（二、2）蜕膜化评分可识别反复妊娠丢失和不明原因不孕女性样本中的子宫内膜功能失调

蜕膜化评分可识别反复妊娠丢失和不明原因不孕子宫内膜样本中的功能因子失调Decidualization score identifies an endometrial dysregulation in samples from women with recurrent pregnancy losses and unexplained infertility

目的：研究蜕膜化相关的子宫内膜因素。

设计：回顾性队列研究，比较经历生殖失败（reproductive failure）[包括复发性流产（recurrent pregnancy loss，RPL）或不明原因不孕（unexplained infertility，UI））]的女性与生育控制组（versus fertile controls）的子宫内膜基因表达模式。

地点：大学生殖医学中心。

患者：患有反复不孕（recurrent reproductive failure）的女性，包括复发性流产或不明原因不孕（n=42）和生育控制（n=18）。

干预措施：通过NGS靶向RNA-seq（targeted ribonucleic acid sequencing）对子宫内膜活检样本进行分析。

主要结果指标：主要终点指标是蜕膜化过程中对子宫内膜转化重要的基因的表达，单独测量和联合/累积评分方法测量。次要终点测量是受试者ROC曲线分析和特定生物标志物之间的比较。

结果：比较揭示了与蜕膜化、组织稳态和免疫调节相关的因子的差异表达：FOXO1、GZMB、IL15、SCNN1A、SGK1和SLC2A1。这6个特征因素的综合评估被指定为蜕膜化评分指标，其中最高评分为“6”，最低评分为“0”。在对照组中，89%的样本的得分为≥5，11%的样本得分为“4”。患者组中共有76%的样本得分为≤4，19%的样本得分最低为“0”。蜕膜化评分<4提供了蜕膜化过程异常的证据，敏感性为76%（95%CI 61%-88%），特异性为89%（95%CI 65%-99%）。

关键词：子宫内膜、基因表达、复发性流产、不孕、蜕膜化

Key Words: Endometrium, gene expression, recurrent pregnancy loss, infertility, decidualization

胚胎着床之后是胎盘形成的关键时期，这是成功怀孕的主要限制因素。尽管进行了广泛的研究，但健康女性在整倍体胚胎移植后反复植入失败的病因仍不清楚。胚胎植入本身质量正常也不能保证妊娠成功，因为在所有临床确认的妊娠中，约有15%会导致流产。当妊娠20周前连续两次流产时，它被定义为一种疾病，即复发性妊娠丢失(RPL)。当排除可能的病因因素，如排卵功能障碍、卵巢储备功能减退、子宫内膜异位症、解剖因素、抗磷脂综合征和血栓症时，还有原因仍然未知。很明显，子宫内膜状况是一个关键因素，新兴的研究显示，生殖失败女性的子宫内膜中有各种新的病理因素与功能失调。

子宫内膜以周期性的方式经历有序化的增殖（extensive proliferation）、分泌（secretion）和萎缩消退（regression），在每个周期的黄体中期出现2-4天的容受性高峰。这种准备过程称为蜕膜化，包括人子宫内膜间质细胞分化为蜕膜细胞，形成适合植入的容受组织（receptive tissue）。这一过程主要取决于孕酮对子宫内膜基质细胞上雌二醇致敏（estradiol-primed）的孕酮受体的影响。在重要的孕酮信号因子中，FOXO1已知在诱导蜕膜化基质细胞亚群衰老中起核心作用，这一过程对于胚胎着床准备中的组织重塑（tissue remodeling）至关重要。与蜕膜化相关的变化还包括组织和细胞内稳态因子的表达增加。因此，钠稳态的一个关键调节因子，血清和糖皮质激素诱导的激酶1 (SGK1)，被证明可以被孕酮水平的升高迅速诱导，并被环腺苷单磷酸激活。葡萄糖转运分子(Glut)在人子宫内膜中表达，Glut1和Glut3，已知在黄体中期子宫内膜达到峰值，以确保胚胎着床和生长的营养和接受介质。

在代谢增加的同时，黄体中期子宫内膜的特点是子宫自然杀伤细胞(uNK)数量急剧增加。由于uNK细胞分泌促生长因子、促血管生成因子、趋化因子和免疫调节因子，在调节血管生成、胎盘生长和控制滋养细胞侵袭方面发挥着重要作用(围着床期免疫抑制，可能影响uNK细胞募集和增加，可能影响植入成功，因此应慎重无指征免疫用药而不是基于降低NK细胞或所谓NK细胞攻击胚胎的错误论调，过度免疫抑制用药）。对NK细胞增殖和存活至关重要的白细胞介素(IL) 15的子宫内膜水平在一个周期内也会发生变化。它们在月经期和增殖期较低，但黄体子宫内膜的特征是表达增加。

显然，子宫内膜蜕膜化建立在所有细胞参与者之间的复杂串扰（crosstalk）之上，以产生一个有利于植入的环境。在这项研究中，我们使用NGS 对未知病因的生殖失败女性的子宫内膜活检样本进行了靶向RNA-seq测序分析，并将结果与健康生育对照组进行了比较。研究发现，参与孕酮信号、组织稳态和uNK细胞增殖调节的因子表达存在显著差异。我们使用了一种综合评估方法来制定蜕膜化评分，该评分在选择蜕膜化过程中出现异常的样本方面具有潜在的优势。进一步的研究对于验证该评分的有效性和利用率非常重要。在这里，我们讨论其在标准不孕症评估中的潜在实施用途及其用于确定可能的治疗策略。

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结果

子宫内膜活检样本的靶向RNA-seq分析Targeted RNAseq Analysis of Endometrial Biopsy Samples

对42例患者及18例对照组的内膜组织样本进行了靶向RNA-seq分析。该策略（panel）旨在涵盖参与蜕膜化过程中组织重塑的多种标记物，包括与蜕膜化相关的蛋白质编码基因，以及与炎症、血管生成、代谢和自然杀伤细胞（NK细胞）相关的标记物。分析结果揭示了患者与对照组之间某些基因表达的显著差异（图1）。IL15、GZMB、FOXO1、SGK1和SCNN1A等基因在样本间表现出明显异质性，并且在这些基因表达水平相似的样本中观察到了聚类现象（图1A）。FOXO1与SGK1、SCNN1A、SLC2A1、GZMB及IL15之间存在强相关性。进一步比较患者与对照组的mRNA表达数据，确认了FOXO1、SGK1、SCNN1A、SLC2A1及GZMB水平存在显著差异（图１B，见补充表4）。然而，在将RPL和UI两组患者进行比较时，并未发现显著差异。通过比较低FOXO1水平患者特征与正常FOXO1水平患者特征之间的差异，得出了以下结论：无论是所有患者群体、RPL患者群体，还是UI患者群体，均未观察到年龄、生育次数、自发流产次数方面存在显著差别。

Analysis of targeted RNA sequencing data revealed differentially expressed genes in the endometrium from women with reproductive failures compared with those of healthy fertile controls. (A) Representative three-dimensional plot demonstrating patients’ samples clustering in the analysis of genes that expressed differently between patients and controls. (B) Comparison of endometrial gene expression for selected markers between women with reproductive failures (Patients, n ¼ 42) and healthy controls (Controls, n ¼ 18). Panels show relative mRNA expression levels. Based on the outcome of Levene's test for equality of variances, the Kruskal-Wallis test was used for statistical analysis of FOXO1, SGK1, SCNN1A, GZMB, IL15, and PTGS2, and the ANOVA test was used for the analysis of SLC2A1 and HEY1. *P<.05, **P<.01.ANOVA = analysis of variance; mRNA = messenger ribonucleic acid; RNA= ribonucleic acid.对靶向RNA-seq数据的分析揭示，与生育能力正常的对照组相比，患有生殖障碍的女性子宫内膜中存在表达差异的基因。（A）展示了患者样本在患者与对照组之间表达不同基因分析中的三维图示。（B）比较了选择标记物在患有反复不孕的女性（患者，n=42）和健康对照（对照，n=18）的子宫内膜中的表达情况。面板显示相对mRNA表达水平。根据Levene检验方差齐性假设结果，对FOXO1、SGK1、SCNN1A、GZMB、IL15和PTGS2进行了Kruskal-Wallis检验，而SLC2A1和HEY1则采用ANOVA检验进行分析。*P<.05，**P<.01。ANOVA代表方差分析；mRNA指信使RNA；RNA为核糖核酸。

子宫内膜中NK细胞相关标志物的表达Expression of NK Cell-Associated Markers in the Endometrium

CD56阳性NK细胞在黄体中期的子宫内膜中十分常见。RNA测序分析确实揭示了研究样本中NCAM1转录本（即CD56的mRNA）的显著表达水平。此外，NCAM1水平与其他NK细胞相关标志物高度相关，例如编码浆细胞素B的GZMB和穿孔素PRF1（补充图2A）。IL15及其受体IL15RA在NK细胞增殖、分化和生存中的重要性也反映在其转录水平与NK细胞标志物之间的高度相关性上（补充图2B）。与对照组相比，患者组中GZMB和IL15的表达范围显著更广泛。对照组呈现典型正态分布，而患者样本则显示出双峰分布特征（图2A）。

为了明确高水平与低水平IL-15样本之间的差异，我们依据IL-15转录本的表达水平将所有样本划分为两组，并对其他标记的表达情况进行了比较。结果显示，无论是低水平还是高水平的异常IL-15均展现出独特的分子表型（如图2B-E所示），这一发现与前述相关性数据相一致。与IL15水平低的样本相比，IL15水平高的样本中GZMB和IL15RA的表达显著降低，而在这些高IL15水平样本中，这些基因的表达则显著升高（图2B）。此外，与正常或高IL15水平样本相比，低IL15水平样本中的FOXO1和SLC2A1表达也显著降低（图2C）。值得注意的是，无论是低还是高IL15水平的样本，SGK1和SCNN1A的表达均显著下降（图2D）。最后，如图2E所示，高IL15水平样本中PTGS2（编码COX2）及HEY1（Notch信号通路介质）的表达最低。

然而，在不同IL15水平特征下，包括年龄、孕次、分娩次数及自发性流产次数等患者特征并未显示出显著差异。

Expression of IL15 and GZMB in the endometrium. (A) Histograms showing the distribution of the endometrial biopsy samples based on IL15 and GZMB gene expression levels. The distribution of the healthy controls is shown in blue and that of the samples from the patient group in red. A normal bell-shaped distribution is characteristic of the healthy control group (– – –), in contrast to the double-peaked contour that emerged when the patients’ samples were analyzed (——). The X-axis shows relative mRNA expression levels (IL15 or GZMB). The Y-axis shows the percent of samples with specified levels of IL15 or GZMB. (B-E) Endometrial biopsy samples with abnormal levels of IL15 (either low or high) were characterized by distinct molecular profiles. All samples were grouped into IL15 low, IL15 normal, and IL15 high samples according to the levels of IL15 transcripts in the sample. Filled triangles represent samples from the women with reproductive failures, open circles represent samples from the healthy controls. (B) The IL15 low samples revealed the lowest levels of GZMB and IL15RA. The IL15 high samples had the highest levels of GZMB and IL15RA. (C) The IL15 low samples had significantly lower levels of expression of FOXO1 and SLC2A1 in comparison with those of the IL15 normal and high samples. (D) Both the low and the high IL15 samples revealed decreased expression of SGK1 and SCNN1A. (E) The samples with high IL15 were marked with the lowest levels of PTGS2 and HEY1. ANOVA or Kruskal-Wallis test was used for statistical analysis between the IL15 low, normal, and high groups. *P<.05, **P<.01, ***P<.001.子宫内膜中IL-15和GZMB的表达情况。(A) 基于IL-15和GZMB基因表达水平，展示了对子宫内膜活检样本分布的直方图。蓝色代表健康对照组的分布，而红色则表示患者组样本的分布。健康对照组呈现典型正态钟形分布（---），而患者组样本则显示出双峰轮廓（--）。X轴表示相对mRNA表达水平（IL-15或GZMB），Y轴表示具有特定IL-15或GZMB水平的样本百分比。(B-E) 当子宫内膜活检样本中的IL-15水平异常（无论是低还是高）时，会展现出独特的分子特征。所有样本根据其IL-15转录物水平被划分为三组：IL-15低、正常及高表达组。实心三角形代表不孕女性的样本，空心圆则代表健康对照组的样本。(B) IL-15低表达组显示最低的GZMB和IL-15RA水平，而高表达组则表现出最高的这两者水平。(C) 与正常及高表达群体相比，低表达群体在FOXO1和SLC2A1上的表达到显著降低。(D) 低与高IL-15表达群体均显示SGK1和SCNN1A水平均有所下降。(E) 高IL-15表达群体表现出PTGS2和HEY1最低的表达。在统计分析中采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验，对不同表达人群进行比较；*P<.05, **P<.01, ***P<.001。

Supplemental Figure 1 The data obtained using the targeted RNAseq method was validated with quantitative reverse transcriptase–polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Representative plots demonstrating rank correlation analysis with Spearman's rho rank correlation coefficient and P value are shown. Quantitative RT-PCR method: cDNA synthesis was performed using SuperScript II First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Quantitative RT-PCR assays were performed using TaqMan gene expression assay (Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific) using the StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific). Specific gene CT values were normalized to internal B2M controls and then quantified for relative gene expression utilizing the 2ˆ−ΔCT method. Following pre-validated TaqMan gene expression assays were used: NCAM1 (Hs00941833_m1), PRF1 (xxx), GZMB (xxx), IL15 (Hs01003715_m1), IL15RA (xxx), SCNN1A (Hs00168906_m1), FOXO1 (Hs00231106_m1), SGK1 (Hs00985033_g1), SLC2A1 (Hs00892681_m1) and endogenous control B2M (all from Applied Biosystems, Foster City, CA).补充图1 使用靶向RNAseq方法获得的数据通过定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行了验证。展示了Spearman秩相关分析的代表性图表，包括Spearman秩相关系数和P值。定量RT-PCR方法：使用SuperScript II First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific, Inc.）进行cDNA合成。使用Applied Biosystems（Thermo Fisher Scientific）的StepOnePlus实时PCR系统进行定量RT-PCR分析。使用2^−ΔCT方法将特定基因的CT值标准化为内部B2M控制，然后利用该方法对相对基因表达进行量化。使用了经过预验证的TaqMan基因表达试剂盒：NCAM1 (Hs00941833_m1), PRF1 (xxx), GZMB (xxx), IL15 (Hs01003715_m1), IL15RA (xxx), SCNN1A (Hs00168906_m1), FOXO1 (Hs00231106_m1), SGK1 (Hs00985033_g1), SLC2A1 (Hs00892681_m1) 以及内源性控制剂B2M（Applied Biosystems, Foster City, CA）。

Supplemental Figure 2 NK cell’s specific gene expression in the endometrium. A. The endometrial expression of NCAM1 (encodes CD56) strongly correlates with other NK cell specific markers: PRF1 (perforin) and GZMB (granzyme B). B. The expression of NK cell specific GZMB in the endometrium strongly correlates with the expression of IL15 and IL15RA.补充图2：子宫内膜NK细胞特异性基因表达。A. 子宫内膜NCAM1（编码CD56）的表达与其他NK细胞特异性标志物（PRF1和GZMB）高度相关。B. 子宫内膜NK细胞特异性GZMB的表达与IL15和IL15RA的表达高度相关。

Supplemental Figure 3 Comparison of decidualization scores between RPL (A) and UI (B). Diagrams demonstrate proportion of each score for each patient population.补充图3 比较RPL（A）和UI（B）的蜕膜化评分。图表显示了每个患者群体中每种评分的比例。

蜕膜化评分的ROC曲线分析及标准Receiver Operating Characteristic Analysis and Criterions for a Decidualization Score

ROC分析用于评估RNAseq基因面板在识别与生殖失败显著相关的子宫样本方面的鉴别能力。因此，选择AUC值显著大于0.5的标记物。这些标记物包括六个关键基因——FOXO1、SGK1、SCNN1A、SLC2A1、GZMB和IL15（见图3A）。有关这六个标记物的AUC值、95%置信区间、显著性水平P值及Youden's指数等相关标准详见表1。每个标准均代表了AUC曲线上能够最佳区分两组的一个特定点，并用于为每个标记确定阈值。为了评估所选标记的综合效应，进行了累积ROC分析。将高于阈值的标记视为正常，并赋予其1分；而低于阈值的标记则被视为异常，给予0分。此外，由于IL15和GZMB在患者样本中呈现双峰分布，因此引入了这两个标记的上层阈值。在对照组中，上层阈值采用平均值±2SD进行设定。对于GZMB和IL15，其数值高于上层阈值时，被视作超出范围并赋予0分。称之为蜕膜化评分的累积得分模型反映了测试样本中6个基因表达处于正常水平的数量。对该累积得分模型进行ROC分析显示显著提高的AUC值（AUC=0.892，P<.001，见图3B）。蜕膜化评分中的4%对应一个最佳标准，实现患者与对照组之间最优区隔。与此标准相关联的ROC曲线坐标如下：敏感性76.2%（95%置信区间：60.5-87.9），特异性88.9%（95%置信区间：65.3-98.6），阳性似然比6.86（95%置信区间：1.8-25.6），阳性预测值94.1%（95%置信区间：80.0-99.3），阴性预测值61.5%（95%置信区间：40.6-79.8）。

Receiver operating characteristic curve analysis. (A) Comparison of ROC curves for FOXO1, GZMB, IL15, SCNN1A, SGK1, and SLC2A1. The corresponding AUC values of the ROC curves are shown for each gene. (B) ROC curve analysis for the cumulative score model (decidualization score) determined a cutoff criterion to identify compromised samples. The AUC, its P value (the probability that the AUC is different from the null hypothesis: AUC ¼ 0.5), the cutoff point with the best separation between the 2 groups (the criterion), and the associated sensitivity and specificity values are presented on the graph. Kruskal-Wallis test. *** P<.001 for RPL or UI versus Control; ns ¼ nonsignificant difference. (C)Comparison of decidualization scores between women with RPL, UI, and healthy controls. The RPL group included cases of primary and secondary infertility. Statistical analysis was performed with Welch’s adjusted t-test and the Kruskal-Wallis test. *** P<.001 for RPL versus Control, and UI versus Control; ns ¼ nonsignificant difference. (D, E). Proportion of decidualization scores in the healthy control group (D) and in the patient group (E).子宫内膜IL-15和GZMB的表达情况。(A) 基于IL-15和GZMB基因表达水平对子宫内膜活检样本分布的直方图。蓝色代表健康对照组的分布，红色代表患者组样本的分布。健康对照组的分布呈典型的正态钟形分布（---），而患者组样本的分布则呈现出双峰轮廓（--）。X轴表示相对mRNA表达水平（IL-15或GZMB），Y轴表示具有特定IL-15或GZMB水平的样本百分比。(B-E) 子宫内膜活检样本的IL-15水平异常（低或高）时，会表现出独特的分子特征。所有样本根据样本中IL-15转录物的水平被分为IL-15低、IL-15正常和IL-15高三组。实心三角形代表不孕女性的样本，空心圆代表健康对照组的样本。(B) IL-15低的样本显示出最低的GZMB和IL-15RA水平。IL-15高的样本显示出最高的GZMB和IL-15RA水平。(C) 与IL15正常组和高表达组相比，IL15低表达组FOXO1和SLC2A1的表达水平显著降低。(D) 低IL15表达组和高IL15表达组均显示出SGK1和SCNN1A表达降低。(E) 高IL15表达组表现出最低的PTGS2和HEY1表达水平。采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验对IL15低表达组、正常表达组和高表达组进行统计分析。*P<.05， **P<.01， ***P<.001.

The AUC,95% CI, the significance level P, Youden’s index, and the associated criterion for these 6 markers are presented in Table 1. Each criterion indicates a point in the AUC curve with the best separation between the groups and was used to establish a cutoff value for each marker. To determine a combined effect of the selected markers, a cumulative ROC analysis was performed. The markers with values that were greater than or equal to the cutoff point were considered normal and received a score of 1. The markers with values that were below the cutoff point received a score of 0. Additionally,IL15 and GZMB upper-level cutoff points were introduced because of their bimodal distribution in the patient samples. A mean þ2SD value in the control group was used as the upper cutoff point. The GZMB and IL15 values that were greater than the upper cutoff were considered out of range and received a score of 0. The cumulative score model,which was called the decidualization score, reflected how many markers out of 6 signature genes were expressed at normal levels in a tested sample.表1列出了六个标志物的曲线下面积（AUC）、95%置信区间、P值、尤登指数及其对应标准。每一标准均代表AUC曲线上组间分离效果最佳的一个点，并用于确定各标志物的截断值。为评估所选标志物的综合效应，进行了累积ROC分析。将高于截断点的数值视为正常并赋予1分，而低于截断点的数值则视为异常并赋予0分。此外，由于患者样本呈双峰分布，引入了IL15和GZMB的上层截断点，该上层截断点设定为控制组平均值加2倍标准差。对于超出该上层截断点的GZMB和IL15数值，将其视作异常并给予0分。本研究提出了一种称为蜕膜化评分的累积评分模型，以反映测试样本中表达正常水平之六个标志基因数量。

讨论

子宫内膜靶向RNA-seq分析揭示了一组标记物，这些标记物在生殖失败的女性和健康的生育控制者之间存在差异表达。它们包括参与孕酮信号传导和蜕膜化（FOXO1）、组织和细胞稳态（SGK1、SCNN1A、SLC2A1）以及免疫调节和组织重塑因子（IL15、GZMB）的分子。这些标志物在不孕不育中的调节作用或它们在子宫内膜和妊娠中的重要性已有报道。然而，我们发现，对这些基因的联合评估对于识别与异常子宫内膜状况相关的生殖失败是有价值和重要的。

FOXO1基因编码一种转录因子，该转录因子参与孕酮受体与其基因组靶标的结合，被认为是植入窗口的标志物。我们的分析显示，患者中FOXO1的表达明显低于对照组。有趣的是，已知FOXO1的活性受SGK1的调节，这是我们发现的另一个标志物，在患者和对照组之间存在差异表达。SGK1的表达可以在体外由血清和糖皮质激素触发，在体内由各种刺激物触发，包括生长因子和细胞因子（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β、IL-6）。之前有报道称，患有生殖系统疾病的女性子宫内膜SGK1表达失调。SGK1的mRNA和蛋白质的半衰期都很短，分别为20分钟和60分钟。似乎黄体中期子宫内膜中存在多种刺激，因为我们的RNAseq检测显示，与其他分析物相比，SGK1的水平相对较高。其在患者中的表达差异显著，约33%的患者SGK1水平低于生育对照组的范围。SGK1与其直接靶点上皮钠通道（ENaC）之间的强相关性进一步证实了专利组中SGK1表达失调的发现。之前有报道称，在体外受精（IVF）治疗前获得的子宫内膜样本中，SCNN1a和SCNN1b（ENaC复合物的2个亚基）的蛋白质水平在随后IVF失败的女性中显著降低。同样，我们的分析显示，患者的SCNN1A水平明显低于健康生育对照组。

下面这个是王若光教授多次讲课引用图片，雌激素和孕酮影响子宫内膜容受性相关上皮和间质细胞的信号通路。即孕激素抵抗、蜕膜化缺陷的内膜效应。孕激素抵抗调控间质细胞PAEP，FOXO1，TOB1 水平致蜕膜化缺陷机制。

当没有其他选择时，皮质类固醇治疗通常被考虑用于治疗病因不明的复发性不孕生殖失败病例。然而，有报道称使用皮质类固醇的结果不一致（34）。在我们发现的生殖障碍女性和健康对照组中差异表达的标志物中，SGK1是众所周知的糖皮质激素靶点。将这些信息应用于子宫内膜中泼尼松龙反应基因的表达，可能有助于选择受益于皮质类固醇的患者，并避免FOXO1、SGK1和SCNN1A水平正常的患者面临不必要的风险。

子宫内膜蜕膜化的一个重要组成部分是葡萄糖转运分子（Glut），它为胚胎植入和生长提供了营养和接受介质。之前有报道称，特发性不孕患者中Glut1受到抑制。在这里，我们发现患者的Glut1水平明显低于健康对照组。子宫内膜葡萄糖转运蛋白表达减少与多囊卵巢综合征和肥胖有关。有趣的是，生活方式干预导致体重减轻和月经功能改善的女性在mRNA和蛋白质水平上显著上调了子宫内膜中的Glut1。

在该的研究中，作者发现患者组的IL15表达范围比对照组大得多。IL15水平也与NK细胞标志物的表达密切相关，即与编码颗粒酶B的GZMB密切相关NK细胞颗粒中发现的丝氨酸蛋白酶。粒酶B在进入囊胚的组织重塑过程中衰老蜕膜细胞清除过程中至关重要。uNK细胞的脱颗粒需要很好地平衡，因为过多的活性可能会导致流产，而活性不足可能会导致植入失败。对IL15水平低或高的样本进行了进一步比较。SGK1和SCNN1A表达降低是所有IL15异常（低或高）样本的共同特征。然而，作者组仅在IL15水平较高的样本中观察到PTGS2（前列腺素G/H合酶2，编码COX2）和HEY1（Hes相关家族BHLH转录因子）的转录水平较低。在高IL15患者中服用非甾体抗炎药可能会导致COX2的额外抑制，这可能会影响前列腺素合成并影响植入。HEY1被称为雄激素受体（AR）的阻遏物；它阻断AR依赖性靶基因的转录。已知AR在子宫内膜中表达。在子宫内膜HEY1表达低和雄激素水平升高的女性中，AR的信号传导可能会中断子宫内膜中基于雌激素和孕酮的调节。以这些病例为重点的进一步研究可能会为RPL和不孕的病因提供新的线索。

该研究有几个局限性，包括样本量小和患者群体的异质性。比较RPL和UI之间的靶向RNA测序数据；然而，没有观察到显著差异。最近有报道称，未确诊的子宫内膜异位症在这两个人群中都是常见的发现，并且与子宫内膜中BCL6蛋白检测的增加有关。然而，我们的数据无法在RNA水平上证实这一点。我们研究的另一个局限性是它的横断面性质，因为它仅基于观察到的结果。需要进一步研究体外细胞培养模型或动物模型，以确认蜕膜化评分因素的组合与生殖失败有关。

IL15低、高和正常样本中孕酮信号（FOXO1）和组织稳态分子（SGK1、SCNN1A、SLC2A1）表达模式的差异表明，免疫因素是参与子宫内膜蜕膜化的关键因素之一。所有IL15异常的样本均显示其他蜕膜化评分因子以及与前列腺素合成（PTGS2）和雄激素信号传导（HEY1）相关的因子的表达存在一定缺陷。使用蜕膜化评分算法将有助于识别子宫内膜失调患者的子集。进一步的研究对于验证我们的初步发现并确定该算法是否可以指导治疗选择非常重要。例如，如果考虑泼尼松龙治疗，应考虑皮质类固醇靶点（FOXO1、SGK1和SCNN1A）的表达水平。或者在IL-15异常高的患者中使用非甾体抗炎药，这与极低的COX2水平和潜在的前列腺素合成减少有关。

在患有复发性生殖失败的女性群体中，可以采集子宫内膜活检样本进行评估，某些测试，包括子宫内膜容受性阵列、子宫内膜免疫谱和子宫内膜功能测试，可以纳入不孕不育的检查中。我们实施了一种联合6基因签名方法来评估子宫内膜。子宫内膜组织的分子检测提供了与蜕膜化、组织稳态和免疫调节相关的基因表达的重要信息。蜕膜化评分反映了这些因素是否在正常范围内表达，并有助于确定子宫内膜中的分子特征是否适合植入。这些数据可用于选择需要治疗措施以改善IVF/胚胎移植程序前子宫内膜状况的患者。需要进一步的研究来证实这一发现。

总之，蜕膜化评分方法提供了对子宫内膜免疫调节因子（如IL15和GZMB）以及与孕酮信号传导和组织稳态直接相关的因子（FOXO1、SCL2A1、SGK1、SCNN1A）表达的联合评估。这项初步研究的结果表明，生殖功能障碍患者经常出现蜕膜化评分低的情况。有必要进一步验证这种测试方法，以确定这种测试方法对哪些特定患者群体最有益，以及它在治疗应用中的用途。

未完待续。

下篇：3、子宫内膜容受性的免疫决定因素：生物学视角【生殖免疫的核心：子宫内膜异位症和腺肌症的免疫炎症、生殖破坏、妊娠失败等相关病理生理（2、3）】

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若光医学

医学博士，生物学博士后，教授，博士生导师。主要从事：中西医结合妇科与生殖内分泌，不孕不育诊疗，出生缺陷产前诊断，中药药理学及新药研发。熟悉：药理学，病理生理学，分子生物学，生理学，妇产病理，超声诊断，中药药理与毒理学，药用植物与中药化学。