生殖免疫的核心：子宫内膜异位症和腺肌症的免疫炎症、生殖破坏、妊娠失败等相关病理生理（本长文共分三大部分）。此篇为（二、11），即第二部分第11篇。

目录（已发文章链接）

第一部分：一、低生育力（不孕，RIF反复种植失败，RPL反复流产等，妊娠失败与妊娠病理）的生殖免疫学相关评估（第一部分10篇已发出，链接如下）：

摘要Abstract

在这里，我们的目标是使用我们最近建立的体外蜕膜化模型，研究多种 EDCs 对人子宫内膜细胞蜕膜化的影响。该模型基于来自子宫切除术（或子宫内膜活检）的原代子宫内膜基质细胞，这些细胞被模拟为与含有孕酮和雌二醇的混合物蜕膜化；使用一组激酶监测该过程，这些激酶反映胞内信号转导的激活，PRL 的分泌是最终结果。通过这种方式，我们不是专注于一个标志物，而是评估了一个特征指纹，涉及几个先前确定的蜕膜化标志物，这是一个复杂的生理过程，无法通过单一途径的调节来解释。除了评估 PRL 分泌和 PKA 活性外，我们还探讨了裂解物中 Rho 依赖性蛋白激酶 （ROCK） 、蛋白激酶 B （Akt/PKB） 、酪蛋白激酶2 （CK2） 和总蛋白浓度的活性。选择这九种 EDC 的原因如下：BPA 及其替代化学双酚 F （BPF），因为它们之前已经在类似的模型中进行了研究（表 1），并且BPA 是一种已知的人类内分泌干扰物（欧洲化学品管理局）；邻苯二甲酸酯 MEHP （DEHP 的代谢物），因为它也是一种已知的人类内分泌干扰物 （欧洲化学品管理局） 并与人类流产有关；有机氯农药p,p’-DDE（DDT代谢物）和六氯苯（HCB），以及多氯联苯（polychlorinated biphenyls）PCB180和PCB170，因为它们在我们的队列研究中与更拖长的怀孕时间有关；HCB 还与临床妊娠和活产的机率较低有关；以及 PFOS 和全氟辛酸 （PFOA），因为它们与人类早产、胎儿生长受限和先兆子痫有关。此外，所选的 EDCs 具有不同的理化性质。BPA、BPF和 MEHP 迅速代谢并从体内排出；PFOS 和 PFOA 具有抗降解性（即持久性）、两亲性，主要与血浆蛋白结合并在肝脏中积累，而 p,p'-DDE、HCB 和 PCB 具有持久性、亲脂性并在脂肪组织中积累。所有 EDCs 的浓度均为 1 μM，以便在无毒暴露水平下识别危害。首先，在从两名女性获得的细胞中测试了 9 种不同的 EDCs。然后，在另外两名女性的细胞中进一步研究了那些显示出作用的化学物质（BPA、p,p'-DDE、HCB 和 PFOS）。总而言之，我们的结果表明某些 EDCs 对子宫内膜生物学构成危害。随访研究应侧重于对危害的详细描述，以便对人群进行风险评估。必须更详细地研究该终点的敏感性，并开发适用于筛查大量化学品的测试系统。

材料和方法

女性、子宫内膜样本和基质细胞的分离

在子宫切除术后立即从子宫中收集了四名女性的子宫内膜组织：在乌普萨拉大学医院（Uppsala University hospital）妇科外科病房（gynecological surgical unit）编码为 4、5、8 和 12 的子宫内膜基质细胞 （eSCs）（表 2）。所有女性都处于月经周期的增殖期，没有子宫内膜异位症，总体上很健康（表 2）。将组织在分离培养基中的冰上运输到实验室：DMEM/F-12 含不含酚红的 HEPES（Gibco，Thermofisher，美国），含有 1% （v/v） 青霉素/链霉素（Thermofisher，美国）。eSCs 5 和 8 在手术当天分离。由于手术较晚，eSCs 4 和 12 在 4°C 下保存过夜，第二天早上分离细胞。

Table2

这些研究得到了瑞典乌普萨拉地区伦理审查委员会（Uppsala Regional ethical review board, Sweden）的批准，该委员会现在是瑞典伦理审查机构（参考编号 2011/430）。根据赫尔辛基宣言，所有参与者都给予了知情的书面同意。临床信息检索自患者期刊。所有样本和数据均采用假名化处理。数据处理是根据相关准则（瑞典数据保护法 PUL 和通用数据保护条例 GDPR）进行的。

对于 eSC 分离，将子宫内膜组织置于装有分离培养基的 50 mL 试管中，并如前所述进行一些调整进行分离。将组织在分离培养基中洗涤 3 次，并使用手术刀切成小块。将 5 mg/mL IA 型胶原酶（Sigma Aldrich，德国）和 0.1 mg/mL DNase I（Roche，Sigma Aldrich，德国）在分离培养基中于 37°C 在摇床上混合 1 小时进行组织消化。酶组织消化后，将试管在室温 （RT） 下静置 10 分钟以沉淀。将含有 eSC 的上清液通过 40 μm 细胞过滤器过滤到 50 mL 收集管中。沉降和过滤重复 3 次。此后，通过在 200 × g RT 下离心沉淀细胞。

然后将细胞重悬于 1 mL 含酚红（Gibco，Thermofisher，美国）的 DMEM/F12 中，其中含有 10% 胎牛血清 （FBS;Thermofisher，美国），4% 羊膜最大 C100（Gibco，Thermofisher，美国），0.2% 谷氨酰胺（Gibco，Thermofisher，美国）和 0.2% 青霉素-链霉素（生长培养基）。使用 90% ACK 裂解缓冲液（Gibco，Thermofisher，美国）和 10% 生长培养基裂解红细胞。通过离心（200 x g，6 分钟放宽）使 eSC 沉淀，并在 37°C 加湿培养箱中，在 5% CO₂ 箱中培养。

达到约 80% 汇合后，用胰蛋白酶-EDTA（Gibco，Thermofisher，美国）沉淀分离细胞，并重悬于回收细胞培养冷冻培养基（Thermofisher，美国）中以冷冻细胞。MR Frosty（VWR，Avantor，美国）与储存在4°C 的 2-丙醇一起使用，以实现 -1°C/min 的冷却速率。将细胞缓慢冷冻至 -80°C 过夜，然后储存在液氮中直至使用。

eSCs 的特征

使用 UltraVision One Detection System HRP 聚合物试剂盒 （Fisher Scientific TL-060-HLJ） 对基质细胞和上皮细胞标志物进行免疫染色进行显色反应，以表征 eSC 悬浮液的纯度。使用 1：250稀释的一抗抗波形蛋白克隆 V9（DAKO，Agilent，USA）对基质细胞进行染色，而使用 1:100 稀释的一抗抗细胞角蛋白-8/18克隆 Zym5.2（Thermofisher，USA）对上皮细胞进行染色。1:100 稀释的小鼠 IgG1 （Dako， Agilent， USA） 用作阴性对照。将 100 000 个细胞/孔接种在 8 孔腔室载玻片中并孵育过夜。用 4% 缓冲甲醛溶液固定细胞，并在 -20°C 下用冷乙醇透化。用 0.3% H₂O₂ 的甲醇溶液进行过氧化氢封闭。根据制造商的方案进行免疫染色，并用光学显微镜记录结果。

EDC 库存的制备

将 HCB、p,p'-DDE 和 PCB180（Sigma-Aldrich，货号 45522、35487、35495）溶于二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，货号 D8418）中，在 65°C 加热15-60 分钟，间歇涡旋。此后，将化学品在水浴中超声处理 15-60 分钟。PCB170（Sigma-Aldrich，货号 34107）、PFOS（Sigma-Aldrich，货号EHERC15987120）、PFOA（Sigma-Aldrich，货号 171468）和 BPA（Sigma-Aldrich，货号 239658）通过涡旋溶解在 DMSO 中至浓度为 1-5 mM。Christian Lindh 教授（瑞典隆德大学职业与环境医学系）在 DMSO 中提供了 BPF 和MEHP 的 1 M 溶液。在用于细胞培养实验之前，使用DMSO 将所有储备液稀释至 1 mM 标称浓度。将原液储存在硼硅酸盐玻璃样品瓶中。持久性化学储备液（HCB、p,p'-DDE、PCB180、PCB170、PFOS 和 PFOA）在 4°C 下储存，其他化学品（BPA、BPF 和 MEHP）在 -20°C 下储存。为了对浓度进行质谱验证，将 DMSO 储备液在饥饿培养基中稀释，以达到 2 μM 标称浓度。按照先前发表的方法，使用气相色谱-串联质谱法 （GC-MS/MS） 验证 DMSO 储备液中 HCB、p,p'-DDE、PCB170 和 PCB180 的浓度 。使用先前发表的液相色谱串联质谱法 （LC-MS/MS） 方法直接从 DMSO 储备液中分析 MEHP、BPF、BPA、PFOS 和 PFOA 浓度，无需任何预处理。这些验证分析的数据显示在附录中（表 S1）。

eSCs 的处理和裂解

在体外蜕膜化研究之前，分离的 eSCs 在检测培养基中培养 2 代：Dulbecco 改良Eagle 培养基 （DMEM）/不含酚红的 Ham's F12 培养基（Sigma-Aldrich，Steinheim，德国）补充有 10% 木炭纯化的胎牛血清 （ccFBS）、2 mM L-谷氨酰胺（均来自 Sigma-Aldrich;Steinheim，德国）和青霉素 （100 U/mL）、链霉素 （100 μg/mL） 和两性霉素 B（0.25 μg/mL;来自德国 慕尼黑苏黎世）的混合物。达到汇合后，将细胞接种到密度为 100 000 – 170 000 个细胞/孔的 6 孔板上；1-3 天后，用饥饿培养基（含有与检测培养基相同的成分，但 2% ccFBS）替换检测培养基，再过 24 小时后，开始处理。将分化混合物 （DC-mix） 激素和化学物质添加到饥饿培养基中以获得以下最终浓度：10 nM β-雌二醇 （E2）；100 nM 黄体酮 （P4）；200 μM 8-溴腺苷 3'，5'-环磷酸钠盐 （8-Br-cAMP）；和 100 μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 （IBMX）。所有 DC 混合组分均来自 Sigma-Aldrich（德国斯坦海姆）；在细胞培养级 DMSO （AppliChem;Darmstadt， Germany） 作为 1000 倍浓缩原液 （1 000x），并储存在 -20°C 下。以 1 μM 终浓度添加 EDC。按体积计算，处理混合物中载体 （DMSO） 的最终浓度如下：E2 对照为0.1%，DC 混合物为 0.4%，DC 混合物 + 任何 EDC 为 0.5%。体外蜕膜化方案共持续 9 天;每 72 小时更换一次处理混合物 （完全培养基更换）。

收集用过的培养基并储存在 -80°C 下。在 9 天处理结束时，用磷酸盐缓冲盐水（PBS;来自德国斯坦海姆的 Sigma-Aldrich）冲洗细胞，并如前所述裂解 （34）。裂解缓冲液组分来自以下来源：HEPES 和 NaCl – Calbiochem（德国达姆施塔特）;EDTA – Scharlau （西班牙巴塞罗那）;Triton X-100 – Ferak （德国柏林）；苯甲基磺酰氟 （PMSF） – AppliChem（德国达姆施塔特）；cOmplete™ 蛋白酶抑制剂混合物 – 罗氏（瑞士巴塞尔）。在冰上裂解 1 h 后，离心沉淀膜，并收集上清液。

可行性评估

通过定量裂解物中的总蛋白浓度和在 9 天蜕膜化测定结束时测量活力标志物 CK2 的活性来估计细胞活力和增殖。使用 Pierce™ 考马斯 Plus （Bradford） 检测试剂 （Thermo Fischer Scientific;美国伊利诺伊州罗克福德）根据制造商的说明。用于校准的牛血清白蛋白 （BSA） 稀释液 （2 - 128 μg/mL） 和用作 Bradford 分析阴性对照的 PBS（补充有 Ca²⁺、Mg²⁺）来自 Sigma-Aldrich（德国斯坦海姆）。用 PHERAstar 多功能读数仪 （BMG Labtech;Ortenberg，德国）具有以下参数：滤光片块608A （590 nm），每孔 20 次闪光，焦距 10.5 mm，体积为 150 μL 的光路校正。

然后使用激酶测定缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.005% Triton X-100、0.5 mg/mL BSA、5 mM 二硫苏糖醇）将每个样品中的总蛋白浓度标准化至同一天裂解样品之间的相同水平。为了测量 CK2 的活性，使用了前面描述的方案 。简而言之，将 ARC-1530 探针（终总浓度为 2 nM）添加到裂解物稀释液中（总蛋白浓度为 200-400 μg/mL）。ARC-1530 的合成如前所述。孵育 60 分钟后，用 PHERAstar 多功能阅读器 （BMG Labtech;德国奥尔滕贝格）使用以下参数：延时光致发光，激发 337 （300–360） nm，发射 590nm，每孔 200 次闪光，积分开始 60 μs，积分时间 400 μs。接下来，加入选择性竞争性 CX-4945（来自中国上海的 Synkinase）（终总浓度为 2-4 μM）；孵育 30-60 分钟以达到平衡后，再次测量光致发光。

蜕膜化标志物的测量

通过定量用过的培养基样品中的 PRL 来测量 PRL （从体外处理的最后 72 小时开始）和评估 9 天体外蜕膜化后细胞裂解物中的激酶活性，如前所述。在培养基样品中，如上所述测量总蛋白浓度。然后，使用人 PRL ELISA 试剂盒 （Cayman Chemical；美国密歇根州安娜堡）；使用 Cytation 5 多功能微孔板检测仪 （Biotek;Winooski， VT，USA）。最后，将校准曲线计算的 PRL 浓度归一化为相同培养基等分试样中的总蛋白浓度。

对于在含有 p,p'-DDE 和 HCB 的混合物实验中收集的用过的培养基样品，还评估了非蜕膜化对照细胞、蜕膜化细胞（用DC 混合物处理 9 天）和用补充 1 μM p,p'-DDE 或 HCB 的 DC 混合物处理 9 天的细胞的 IGFBP-1 水平。使用人 IGFBP1 ELISA 试剂盒 （Invitrogen;美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）;使用 Cytation 5 多功能微孔板检测仪 （Biotek;Winooski， VT，USA）。同样，将校准曲线计算的 IGFBP-1 浓度归一化为相同培养基等分试样中的总蛋白浓度。

如所述，使用基于激酶反应探针的竞争性光致发光置换测定法评估蛋白激酶 PKAc、ROCK 和 Akt/PKB 的活性。裂解细胞并将同一天裂解的样品之间的总蛋白浓度（如上所述由 Bradford 测量）标准化至相同水平后，将 ARC-1139 探针（最终总浓度为 2 nM）添加到裂解物稀释液中（总蛋白浓度为 200-400 μg/mL）;ARC-1139 的合成如前所述。孵育 60 分钟后，用 PHERAstar 多功能阅读器 （BMG Labtech;Ortenberg， Germany） 使用以下参数：延时光致发光，激发 337 （300–360） nm，发射 675 （50） nm，每孔 100 次闪光，积分开始 60 μs，积分时间 400 μs。接下来，加入选择性竞争性激酶抑制剂 H89 （PKAc） 、 Y-27632 （ROCK） 或 GSK690693 （Akt/PKB） （终总浓度分别为 2-4 μM、2-4 μM 和0.2-0.4 μM）; 孵育 30-60 分钟以达到平衡后，再次测量光致发光。蛋白激酶抑制剂从以下来源获得：H89 – Biaffin（德国卡塞尔）; Y-27632 – 开曼化学公司（美国密歇根州安娜堡）; GSK690693 – Tocris （英国布里斯托尔）。

EDCs 和对照化合物在无细胞条件下对激酶的影响

为了解决 EDCs 是否可能直接结合蛋白激酶从而影响其活性，使用重组 PKAcα（人全长蛋白;Biaffin）、ROCK2（人 His₆ 标签蛋白，氨基酸 11-552;Millipore）、Akt3/PKBγ（人 His₆ 标记的 S472D 突变蛋白，氨基酸 117-C 末端;Millipore）和 CK2α（人类蛋白质，氨基酸 1-335; 科隆大学 Karsten Niefind 教授的善意提供）根据先前建立的方案。简而言之，在激酶测定缓冲液中制备 EDC 或对照抑制剂的溶液，并加入由激酶和荧光或光致发光探针组成的复合物;孵育 30-60 分钟后测量信号（表 S2）。在PKAcα 的情况下，使用两种不同的探针来确保测定的足够动态范围。反应混合物中 EDC 的最终总浓度为 1 μM。

使用类似的格式确认所选抑制剂在测试激酶组中的选择性，但选择探针的最终浓度 （2 nM） 来模拟裂解物检测中使用的条件。测定混合物中活性激酶的最终总浓度等于 3 nM。为了评估剂量反应曲线，测试了置换化合物的稀释系列（从 20 μM 终浓度开始的 3 倍稀释）（图 S1）。进行了两项独立实验。

为了评估单独使用 EDCs 是否对总蛋白含量的测量有影响，将升高浓度的 EDCs（最终测定混合物中为 5 μM）单独加标到 PBS 缓冲液中，并将标准校准蛋白 BSA 的两倍稀释系列放入加标缓冲液中。作为对照，在非加标 PBS 中进行 BSA 的类似稀释。随后根据制造商的说明进行 Bradford 分析。实验一式两份进行一次。

在 PRL ELISA 的情况下，在每个独立实验中，将相同条件下处理的样品的标准化 PRL 含量（以 ng/mg 总蛋白为单位）合并（请注意，每个患者的样品都有几瓶细胞，因此可以使用来自一个患者的 eSC 进行多个独立实验：eSC4 N = 5;eSC5 的 N = 5;eSC8 的 N = 7;eSC12 的 N = 4; 所有测量均一式两份进行）。为了评估 EDCs 对蜕膜化的影响，在合并数据之前，通过在每个独立实验中将 DC 混合物中的归一化 PRL 含量设置为 100% 来进行额外的归一化。通过单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验为合并数据建立 DC 混合与其他组之间差异的统计显着性。为了评估EDC 对 ELISA 试剂盒组分的影响，使用校准曲线计算加标标准品的表观浓度。0.5% DMSO 对照与其他组之间差异的统计学显着性是通过单因素方差分析和 Dunnett 检验进行多重比较。

在 IGFBP-1 ELISA 的情况下，该实验使用来自总共四个独立实验的样品进行：一个 eSC4 实验、一个 eSC5 实验和两个 eSC8 实验。与 PRL ELISA 一样进行数据标准化。通过单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验为合并数据建立 DC 混合与其他组之间差异的统计显着性。

在裂解物中进行蛋白激酶活性测定的情况下，对于每种靶激酶，计算添加竞争性抑制剂之前和之后探针信号的差异。为了评估 EDCs 对蜕膜化的影响，将单个独立实验中不同裂解物中每种靶激酶的计算值归一化为用 DC混合物处理的 eSCs 的裂解物计算的值（活性设置为 100%）。然后将所有测量的结果合并（eSC4 的 N = 5;eSC5 的N = 5;eSC8 的 N = 6;eSC12 的 N = 4;所有测量均一式两份进行）。通过单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验为合并数据建立 DC 混合与其他组之间差异的统计显着性。

在重组蛋白激酶活性测定的情况下，将含有抑制剂的混合物测量的探针信号归一化为激酶-探针复合物（活性 = 100%）和游离探针（活性 = 0%）的信号。然后合并所有测量结果（每种激酶 N = 2;所有测量一式两份）。激酶-探针复合物与含抑制剂的混合物之间的差异通过单因素方差分析和多重比较的 Dunnett 检验确定合并数据之间的差异的统计显着性。数据以平均值和平均值的标准误差 （SEM） 表示。P 值 <0.05被认为是显著的，并在图中标记如下：*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001.

研究设计

原代子宫 eSCs 用于研究 EDCs对体外蜕膜化的影响，以激酶活性和 PRL 分泌为终点（图 1）。我们根据它们在育龄妇女的生物监测样本中普遍存在，以及它们与可能源自子宫内膜的生育能力降低 （怀孕时间较长、流产、先兆子痫） 的显著关联，选择了 9个 EDCs。一些选定的 EDCs 是非持久性的（BPA、BPF、MEHP），而另一些具有亲脂性（p,p'-DDE、HCB、PCB170、PCB180）或两亲性（PFOS、PFOA）特性的持久性。在DMSO 中制备 EDC 储备液，并通过质谱法验证浓度（表 S1）。确认所有库存的浓度接近预期 （80 – 130%），但两种多氯联苯的浓度明显低于预期：PCB170 为 20%，PCB180 为预期浓度的45%（表 S1）。众所周知，PCB 很难溶解，即使通过加热、涡旋和超声处理也是如此。在这里，当显示结果时，将使用标称浓度。

EDCs 没有细胞毒性

为了验证所选浓度对细胞没有细胞毒性，在培养 9 天后，通过测量细胞裂解物中细胞增殖激酶 CK2 的蛋白质浓度和活性来估计细胞增殖和活力。CK2 是一种特征明确的促存活激酶，它通过磷酸化 Cdc37-Hsp90 复合体代表的主要伴侣机制来维持细胞活力；因此，CK2 活性的降低反映了样品中活细胞数量的减少。与 DC 混合物相比，没有一个 EDC 显着降低蛋白质含量或 CK2 活性，表明暴露没有细胞毒性（图 S3）。只有MEHP 增加了蛋白质含量，这可能表明增殖增加。

EDCs 破坏体外蜕膜化标志物

第一步，使用两名女性的 eSCs 筛选9 个 EDCs 的效果。细胞用 DC 混合物处理 9 天，有或没有 1 μM 浓度的EDC。每三天更换一次培养基，并在培养的最后一天以裂解物或培养基等分试样测量对激酶和 PRL 的影响。预期，与单独的 E2 处理相比，DC 混合物显着增加了所有激酶的 PRL 分泌和活性（图 2）。因此，在所有实验中，将 DC 混合物用作阳性对照并设置为 100%，单独使用 10 nM E2 作为阴性对照。我们之前的实验表明，E2 和 DMSO 是该系统中可比的阴性对照，我们在这里选择使用 E2 来反映这种激素在受孕年龄期间女性生殖系统中持续存在。

当我们将来自阳性对照 （DC-mix） 的信号与实验组 （DC-mix+EDC） 的信号进行比较时，我们发现一些 EDC 显着降低了蜕膜化标志物。BPA、p、p'-DDE、HCB 和 PFOA 显着降低培养基中经典蜕膜化标志物 PRL 的分泌至 70 ± 8%、59 ± 4%、72 ± 2% 和 84 ± 6%（图 2）。这些作用与激酶活性显著降低相关，但并非一致：BPA 导致 Akt 活性降低 （86 ± 3%）;p，p'-DDE 导致 PKAc （66 ± 6%） 、ROCK （71 ± 4%） 和 Akt （75 ± 4%） 活性降低;HCB 导致PKA （81 ± 1%） 和 ROCK （83 ± 3%） 活性降低;PFOA 对任何激酶的活性都没有显著影响。有趣的是，PFOS 和 PCB170 也导致激酶活性降低，尽管这些 EDCs 对 PRL 分泌没有统计学意义的影响。然而，可以观察到 PFOS 暴露也减少了 PRL 分泌，但效果在 p<0.05 （p=0.052） 时没有达到显着性。最后，BPF 和 PCB180 对激酶活性或PRL 分泌没有任何显着影响。总的来说，代表不同物理化学性质的 EDCs 在体外显著降低了激素刺激的蜕膜化过程。PRL 分泌减少是位于 cAMP/PKA 信号转导下游的蜕膜化标志 ，尽管观察到某些变异，但伴随着激酶活性降低，这表明多个上游通路可导致 PRL 分泌中断。

为了证实观察到的趋势，我们还评估了另一种蜕膜化生物标志物 IGFBP-1 的分泌是否受到治疗混合物中 p,p'-DDE 或 HCB 存在的影响（图 S4）。这些分析证实，在 EDC 存在的情况下，IGFBP-1 分泌在统计学上显着减少。分别测量了用含有 p,p'-DDE 和 HCB 的混合物处理的细胞的 81 ± 5% （相对于 DC 混合物的 p<0.01） 和 84 ± 8% （相对于 DC 混合物的 p<0.05）。

EDCs 不直接抑制激酶

我们还想研究 1 μM 浓度的 EDC是否会直接干扰激酶的活性。为此，使用重组蛋白激酶进行游离激酶结合测定。作为对照，使用相应蛋白激酶的选择性抑制剂（PKAcα 的 H-89，ROCK2 的 Y27632，Akt3 的GSK690693，CK2α 的 CX-4945;相应抑制剂的选择性通过每种化合物的剂量反应研究验证，包括所有四种感兴趣的蛋白激酶，见图 S1）。出乎意料的是，所有四种激酶的选择性抑制剂都大大降低了激酶残留活性（图 3）。没有一个EDCs 影响重组 PKAcα 的活性（图 3A）。有趣的是，其他激酶的活性被 EDCs 略微上调。与设置为 100% 的对照相比，重组 ROCK2 的活性增加了几个 EDCs （BPF 107 ± 2%; p,p'-DDE 108 ± 1%；HCB 108 ± 0%；PCB170 109 ± 1%；PFOA 108 ± 1%；全氟辛烷磺酸 111 ± 2%），MEHP （118 ± 2%）、对-DDE（119 ± 4%）、六氯苯 （118 ± 4%）、PCB170 （124 ± 5%） 和全氟辛烷磺酸 （124 ± 3%） 提高了重组 CK3 的活性，重组 CK2α 的活性增加了 MEHP （110 ± 2%）、六溴联苯 （110 ± 3%）、多溴联苯 180 （109 ± 3%） 和全氟辛烷磺酸 （112 ± 1%）。这可以通过在含有疏水部分的 EDCs 存在下激酶或光致发光探针的非特异性结合减少来解释。BPA 不影响任何重组蛋白激酶。总体而言，所有观察到的差异都显示活性增加，而不是降低，这表明 EDCs 对 eSC 裂解物中激酶活性降低的影响并非源于激酶的直接抑制，而是源于对激素触发的信号转导导致蜕膜化的整体影响。这里探讨的蜕膜化标志物激酶（PKAc、ROCK 和 Akt）都需要上游激活（分别通过 cAMP、Rho 和PI3K/PDK1），这进一步增加了 EDCs 蜕膜化破坏模型的复杂性。在未来的研究中需要探索 EDCs 的确切分子靶标，例如利用蛋白质组学、转录组学或代谢组学等大规模分析技术。了解精确的机制可能有助于开发不依赖于主要患者材料的新型蜕膜化检测方法。

Figure3

验证 BPA、p,p'-DDE、HCB 和 PFOS 效应

使用另外两名女性的细胞对 BPA、p，p'-DDE、HCB 和 PFOS 进行了额外的重复实验，以验证结果。对 4 名女性样本的实验汇总结果表明，这些化学物质在体外显著破坏激素诱导的蜕膜化（图 4）。尽管样品之间的反应存在差异（图 S5），但统计分析表明，所有四种 EDC 都显着减少了 PRL 分泌到培养基中（p,p'-DDE 75 ± 6%，HCB 76 ± 3%，BPA 80 ± 5%，PFOS 90 ± 3%，与 DC 混合物设置为 100% 相比）。考虑到细胞活力和增殖的标志物，阴性对照 E2 和阳性对照 DC 混合物之间的CK2 活性和总蛋白含量均存在显著差异（图 4），这与我们之前报道的关于 DC-mix 处理后 eSCs 增殖率降低的观察结果一致。此外，与九种不同的 EDCs 的筛选一致（图 S3），细胞的活力不受 EDC 暴露的显著影响（图 4）。在我们之前使用原代细胞的研究中也注意到来自不同女性的样本对激素刺激的体外蜕膜化的反应存在差异，这至少部分反映了个体对激素（DC 混合物的成分）和 EDCs 的不同敏感性。细胞培养基中 PRL 分泌的减少伴随着激酶活性的不同程度的降低。BPA 对激酶的影响最小（在汇总数据中没有显著影响），p,p'-DDE 导致 PKA 活性降低（85 ± 6%），PFOS 导致 PKA活性降低（87 ± 5%）和 Akt（87 ± 5%），HCB 影响所有标志物（82 ± 3% PKA;85 ± 4% AKT;85 ± 4% ROCK）。

Figure4

讨论

缺乏用于筛选和表征破坏女性生育能力的化学物质的相关模型系统。很明显，在队列研究中，EDCs 血清水平升高与女性生育能力较差相关，但由于相关性并不意味着因果关系，因此需要实验研究来提供因果关系的证据，以确定最敏感的目标器官，并了解其影响背后的机制。人原发性 eSCs 可从子宫切除术中获得、分离并在培养中研究。这种细胞对激素敏感，概括了子宫内膜生物学的许多方面，并已被用于研究体外胚胎附着的避孕作用，甚至应用于 EDC 研究（表 1）。据我们所知，我们的研究是第一个在原代细胞中测试大量水平相对较低的 EDCs 的研究。尽管临床原始样本容易出现大量的个体间差异，就像在我们的研究中观察到的那样（图 S5），但我们发现使用来自四名女性的细胞的 EDCs 显著破坏了蜕膜化。测试的 EDCs 浓度高于通常在女性或育龄期发现的浓度，但 DC 混合物超生理中类固醇激素的浓度也高于正常水平。因此，我们模型的结果表明，蜕膜化过程对各种物理化学性质的 EDCs 很敏感。未来的研究应该测试永生化细胞系是否可以用于检测相同的效果，因为这将允许在更广泛的化学物质中更广泛地利用蜕膜化模型。另一方面，根据我们之前对永生化细胞系与原代细胞的经验，与体外蜕膜化相关的标志物概况大不相同，这引发了对永生化细胞系在此类研究中适用性的充分性的问题。

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在此处评估的标记物中，PKAc 是蜕膜化的经典参与者，被 cAMP 细胞内水平升高激活，并通过 CREB 和其他转录因子触发基因表达变化。关于 Akt 信号转导在蜕膜化中状态的报告有些矛盾，因为几个小组之前曾报道过在体外蜕膜化过程中磷酸化水平降低，因此 Akt 活性降低；然而，我们以前的研究表明 Akt 活性增加。我们假设 Akt 可能参与从增殖性子宫内膜过渡到分泌性子宫内膜的代谢重编程特征;此外，其他研究也强调了 Akt 的抗凋亡作用对成功蜕膜化、胚胎植入和怀孕的重要性。在我们之前的研究中将 ROCK 确定为黄体酮的新型下游靶点；在蜕膜化的情况下，ROCK 负责细胞骨架的稳定和与间充质-上皮转化相关的 eSCs 迁移特性的变化。

受 EDCs 影响的确切蜕膜化相关靶标超出了本研究的范围。游离激酶活性测量表明，EDCs 对测试的蛋白激酶没有直接的抑制作用。据推测，EDC 对激酶活性的调节可能发生在上游激活水平上，例如，通过将 EDC 与介导 cAMP 和 Ca²⁺ 信号转导的膜 G 蛋白偶联雌激素受体结合。此外，本研究中观察到的 PFOS 和 PCB170 的蜕膜化相关激酶标志物减少但 PRL 分泌没有减少，这表明 PRL 表达不仅可以通过 PKAc、ROCK 或 Akt 途径进行调节，或者激酶活性必须降低到某个阈值以下才能触发下游基因表达的降低。EDCs 与类固醇受体的记录相互作用进一步增加了 EDCs 介导的对基因表达水平的影响的复杂性。

eSCs 是胚胎附着和植入的核心，其功能的破坏可能导致植入和/或胎盘失败，从而导致妊娠并发症和流产。我们的目标是研究育龄妇女中常见的化学物质是否可以破坏蜕膜化。与人群暴露水平相比，所选 EDC 的浓度 （1 μM） 相对较高，但低于之前的几项研究（表 1）。如果要考虑安全因素，1 μM 浓度的 EDC 的影响将转化为1000 倍的安全暴露水平 （1 nM），这与典型的人类暴露角度相关。实际上，溶解度问题导致实验中 PCB 的水平低于预期（表 S1）；然而，它们可能高于女性血清中测得的典型 pM 水平。在这些条件下，一半的研究 EDC 在体外破坏了至少一个蜕膜化标志物（图 5），这也许不足为奇，因为我们在队列研究中选择它们是因为它们与不孕症、流产和更长的怀孕时间有关。

我们研究的局限性在于，我们只使用了四名不同女性的eSCs。然而，即使在统计学层面上，也可以可靠地确定最显著的趋势。关于在此使用的蜕膜化协议，可以强调以下两个局限性。首先，测量是在蜕膜化9天后进行的，但我们之前确认，对于所监测的标记集，这样的实验持续时间是最佳的。其次，我们使用了E2作为阴性对照，而不是DMSO，但之前已经证明，对于所测量的标记集，无论是DMSO还是E2都是适合代表未蜕膜化细胞的处理方式；此外，考虑到本研究中应用E2的重要性，因为EDCs必须在女性体内与生理水平的E2竞争。另一个局限性体现在使用蛋白激酶抑制剂来解析特定激酶（PKA、ROCK、Akt和CK2）上，因为化合物的选择性并非绝对。然而，至少从所选标记集内交叉选择性的角度来看（图S1），置换化合物的选择性足以得出上述结论。

总之，这些研究结果表明，EDCs可能对蜕膜化过程构成威胁，并且子宫内膜细胞应被视为内分泌干扰的靶点。值得注意的是，子宫内膜通常每月更新一次，因此在该组织中积累更多持久的EDCs的可能性不大；因此，通过血液循环的暴露似乎更为相关。我们专注于单个EDC暴露的影响。然而，女性从未只接触一种化学物质，而是接触复杂的污染物混合物，其中已经证明存在组合效应，导致不良健康后果。与许多队列研究一起，我们的体外筛选表明，EDC暴露可能与女性的流产和不孕有关。后续研究需要解决浓度-反应关系，以进行风险评估。在女性不孕症诊所的帮助下，可以更详细地研究EDC在子宫内膜生物学、着床失败和流产中的作用。最后，通过确定EDCs对子宫内膜样本的生育能力的影响，可以为这些女性实施调整后的治疗措施，从而在未来实现更多成功的怀孕和活产。

参考文献（略）。

未完待续。

下篇：

生殖免疫的核心：子宫内膜异位症和腺肌症、肌瘤等相关免疫炎症、生殖破坏、妊娠失败等相关病理生理，全文第二部分，二、反复种植失败（RIF）与子宫内膜容受性评估

（二、12）内分泌干扰物对生殖系统的不利影响

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