恢复期延长至7天、14天或30天,来探索STEMCT的影响能持续多久(图5A)。令人惊讶的是,在STEMCT后长达7天的时间里,急性寒冷刺激期间对低温的防护效果完全得以维持(图5B和5C)。在恢复14天后,一些HDAC3 BKO小鼠在急性寒冷刺激期间死于低温,但存活率与对照组没有显著差异(p < 0.25)(图5D和5E)。然而,在STEMCT恢复30天后,HDAC3 BKO小鼠不再免受低温和低温应激致死的影响(图5F和5G),表明STEMCT无法挽救表型。
RNA-seq数据的主成分分析显示,与22°C的其他实验组相比,22°C的HDAC3 BKO小鼠表现出独特的转录组,包括STEMCT后的HDAC3 BKO小鼠和22°C和STEMCT的对照同窝小鼠(图5H)。值得注意的是,在PC1轴上,STEMCT后的HDAC3 BKO小鼠与对照同窝小鼠的转录更加相似。在恢复1天和7天后,对照组和HDAC3 BKO小鼠聚集在一起,表明干细胞移植诱导的转录组变化至少持续7天,与观察到的表型一致。
在1天或7天恢复期,STEMCT诱导的HDAC3 BKO中UCP1蛋白水平的诱导与对照组小鼠保持在同一水平,并且高于在22°C下饲养的非STEMCT暴露的HDAC3 BKO小鼠(图5I)。此外,在STEMCT后第1天观察到的持续Ucp1基因表达和ERRα占位增强子处的染色质开放性(图5J)在第7天时点得以维持。然而,在STEMCT恢复30天后,HDAC3 BKO小鼠体内的UCP1蛋白和mRNA水平恢复到与22°C饲养的HDAC3 BKO小鼠体内的水平相似(图5I和5K)。因此,STEMCT能够有效保护HDAC3 BKO小鼠免受7天严寒侵袭,这与ERRα结合位点增强子/开放染色质可及性以及UCP1表达增加有关。
实验结果8
轻度寒冷暴露可诱导小鼠和人类BAT中的C/EBPβ
接下来,作者试图阐明STEMCT七天记忆的分子基础。虽然STEMCT诱导HDAC3 BKO小鼠BAT中PGC-1α和ERRα的表达,但在22°C下,这种表达效应在一天内迅速逆转,这表明尽管PGC-1α是STEMCT发挥功效的必要条件,但PGC-1α和ERRα都不是STEMCT后7天UCP1持续升高的原因。由于PGC-1β和ERRβ/ERRγ分别与PGC-1α和ERRα的功能重叠,作者进一步探讨了STEMCT对这些基因的表达是否具有持久的影响。然而,在22°C下,BAT HDAC3 BKO中PGC-1β和ERRβ的mRNA水平以及ERRγ的蛋白表达水平均下降,而STEMCT对PGC-1β、ERRβ和ERRγ的mRNA和/或蛋白水平没有影响。
由于ERRα和PGC-1α也被证明可以调节BAT中UCP1非依赖性肌酸循环基因的表达,作者研究了STEMCT诱导UCP1非依赖性产热的可能性。事实上,STEMCT增加了对照组和HDAC3 BKO小鼠BAT中Ckb和Alpl mRNA的水平。令人惊讶的是,与对照组相比,HDAC3 BKO小鼠BAT中STEMCT诱导的mRNA水平更高。然而,在干细胞移植治疗后7天,HDAC3 BKO小鼠BAT中这些mRNA的表达恢复到基础水平,这表明持续表达UCP1和HDAC3 BKO小鼠的表型恢复需要额外因素。这些结果表明,UCP1的持续表达和HDAC3 BKO小鼠的表型恢复都需要额外因素。
C/EBP共识结合位点是通过对15°C下激活的增强子进行GRO-seq分析所确定的第二大富集主题(图3B),也是由STEMCT诱导并在恢复1天或7天后仍存在的ATAC-seq峰中的第一大主题。与此一致的是,C/EBP是生热和脂肪生成的重要转录调控因子。对Cebp同源物的基因表达分析表明,Cebpb(而非Cebpa)在 降低环境温度(从30°C降至22°C,从22°C降至STEMCT)(图6A)或暴露于4°C的低温下2小时。有趣的是,在超重或肥胖女性上锁骨区BAT样本中,CEBPB的表达与UCP1一样,在轻度寒冷暴露(约20°C)约6小时后,与暴露于TN(约28°C)约6小时后相比,也出现了寒冷诱导(图6B和6C)。此外,CEBPB mRNA在锁骨上BAT原代脂肪细胞中受去甲肾上腺素诱导。
在小鼠BAT中,ChIP-seq分析显示C/EBPβ在Ucp1转录起始位点上游2、5、6、12和13kb的增强子区域富集(图6D),以及Pgc-1α、Esrra和Cebpb基因座富集。在HDAC3 BKO BAT中,STEMCT诱导了C/EBPβ结合的增强子上的eRNA转录(图6E),包括Ucp1和Pgc-1α位点上的已鉴定增强子,通过ChIP-qPCR证实了C/EBPβ占位率的增加(图6F)。在功能上,C/EBPβ以剂量依赖的方式增加了C/EBPβ结合的主要Ucp1增强子的转录活性。这些结果表明,C/EBPβ是小鼠和人类BAT中生热基因的冷诱导调节因子。
实验结果9
干细胞移植后,C/EBPβ的表达和功能持续增强
鉴于作者的 ATAC-seq 数据中持续存在 C/EBPβ 主题富集,作者推测 C/EBPβ 的诱导和增强子结合的增加可以解释 STEMCT 的持久和长期效应。事实上,STEMCT增加了C/EBPβ(LAP,肝脏富集激活蛋白)的活性形式,但并未增加C/EBPβ(LIP,肝脏富集抑制蛋白)的显性负形式,在对照组和HDAC3 BKO小鼠的BAT中,这种活性一直持续到22°C恢复的第7天(图6G、6H)。STEMCT后,核C/EBPβ持续增加7天。与HDAC3 BKO小鼠BAT中Ucp1的表达模式一致,C/EBPβ-LAP蛋白在30天恢复后恢复到基础水平(图6G、6H)。在冷诱导的C/EBPβ结合位点(包括Ucp1增强子)的ATAC-seq谱图显示,在STEMCT后,染色质可及性增加,并持续7天(图6I)。这些数据共同表明,C/EBPβ是棕色脂肪生热基因的冷诱导转录调节因子,其核表达和基因组功能持续存在,其时间进程与STEMCT的分子记忆相一致。
作者进一步研究了C/EBPβ和ERRα对HDAC3 BKO小鼠BAT中STEMCT后7天仍保持表达的基因的相对贡献。RNA-seq分析显示,在1天和7天的恢复条件下,对照组小鼠中有319个基因上调,HDAC3 BKO小鼠中有1461个基因上调,其中超过50%的基因在对照组小鼠中上调,在HDAC3 BKO小鼠中同样上调。ChIP-seq显示C/EBPβ峰比ERRα峰多得多,重叠部分约占40%。值得注意的是,在对照组和HDAC3 BKO小鼠中,C/EBPβ的占位率均高于ERRα,这表明C/EBPβ可能比ERRα更强烈地参与了干细胞移植后基因的持续上调。
实验结果10
C/EBPβ对于STEMCT的持久记忆是必不可少的
接下来,作者通过在BAT中注射AAV-shCebpb,测试HDAC3 BKO和对照小鼠的C/EBPβ功能缺失,来研究C/EBPβ是否是STEMCT对适应性生热记忆所必需的。AAV-shCebpb在BAT中实现了对照组和HDAC3 BKO小鼠C/EBPβ表达的特异性敲除(图7A和7B)。HDAC3 BKO小鼠在C/EBPβ敲除后,在22°C的环境中表现出耐寒性,而对照组小鼠在C/EBPβ敲除后则表现出耐寒性,在暴露于4°C的环境中会体温过低(图7C-7E)。值得注意的是,在干细胞移植后恢复7天后,接受shControl处理的HDAC3 BKO小鼠在4°C的急性寒冷刺激下存活,而C/EBPβ敲除的HDAC3 BKO小鼠尽管通过干细胞移植适应了寒冷环境,但仍体温过低而死亡(图7C-7E)。因此,作者得出结论,在STEMCT后,HDAC3 BKO小鼠的适应性生热反应的寒冷记忆需要BAT中的C/EBPβ。
