影响因子：10.3
足细胞对维持肾小球滤过屏障至关重要。与肾病综合征相关的基因突变导致足细胞细胞质钙升高，并导致滤过屏障功能的破坏。钙信号是否在滤过屏障的初始形成中起作用尚不清楚。通过在斑马鱼幼鱼和人类肾脏类器官两个模型中使用活钙成像，作者证明足细胞钙信号在足细胞分化过程中是活跃的，是足细胞自主的，独立于邻近细胞类型发生，并且是足突和狭缝隔膜形成所必需的。他们的研究结果还表明，发育钙信号的发生机制与疾病相关的钙干扰不同，是足细胞形态发生和过滤屏障形成的关键调控信号。
足细胞对维持肾小球滤过屏障至关重要，并且已知肾病综合征基因的突变会影响足细胞钙信号传导。然而，钙信号在足细胞发育过程中的作用尚不清楚。
我们利用斑马鱼幼鱼和人类肾脏类器官对发育中的足细胞进行了钙信号的实时成像。为了评估发育过程中的钙信号，以及对通道阻滞剂和遗传缺陷的响应，钙生物传感器GCaMP6s在斑马鱼足细胞中表达。我们使用电子显微镜来评估斑马鱼的过滤屏障形成，并使用Fluo-4来检测人肾类器官分化足细胞中的钙信号。
未成熟的斑马鱼足细胞(受精后2.5天)产生钙瞬态，与形成肾小球毛细血管的相互作用相关。钙瞬态持续到受精后4天，并在肾小球屏障形成完成后消失。我们在成熟的人类类器官肾小球中检测到类似的钙瞬变，这提示了一个保守的机制。在这两种模型中，SERCA或IP3受体钙释放通道抑制剂阻断了足细胞中的钙瞬态，而镧则无效，表明钙来源自足细胞内质网储存。钙瞬态不受阻断心跳或内皮、内胚层发育的影响，且在离体肾小球中持续存在，提示足细胞自主钙释放。抑制磷脂酶C-γ1的表达可显著降低钙活性，而抑制Nephrin或磷脂酶C-ε1的表达则不能。最后，阻断钙释放影响肾小球形状和足细胞足突形成，支持钙信号在肾小球形态发生中的关键作用。
这些发现证实了足细胞自主钙信号是足细胞分化的一个突出且进化保守的特征，并证明了足细胞足突形成的必要性。
材料与方法
斑马鱼(Danio rerio)成鱼和幼鱼按照既定方案饲养。本研究使用的鱼线见表1。所有胚胎和幼鱼均用0.02%三卡因甲烷磺酸钠麻醉(MS 222；Sigma-Aldrich)，并在0.2%三卡因甲烷磺酸钠中安乐死。所有的研究都遵循美国国立卫生研究院(NIH)实验动物的护理和使用指南，并得到了马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会的批准。
为了在表达wt1b的细胞中产生表达内毒素诱导的ERT结构域与Gal4融合的Tg(wt1b:Gal4ERT)斑马鱼系，将wt1b启动子从pCRII-TOPO-zfwt1b质粒(Englert实验室的礼物)扩增到p5E载体中，然后使用p5E-wt1b、pME-Gal4-ERT-VP16、32 p3E-ploy(a)和pDestTol2a-crystallin mCherry通过三片段通道反应(Invitrogen)组装到最终表达载体中。
参照文献报道诱导Tg(wt1b:Gal4ERT)表达，不同之处是采用(E/Z)-盐酸多西芬(E8284；Sigma)代替4-羟基他莫西芬。Endoxifen以10 mM的原液浓度溶解在乙醇中，然后在受精后12小时(hpf)以10 μM的终浓度加入鱼水中，直到胚胎成像(约24 hpf)。
根据Kimmel等人的方法进行胚胎和幼鱼分期，人工脱色，用0.02%的三卡因甲磺酸麻醉，然后装在装有1.5%低熔点琼脂糖的玻璃底培养皿中。钙成像采用蔡司LSM 510共聚焦显微镜(钙成像，卡尔蔡司)，配40倍水物镜，在1 Hz下进行，约8分钟(500秒)。如前所述，使用Fiji和MATLAB进行图像分析。我们根据SD z投影手动选择感兴趣的区域。ΔF/F和活动的归一化积分是用MATLAB编写的自定义脚本计算的(可在https://github.com/lydiadjenoune/calcium_analysis_podocytes获得)。与GCAMP6s信号相关的荧光变化定义为Δ函数ΔF/F。每个感兴趣区域的ΔF/F计算为ΔF/F=(F[t]−F0)/F0，其中F0为光漂白校正后手动选择的基线，F(t)为给定时间的荧光强度。利用二阶多项式在ΔF/F轨迹上拟合阈值最小值，通过减法修正基线，然后利用梯形积分近似在修正后的ΔF/F轨迹上计算积分/ ΔF/F。对于涉及多个实验条件的成像，除非另有说明，否则所有溶液均为浴液。在所有散点图上，一个点代表一个单元格。在原始痕迹上，前后痕迹表示药物治疗前后给定细胞的活性。请注意，对于所有药物治疗，在药物应用之前和之后分析了完全相同的细胞的活性。
肾类器官是使用先前描述的iPSC MAFBmTagBFP2/+报告细胞系，按照我们之前发表的定向分化方案生成的。简单地说，iPSCs单层培养7天后分化为后肾间质。在第7天(D7)，细胞被解离并生物打印成三维结构，形成类器官。然后将类器官培养19天(D7+19)，然后作为完整的类器官进行分析，或者使用机械解离和筛选分离肾小球(分离的类器官肾小球，OrgGloms)。简单地说，通过温和的移液和TrypLE Select酶(Thermo Fisher Scientific)的孵育，类器官被酶和机械分离。均匀的细胞悬浮液然后通过一系列过滤器分离完整的肾小球细胞聚集体。
整个类器官免疫染色
固定肾类器官用以下一抗和二抗进行免疫染色:LAMA5 (Abcam 1:300, cat# ab77175)、Nephrin (NPHS1 1:300, Bioscientific, cat# AF4269)、Claudin-1 (CLDN1 1:100, Thermo Fisher Scientific, cat# 71-7800)、Alexa fluor 405驴抗小鼠(Abcam, cat# ab175659)、Alexa fluor 488驴抗山羊(Molecular Probes, cat# A11055)和Alexa fluor 568驴抗兔(Life Technologies, cat# A10042)。
肾脏类器官和细胞浸润均与钙指示物Fluo-4、AM、细胞渗透(Fluo-4、5 μM、F14201、Thermo Fisher Scientific)在必需6培养基(05946，干细胞技术)中稀释1小时和10分钟，分别在37℃孵育。成像前用100 μM镧(La3+)、20 μM环吡唑酸(CPA)、1 μM thapsigargin和30 μM 2-氨基乙基二苯硼酸盐(2-APB)或载体(DMSO)处理细胞，时间为30分钟。使用配备20倍空气物镜的蜻蜓旋转圆盘共聚焦显微镜(Andor Technology)在1 Hz下记录2-4分钟的钙通量。钙通量记录在37°C和5%二氧化碳的控制温度下进行。鉴定出局限于MAFBmTagBFP2/+表达足细胞的感兴趣区域，并对斑马鱼样本进行图像分析。实验在三个生物重复上进行，其中每个生物重复是一个独立的定向分化实验。统计学分析采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。
为了检测足细胞钙瞬态是否在细胞内储存或细胞外隔室释放后产生，我们使用钙通道阻滞剂La3+(100µM, 298182, Sigma)，肌浆网钙泵抑制剂CPA(20µM, C1530, Sigma)和thapsigargin(1µM, T9033, Sigma)和IP3受体抑制剂2-APB(30µM, D9754, Sigma)在受精后3天(dpf) Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)斑马鱼幼鱼。为了测试血管紧张素通路的作用，我们使用了选择性血管紧张素AT1受体拮抗剂氯沙坦(100µM, 3798, Tocris)。为了测试血管压力的贡献，我们使用心跳阻滞剂安哌唑(30µM, AOB5283, Aobious)。为了诱导足细胞损伤，我们将通过黄嘌呤氧化酶途径诱导氧化损伤的嘌呤霉素氨基核苷(PAN, 45 mg/ml, P7130, Sigma)注射到5 dpf Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)幼鱼的主静脉或心包囊中，并在7 dpf时进行成像。
将Morpholinos(基因工具)重悬在无菌水中，作为2mm的原液保存在−20°C。注射时，用0.1 M氯化钾、0.01M HEPES和0.2%酚红稀释morpholino寡核苷酸，使用Nanoliter 2000微量注射器(World Precision Instruments)进行注射。在单细胞期注射Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)斑马鱼胚胎。本研究中使用的Morpholinos见表2。只有显示预期表型的突变体，如前所述，在3 dpf下进行成像和随后的分析，并使用先前发表的引物通过RT-PCR确定敲低效率的验证(见表2中的参考文献)。
为了成像游离肾小球足细胞钙活性，首先将表达Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)的幼鱼悬浮在HBSS中(10-527F, Lonza)。然后在HBSS中加入二硫苏糖醇(10 mM, BP172-5, Fisher Scientific)，室温下搅拌30分钟，然后用HBSS洗涤三次。然后用10 mg/ml的2型胶原酶(Worthington)在HBSS中处理幼鱼，在28.5°C下处理30分钟，移液匀浆3次。过量加入HBSS使反应停止。然后在徕卡荧光立体镜下筛选(人工选择)离体肾小球，并将其小心地置于1.5%琼脂糖覆盖的HBSS中。
在0.02%三卡因甲磺酸溶液中麻醉幼鱼，然后在0.2%三卡因甲磺酸溶液中安乐死，然后在含有1.5%戊二醛、1%多聚甲醛、70 mM磷酸钠(pH 7.2)、3%蔗糖和1%单宁酸的溶液中于4°C固定过夜。如前所述，对传播EM的幼鱼进行了准备。在EMbed 812中包埋后，用3× Ultracut E (Reichert-Jung, Nussloch, Germany)进行半薄(300 nm)和超薄(90 nm)切片，切片转移到铜狭缝网格上(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)。然后用醋酸铀乙酯和柠檬酸铅对网格进行染色，并使用Morgagni电子显微镜(FEI, Eindhoven, NL)在80 kv下进行成像。统计学比较采用Brown-Forsythe和Welch方差分析，Dunnett T3多重比较检验。
除非另有说明，否则使用T检验比较药物治疗前后或肾小球加工前后的细胞钙活性。所有数据集的显著性水平均P<0.05。P值表示为:*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001， ****P<0.0001。所有量化均以95%置信区间的中位数表示。使用Prism8 (GraphPad)制作所有图表并进行统计分析。
结果
为了检查肾小球形态发生的动力学，我们对标记前肾原细胞(绿色)和内皮细胞(红色)的Tg(wt1:GFP)和Tg(flk1:mCherry)转基因斑马鱼系进行了成像(图1,A和B)。在30至72 hpf之间的实时成像显示了肾小球滤过屏障形成的早期阶段，当足细胞运动时，向中线主动脉迁移，并与形成毛细血管相互作用(图1,C-G,补充视频1)。为了探索钙活性在肾小球形态发生中的作用，我们使用Tg(podocin:Gal4;UAS:GCaMP6s)或Tg(wt1b:Gal4ERT;UAS:GCaMP6s)(针对36 hpf之前的时间点)对基因编码的钙生物传感器GCaMP6s在分化足细胞中的实时成像(图1，H-J)。我们观察到迁移的足细胞没有表现出显著的钙活性(从1到2 dpf;图1 j)。然而，一旦足细胞原基的中线汇合完成，可以检测到频繁的细胞内钙瞬变(3 dpf;图1,I和J，补充视频2)。足细胞胞质钙瞬态表现出快速的峰值和衰减行为，平均持续时间约为40秒(补充图1,a和C)。振幅，以ΔF/F的任意单位表示，相对恒定(图1I，补充图1B)。足细胞在分化过程中表现出钙瞬变(3~4 dpf;图1J)，并在鉴别大小的肾小球滤过屏障形成完成的阶段恢复到沉默状态(5-7 dpf;图1J，补充视频2)。钙信号积分值的变化(图1J)以相对恒定的幅度反映了瞬态频率的变化(图1I，补充图1A)。结果表明，在斑马鱼肾小球滤过屏障成熟过程中，存在一种以前未被发现的钙信号活动。
为了确定足细胞成熟过程中的钙信号传导是否是脊椎动物的共同特征，我们研究了iPSC衍生的人肾类器官肾小球形成过程中的钙动力学(图2)。肾类器官是由MAFBmTagBFP2/+ iPSC报告系产生的，当足细胞在类器官中产生时，荧光标记(蓝色)。这有助于确定类器官内的肾小球，使我们能够实时成像它们的发育(图2B)。早在肾发生诱导后10天(D7+10)就可以识别出MAFB+足细胞，这些细胞在随后的9天内成熟形成明确的肾小球，其特征是极化的NPHS1+足细胞位于GBM上，并被CLDN1+壁上皮细胞包围(图2C)。在类器官培养的两个阶段，分别为“早期”和“晚期”时间点(D7+12/14和D7+18/19，图2A)，用钙指示剂Fluo-4标记肾类器官(图2D)或OrgGloms(图2E)，对钙活性进行成像。有趣的是，足细胞钙活性在早期足细胞中是有限的，而在后期时间点成像的足细胞中则显著增加(图2H)。值得注意的是，Fluo-4钙探针在OrgGloms中的扩散得到了改善(补充图2,A和B)。总的来说，我们能够在完整肾脏类器官和OrgGloms(分别图2,F和G，补充视频3)的后期时间点显示成熟足细胞中可靠且可重复的钙瞬变。这些结果表明，钙信号的增加是肾小球形态发生的一个保守特征。
为了确定肾小球形态形成过程中足细胞钙活性的潜在途径，我们研究了血管活性激素血管紧张素II (Ang II)的作用。事实上，在培养的大鼠足细胞中观察到Ang II增加了细胞质钙活性。然而，在我们的系统中，Ang-II受体阻滞剂氯沙坦对分化足细胞钙活性没有显著影响(图3A)，这表明足细胞的发育依赖于不同的钙信号通路。由于在足细胞中发现了膜钙通道，包括TRPC5/6，我们接下来测试了细胞外钙的贡献。我们用钙通道阻滞剂La3+处理斑马鱼胚胎，并没有观察到斑马鱼和人类类器官发育足细胞中钙活性的显著降低(图3、B和D，分别为补充视频4和5)。尽管有报道称，在病理条件下，成年小鼠的La3+会刺激TRPC5并影响足细胞结构，但在发育中的斑马鱼肾小球中并未观察到该通道的表达，也未在人类ipsc衍生的OrgGloms中富集。为了确定钙是否从细胞内储存中释放，我们使用了SERCA泵抑制剂CPA和thapsigargin，以及IP3受体阻滞剂2-APB。使用这些化合物，我们观察到斑马鱼和人类类器官足细胞中钙活性的显著降低(图3、C和D分别见补充视频4和5)。这些数据表明，在人和斑马鱼足细胞分化过程中观察到的钙活性依赖于通过IP3受体从细胞内储存中释放出来，而不是通过细胞膜钙通道介导。
为了进一步探索足细胞发育过程中触发钙释放的信号通路，我们测试了BP诱导的足细胞机械拉伸是否会引起钙瞬变。我们通过morpholino敲低肌钙蛋白T-2 (tnnt2，也被称为沉默的心脏)和使用小分子amperozide从药理学上阻断斑马鱼的心跳(图4,A和B)。这两种治疗方法都没有显著降低钙瞬态活性，这表明足细胞发育钙瞬态不是由血管压力诱导的。由于足细胞与内皮细胞直接接触，我们通过检查cloche突变体来测试是否需要来自内皮的信号来启动足细胞钙信号，其中内皮细胞发育被阻断，导致缺乏内皮细胞的突变胚胎。尽管足细胞中线迁移失败，在cloche突变体中仍然观察到钙瞬变(图4C，补充视频6)。我们通过使用sox32 morpholino注射阻断所有内胚层发育来测试内胚层信号的贡献。在缺乏内胚层的胚胎中，未观察到足细胞钙活性降低(图4D)。这些结果表明，在肾小球分化过程中，足细胞钙瞬变不是由内皮细胞或内胚层诱导的，并提示，自分泌来源的刺激导致细胞内钙释放。
为了确定足细胞是否自主产生钙信号，我们分离肾小球并将其镀上HBSS成像。即使在不接触邻近组织的分离条件下，新分离的斑马鱼足细胞仍然表现出钙瞬态(图4E，补充视频7)。与我们在体内观察到的结果一致，从7dpf幼鱼中分离的足细胞在体外对钙瞬态是沉默的，这表明钙信号是受发育调节的(图4E，补充视频7)。这也表明在3dpf离体肾小球中观察到的钙瞬变不是由于细胞解离引起的损伤。同样，人肾类器官足细胞钙瞬态不受肾小球分离的影响。分离后斑马鱼或类器官足细胞的平均振幅和平均持续时间均未受到明显影响(图2，补充图1、B和C)。注意，斑马鱼游离足细胞的La3+处理不影响其钙活性，进一步证实了细胞内释放是钙的来源(补充图1D)。
IP3调控的钙从细胞内储存的释放依赖于PLC的活性和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸生成IP3。已有两种PLC酶在足细胞生物学中发挥作用:PLCe(其突变导致人类蛋白尿肾病)和PLCg(一种广泛表达的PLC同型)。此外，狭缝隔膜细胞粘附分子Nephrin的磷酸化已被证明在异位表达时刺激钙释放。为了测试这些候选调控因子的参与，我们用反义morpholino寡聚物瞬时击倒它们，并对由此产生的钙活性进行了表征。尽管敲低PLCe和Nephrin对钙活性没有显著影响，但敲低PLCg强烈抑制足细胞中的钙释放(图4F，补充视频8)。考虑到异位表达的Nephrin导致钙释放的报道，我们证实，在完全缺乏野生型Nephrin mRNA的胚胎中，钙瞬态仍然存在(补充图3)。我们的结果表明足细胞是自主信号细胞，通过细胞接触或局部产生的配体，刺激PLCg和IP3的产生，导致钙从细胞内储存中短暂释放。
足细胞钙瞬变与肾小球毛细血管袢的形成和滤过屏障的形成相关。肾小球滤过屏障的定义是足细胞足突交叉和特化细胞黏附的建立，即狭缝横膈膜。斑马鱼过滤屏障的最终成熟发生在3.5-4.5 dpf之间。我们通过抑制斑马鱼幼鱼中钙的释放，并通过EM检查滤过屏障的超微结构，来测试钙瞬态是否需要形成滤过屏障。为了避免影响整个胚胎，我们建立了低剂量的SERCA泵抑制剂CPA或thapsigargin，它们阻断足细胞钙的释放，但不影响心跳。用DMSO处理的对照幼鱼表现出正常的足突和过滤屏障形成，足突粘附在主动脉中线(图5、A和B)。相反，用20µM CPA或1µM 3.5至4.5 dpf的apsigargin处理的幼鱼的足突形成被阻止或抑制，没有证据表明足突形态正常，足突出现大的、被抹去的足突(图5B)。与对照组相比，与基底膜接触的细胞过程的量化显示，内质网钙泵抑制剂存在时，每微米GBM中确定的细胞过程数量显著减少(图5C)。内质网钙泵抑制剂治疗期间未观察到细胞损失(图5D)。结果表明，自主钙信号是滤过屏障形态成熟和足细胞足突形成所必需的。
足细胞中的钙信号与足突交错和细胞骨架重排的高度动态阶段有关，这些阶段被钙缺乏所阻断。在后期，当滤过屏障根据分子大小功能性地区分血液溶质时，钙瞬态(图1J)和活跃的细胞重排停止。在体内足细胞损伤后，足突收缩和消失，导致蛋白质渗漏到滤液或蛋白尿中。为了确定足细胞损伤是否与钙瞬态重新启动相关，我们用PAN处理了7dpf斑马鱼幼鱼，并测定了钙活性。PAN处理导致钙瞬态显著增加(图5E，补充视频9)，表明钙信号可能在细胞重排的动态状态中是必需的，无论是发育状态还是作为损伤反应的组成部分。
在这项研究中，我们报道钙信号是肾小球形态发生过程中足细胞发育的一个重要和进化保守特征。重要的是，我们发现这种活性是足细胞自主的，对足突的正常分化至关重要，并且在斑马鱼和人类类器官肾小球之间是保守的。基于这些发现，我们提出自主调节的PLCg/ ip3介导的钙从细胞内储存中释放触发导致足细胞足突分化和肾小球滤过屏障形成的必要过程。
我们的结论是，足细胞钙瞬态有助于足细胞足突的分化，这主要基于两个观察结果。钙信号活动在斑马鱼足细胞末梢分化之前达到峰值，在3.5-4.5 dpf之间建立了与交叉足突形成的时间联系。此外，在成熟足细胞中，只有在损伤后，当足突发生消退和重塑时，才能观察到钙瞬态，进一步表明这种活性是导致足突重组的信号通路的基础。重要的是，在足细胞终末分化过程中阻断钙的释放会损害足突的形成，导致一种被抹掉的、无序的细胞投射表型。足细胞钙瞬变不太可能促进中线细胞的迁移，因为这没有被SERCA抑制剂阻断(数据未显示)，也因为受伤的足细胞(主动发出钙信号)不会迁移。
人类类器官肾小球代表一个独特的三维模型的人肾小球与适当的基因和蛋白质表达。类器官肾小球内足细胞呈极化、狭缝隔膜和足突形成。他们对人类肾小球发育模型的准确性证明了他们能够复制几种遗传性先天性肾病综合征(包括NPHS1 (NPHS1突变)和nos1ap相关肾病综合征)中存在的肾小球缺陷，并反映肾毒性反应，包括PAN肾病和庆大霉素治疗。然而，就GBM成熟而言，这些器官肾小球显然仍然不成熟，大多数类器官肾小球缺乏肾小球毛细血管。来自斑马鱼的数据将预测后者不是裂隙隔膜形成的屏障，因此类器官肾小球被证明是研究人类肾小球成熟过程中钙在细胞骨架动力学中的作用的可靠模型。
TRP通道TRPC5和TRPC6已被确定为钙内流通路，介导足细胞钙离子传导和细胞骨架变化。尽管如此，我们发现细胞膜钙通道并不参与发育足细胞钙信号传导，这表明足细胞在分化早期依赖于不同的钙释放途径。细胞膜钙通道不参与早期钙信号的发现与大多数TRPC6功能获得性突变患者仅表现出晚发性FSGS的报道是一致的，早在肾脏发育完成后。此外，小鼠TRPC6敲除不会导致早期肾小球形态发生缺陷或尿白蛋白排泄/蛋白尿的改变。同样，在病理条件下，TRPC5的过表达或激活不会引起肾屏障损伤或加重足细胞损伤。这些结果表明，TRPC6和TRPC5在成人肾功能中起作用较晚，而在分化足细胞中不起作用。
斑马鱼和人肾类器官的足细胞钙瞬态是通过IP3受体从细胞内储存中释放出来的。这种类型的钙释放依赖于PLC的活性和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸生成IP3。也许令人惊讶的是，我们的斑马鱼敲除筛选显示PLCg1，而不是与fsgs相关的PLCe1，是涉及的关键PLC同型。PLCg广泛表达，并与细胞骨架重塑有关。小鼠PLCg1嵌合突变体表现出多囊肾发育不良伴硬化肾小球，与肾小球成熟或功能中的作用一致。PLCg1的另一个主要产物二酰基甘油激活蛋白激酶C，促进Nephrin从足细胞细胞膜上移除，提示裂隙膜蛋白的动态周转可能是足细胞足突形成的一个特征。据报道，肾素磷酸化可通过募集和激活PLCg触发钙信号。然而，我们的研究结果表明，体内足细胞钙活性并不需要Nephrin，这表明其他足细胞蛋白，例如酪氨酸激酶底物Neph蛋白，可能会弥补Nephrin的缺乏，正如它们在缺乏Nephrin基因的鸡中所做的那样。
在斑马鱼肾小球形态发生过程中，足细胞钙释放在离体足细胞组中是自主的，在体内不需要邻近内皮细胞或内胚层的信号。这一结论部分是基于斑马鱼突变体cloche的表型，其中神经元PAS结构域蛋白4样转录因子的突变阻止了所有内皮细胞和造血细胞谱系的分化。我们在SERCA抑制剂实验中观察到，cloche突变足细胞中钙信号的持续存在，以及足突形成对钙信号的需求，与cloche突变足细胞足突形成的EM结果一致，尽管完全缺乏内皮细胞。类似地，在人肾类器官中，尽管很少有内皮细胞存在，但几乎所有组织中MAFBmTagBFP2/+阳性足细胞簇都显示钙信号。虽然我们不能完全排除内皮细胞的存在，但大多数细胞浸润是无血管的，这支持斑马鱼中足细胞瞬时钙离子不需要内皮细胞的观察结果。然而，更广泛地说，斑马鱼肾小球的形态发生和哺乳动物肾小球滤过屏障的结构和选择性通透性的维持需要内皮细胞、系膜和足细胞信号的复杂相互作用。尽管如此，发育中的足细胞钙信号和足突的初始形成似乎是足细胞自主的。
当斑马鱼肾小球成熟时，钙信号被抑制，提示激活信号丢失或被肾小球成熟信号主动抑制。成熟肾小球中钙信号的停止对肾小球功能的稳定是必需的，这可以从TRPC6突变引起的FSGS的发生和受伤足细胞中短暂钙的重现中得到证明(图5E)。我们发现，与发育中的钙瞬变的启动相似，钙瞬变的停止独立于内皮细胞发生，这是因为5和6dpf时钟突变体在钙信号传导方面是沉默的，与相同年龄的野生型胚胎相似(数据未显示)。结合我们在体外维持的7dpf斑马鱼足细胞不显示钙瞬变的发现，这些数据表明钙信号的启动和停止可能由足细胞自主机制介导。进一步研究自主细胞信号系统，如Neph狭缝隔膜蛋白相互作用或自分泌信号，可能会揭示足细胞特异性的细胞内钙释放诱导剂。另外，足细胞可能通过钙诱导的钙释放完全自主地发出信号，就像在肾微血管中发生的那样。
足细胞损伤导致足突消退，涉及肌动蛋白细胞骨架的重排。与我们的结果一致，其他研究报道足细胞损伤后细胞内钙增加，这与钙在肌动蛋白细胞骨架重塑和足突消退中的作用一致。虽然短时间的钙瞬变可能不足以引起蛋白尿，但长期稳定足细胞细胞内钙，在肾病综合征的情况下，可能对防止进一步的肾小球损害至关重要。我们的研究建立了斑马鱼幼鱼和人肾类器官作为钙信号受损引起肾小球疾病的模型，并作为筛选肾小球疾病中调节足细胞形态发生的新物质的平台。
