【文献解读】金针菇多糖的结构解析及其降脂和免疫调节活性

影响因子：4.7

摘要

采用磁场辅助三相分配-凝胶渗透色谱法从金针菇子实体中分离纯化了一种新型杂多糖FVPT1。利用单糖组成、甲基化分析、红外光谱和核磁共振(NMR)对其结构进行了表征。FVPT1 (~1.64 × 10⁴ Da)由L-聚焦物、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖组成，摩尔比为1.0:3.5:1.0:1.4。通过甲基化分析和核磁共振谱分析确定了FVPT1的多糖重复单元。此外，斑马鱼幼鱼高脂血症模型试验表明，FVPT1具有明显的降脂作用。此外，FVPT1通过增加巨噬细胞中一氧化氮、白细胞介素(IL)-1β和IL-1的分泌，表现出显著的免疫调节活性。因此，这些结果表明FVPT1具有开发成为一种新的免疫或降血脂保健产品的潜力。

金针菇(Flammulina velutipes)，在食用菌的产量和消费量方面位居世界第四。金针菇富含碳水化合物、蛋白质和维生素，因此受到亚洲消费者的欢迎，尤其是中国和日本。从金针菇中分离得到的多糖、糖蛋白、酚类和倍半萜具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血脂、调节免疫等促进健康的作用。金针菇多糖作为金针菇最重要的活性成分之一，已被研究多年。不同方法提取的金针菇多糖具有显著的治疗效果和未被发现的毒性，引起了广泛的关注。许多研究表明，不同的提取方法会影响提取的产量、结构特征和生物活性。如Guo et al.所述，微波辅助提取多糖比热水和超声辅助提取具有更明显的抗氧化活性。另一项研究表明，微波提取冬虫夏草菌丝体多糖的产率和抗肿瘤活性最高，大分子多糖比例也最大。目前，金针菇多糖的提取方法有多种，主要包括热水微波辅助提取法、超声辅助提取法和酶辅助提取法，已被广泛应用于研究中。例如，Zhang et al.研究发现，金针菇多糖在45℃、620 W、20 min条件下的最大提取率达到8.33%。传统的提取方法虽然相对简单，但其处理耗时、分离纯化步骤复杂等缺点也不容忽视。三相分配法(TPP)作为一种新型的多糖提取方法，因其高效、半纯化的特点而得到越来越广泛的应用。

三相分配技术(TPP)是一种新型的、安全的、绿色的分离纯化蛋白质和油脂的方法，它包括用正丁醇和硫酸铵溶液依次盐析、等电点沉淀和溶剂沉淀，得到界面沉淀的上部有机相、中间蛋白相和下层水相。目前，TPP作为一种更高效、快速的提取技术，也被广泛应用于提取河蚬多糖、从海洋芽孢杆菌SJ3株分离的木聚糖酶和芦荟的多糖]。此外，被称为“绿色分离技术”的磁场增强萃取方法利用其磁场增强化学分离过程。它可以利用磁场产生的特殊能量，通过改变抗磁性物质的微观结构来改变其性质。在Palyska发表的一篇关于磁场辅助溶剂萃取的研究论文中，使用D-2EHPA (di-2-乙基己基磷酸)萃取Cu²⁺，萃取剂磁化后铜的分配比提高了160倍。另一篇文章发现，与传统的提取方法相比，在50Hz的频率下，可变磁场辅助提取技术可以从干红茶和绿茶中提取更多的矿物质成分、咖啡因和多酚。因此，本研究采用磁场辅助三相分配法分离金针菇多糖，以期获得更高产量和纯度的新型金针菇多糖。

本研究利用磁场辅助TPP和凝胶渗透层析法提取金针菇多糖FVPTI，并通过单糖组成和甲基化分析以及NMR分析了其结构。此外，还对FVPT1的降脂和免疫活性进行了讨论。本研究将为该多糖的大规模工业化生产以及用于医药、食品等行业的活性多糖材料提供理论依据。

新鲜金针菇子实体采自江苏中绿生物科技有限公司(宿迁)。标准单糖购自Sigma-Aldrich化学公司(St. Louis, MO, USA)。使用斑马鱼幼鱼AB株(南京YSY生物技术有限公司(中国南京))、蛋黄粉(山东西唐公司(中国济南))和细胞因子ELISA试剂盒(Becton, Dickinson and Company (New York, NY, USA))。

将金针菇子实体洗涤、干燥、粉碎，100目过筛。将金针菇粉末悬浮于500 mL 95%乙醇中，用SB25-12D超声仪(宁波科伦茨生物技术有限公司，中国宁波)以40 kHz频率提取3次，热水提取3次，每次提取2 h。室温下在水提液中加入一定量的固体硫酸铵(质量分数10-60%)和叔丁醇(5-30 mL)。将提取管置于磁场下，以100 rpm的转速搅拌30 min，然后以2500 rpm的转速搅拌5 min，形成三个清晰的相。对较低的水相进行透析、浓缩、干燥，得到纯化的提取金针菇多糖(图1)。

使用凝胶渗透色谱(GPC)(高分辨率Sephacryl S-300柱)(XK16 × 100 cm) (GE Healthcare (Cardiff, UK))进行进一步纯化，并且使用过滤的蒸馏水作为洗脱剂。使用折射率检测器(RID-10A, Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan))检测到两个峰，收集第一个峰并将其命名为FVPT1。

使用2 M TFA(三氟乙酸)在110℃下完全水解样品(2 mg) 4 h。配备CarboPac Dionex LC30™PA20色谱柱(3 mm × 150 mm) (Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA))的高效阴离子交换层析(HPAEC)，用2 mm NaOH和0.05-0.2 M NaAc (0.45 mL/min)洗脱，以单糖为标准，用脉冲安培检测器(Dionex)检测糖的组成。

采用配备折射率检测器(RI)的高效液相排阻色谱(HPSEC)和TSK PWXL 6000和3000凝胶过滤柱分析样品的纯度和相对分子质量，用PB缓冲液以0.5 mL/min洗脱;并在35℃下使用P5 (6200 Da)、P10 (10,000 Da)、P20 (21,700 Da)、P100 (113,000 Da)和P200 (200,000 Da)的普鲁兰标准进行校准。

将FVPT1与KBr粉末研磨，均匀混合后制成KBr片，用于在Perkin-Elmer 599B FTIR分光光度计(Waltham, MA, USA)中，在4000-400 cm^-1的波数区域，以4 cm^-1分辨率进行转换红外光谱分析，为32个样本扫描。

FVPT1 (2 mg)的甲基化分析根据之前的研究进行。然后，通过水解、氘化硼钠还原和乙酰化，将甲基化多糖转化为部分甲基化的乙酸醛糖醇(PMAAs)。采用DB-5 MS色谱柱(30 m × 0.25 mm, 0.25µm, 0.2 mm膜厚)的GC-MS (Thermo Finnigan TRACE 2000/MS) (Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA))进行糖苷连锁分析。以20℃/min将温度设定为180℃到270℃并且在270℃下保持25 min。利用2011年NIST GC-MS数据库中PMAA的质谱和相对保留时间对PMAA和碎片化模式进行鉴定。甲基化糖的百分比估计为峰面积的比值。

将FVPT1用D₂O溶解，在真空冷冻干燥器中冻干，以促进氘交换。将氘交换的FVPT1 (40 mg)溶解于0.5 mL 99.96% D2O中用于NMR。在27℃在Bruker Avance III 600 MHz NMR谱仪(Bruker Corporation (Billerica, MA, USA))上记录¹H，¹³C，核奥氏效应光谱(NOESY)，异核多量子相干(HMQC)和1H检测的异核多键相关(HMBC) NMR谱。以残余HDO为参照，δ 4.78 ppm(27℃)为内标。在外部校准的DSS (δ 0.00 ppm)中测定13C化学位移。采用1h-1h相关光谱(COSY)和HMQC对信号进行赋值。HMBC和NOESY用于分配残基间的链接和序列。

取对数生长期的RAW264.7小鼠巨噬细胞，用无色培养基DMEM稀释成2 × 105个/孔，每孔细胞数尽量相近。在培养箱中放置4 h后，向细胞中加入样品，显微镜下观察细胞的黏附情况，并丢弃上清液。将5 mg/mL金针菇多糖溶液用RPMI-1640稀释至100、200、500 μg/mL。然后，将96孔板加入每孔200 μL。阴性对照和阳性对照培养基分别含5% pbs和10 μg/mL lps，每组设6个重复。在5%二氧化碳恒温培养环境下孵育48 h后，取100 μL上清液，采用Griess实验检测NO水平，如前所述。

ELISA试剂盒检测巨噬细胞释放的IL-1和IL-1β。将巨噬细胞悬液稀释至2×106个/mL，用每孔浓度为200 μg/mL的FVPT1溶液培养于96孔板中。以含0.5% PBS和10 μg/mL LPS的RPMI-1640培养基分别作为阴性对照组和阳性对照组，设置3个重复。分别于37℃、5% CO2条件下培养4、8、10 d，参照试剂盒说明书操作步骤，采用ELISA法测定上清液中IL-1和IL-1β的含量。

FVPT1的降脂活性

AB株斑马鱼胚胎取自南京YSY生物技术有限公司(中国南京)，在含氧的清洁鱼水中28℃孵育48 h。以卵黄粉作为高胆固醇饲料(HCD)连续6 d喂养斑马鱼幼鱼，建立高脂血症模型。将斑马鱼幼鱼按每组10条斑马鱼的密度分为对照组、高胆固醇组和样本组(FVPT1浓度分别为100、200和400 μg/mL)，置于每孔含2 mL鱼水的12孔板中处理。高胆固醇组使用蛋黄粉作为斑马鱼幼鱼的HCD饲料，终浓度为0.1%，而对照组不喂养。从高胆固醇蛋黄饲料喂养斑马鱼幼鱼12 h开始，斑马鱼幼鱼体内的脂质开始迅速积累。蛋黄粉浸泡斑马鱼幼鱼48 h可诱导幼鱼体内大量脂质蓄积，建立高脂血症模型。高胆固醇多糖组在鱼水中加入多糖和蛋黄粉，浸泡斑马鱼幼鱼48 h，采用油红染色观察幼鱼体内脂质蓄积情况。

根据说明书配置油红o染料溶液并且用定性滤纸缓慢过滤。将斑马鱼幼鱼用4%的聚甲醛固定1 h，用PBS洗涤2 ~ 3次，然后用25%、50%、75%、100%梯度的甲醇溶剂脱水。油红o染色2 h后，分别用100%、75%、50%、25%梯度甲醇溶剂梯度洗脱，PBS洗涤。最后用荧光显微镜观察并拍照。

经油红o染色后，在斑马鱼幼鱼的血管和胃中可以清晰地观察到脂质沉积。采用Image-Pro Plus (IPP) 6.0分析软件测定斑马鱼体内染色脂质的积分光密度(IOD)值，定量评估体内脂质蓄积水平，进而分析多糖样品对幼鱼脂质蓄积的抑制活性。体内脂质标准化蓄积程度(%)=(碘多糖组−碘控制组)/(碘高脂血症组−碘控制组)。

所有实验均重复3次，数据以均数±标准差(SDs)表示。组间比较采用单因素方差分析和LSD检验。对所有变量进行Levene′s正态性检验和齐次方差分析。必要时进行Tamhane 's T2检验。P < 0.05和P < 0.01分别为显著和非常显著。

结果

磁场辅助三相分配法获得金针菇多糖的得率、多糖含量和蛋白质含量分别为2.3%、55.53%和12.19%。凝胶渗透层析纯化后获得的FVPT1多糖含量达90.1%，水分含量为2.91%。

FVPT1的总多糖含量为90.1%，总蛋白含量为5.20%。在HPSEC图谱中，一个对称的单峰(图2a)表明FVPT1是一种均质多糖，约1.64 × 104 Da，半乳糖(Gal)，甘露糖(Man)，焦点(Fuc)和葡萄糖(Glc)的摩尔比为3.5:1.4:1:1。在之前的研究中，利用传统的提取、分离和纯化方法从金针菇中获得了FVPA1、FVPA2和FVPB2。3种多糖的分子量不同，且不含蛋白质。FVPA2的单糖成分中不含葡萄糖。

图2b显示FVPT1在3416、1651和1453 cm^-1处有三个主要吸收峰。3416 cm ^-1峰表明多糖的羟基伸缩振动。1615 cm^-1处的强吸收峰和1453 cm^-1处的弱吸收峰说明了多糖的特性。由于1730 cm^-1处无峰，因此不存在糖醛酸。

在表1和图2c、d中，GC-MS数据表明FVPT1末端具有支链结构，包括甘露吡喃糖残基和葡萄糖吡喃糖残基，包含1,2-二取代焦点、1,4,6-三取代半乳糖、1,3,6-三取代半乳糖、1,2-二取代焦点、1,4-二取代半乳糖和1,3-二取代葡萄糖的主链结构，还有在另一个终端的焦点残留。

由图3可知，FVPT1的多糖结构包括6个糖残基，分别位于δ 5.26(单峰)、δ 5.12(单峰)、δ 5.07(单峰)、δ 5.03(单峰)、5.01(单峰)和δ 4.55(双峰，J_H-1，H-2 = 6 Hz)，分别对应于δ 101.55、105.29、100.73、100.81、104.20和105.87处的信号，命名为A-F。在1.24 (J_H-5，H-6= 6.42 Hz)处出现Fuc ¹H信号的CH₃-C基团，对应于Fuc δ 18.81处C-6的信号。

根据FVPT1结构中6个糖残基的化学位移和异位构型，通过核磁共振来确定单糖残基A-F的归属。

表2显示了三种具有半乳糖构型的糖残基的自旋系统，A, B和D，使用H-1/H-2到H-4和H-6/H-5, H-4相关性在¹H-¹H COSY和TOCSY光谱中发现。C-4的前场位移(δ 79.33)表明A为1,4-α-D-Galp。C-4 (δ 84.70)和C-6 (δ 67.48)表明残基B为1,4,6-α-D-Galp。C-3 (δ 78.49)和C-6 (δ 69.32)表明残基D为(1,3,6)-α-D-Galp。

残基C在1.24 (1H NMR)和δ 18.81 (1C NMR)处有特殊信号，表明其J_H-1，H-2值和GC-MS数据均较小，且与δ 5.07具有α-焦点残基醚。C-2 (δ 87.43)碳信号与标准值比较，表明残基C为1,2 -α-L-Fucp。

经J_H-1，H-2和J_H-2，H-3的小值，J_H-4，H-5的大值和J_H-1，H-2的小值鉴定，残留物E为D-甘露糖基。J_{C-1, H-1}= 170 Hz表明HMBC中存在α-甘露糖构型。除C-1 (δ 104.20)外，在δ 76-88范围内没有明显的碳信号，表明E为末端α-D-甘露吡喃糖。

δ 4.55处出现异位信号，J_H-1，H-2值较大，表明F为β连接残基。从COSY和HMQC光谱确定了H-2到H-6的质子化学位移。J_H-2，H-3和J_H-3，H-4 (9 Hz)的较大值以及NOESY光谱中典型的H-1、H-2和H-4内相关关系表明残留物F为D-葡萄糖吡喃糖[8]。C-3 (δ 81.66)碳表明F为1,3 -link β-D Glcp。

从NOESY研究中确定了糖基残基的序列，然后用HMBC实验进行了确认(表3和表4)。根据上述数据，多糖FVPT1有以下重复单元(图4):

NO作为免疫系统中关键的信号分子和重要的转导因子，由于其与RNI代谢物性质相对稳定，可以在样本RNI水平中评估其含量。如图5所示，与阴性对照组相比，在50~500 μg/mL的浓度下，FVPT1可以剂量依赖性地刺激NO水平。此外，500 μg/mL FVPT1具有明显的NO生成激活能力。 

活化的巨噬细胞不仅能产生炎症介质，还能分泌IL-1、IL-1β等细胞因子，调节局部微环境，抵抗不利因素的侵袭。ELISA试剂盒检测FVPT1促进巨噬细胞产生上述4种细胞因子的效果，结果显示FVPT1共培养可刺激巨噬细胞分泌IL-1β和IL-1细胞因子。500 μg/mL的FVPT1可以显著促进IL-1β和IL-1细胞因子的水平(图6)。结果显示，FVPT1可以激活巨噬细胞并大量分泌IL-1和IL-1β细胞因子。在之前的研究中，利用传统的提取、分离和纯化方法从金针菇中获得了FVPA1、FVPA2和FVPB2。与FVPT1的体外免疫效应相似，FVPA1可刺激Raw264.7巨噬细胞分泌NO。然而，FVPA2和FVPB2在体外作用于B细胞或NK细胞，而不是巨噬细胞。 

近年来，斑马鱼常被用作阐明药理作用机制的模型。既往研究表明，从双孢蘑菇和刺芹菇中分离的多糖在斑马鱼模型中具有显著的降血脂活性。显然，FVPT1在我们的高脂血症模型中降低了斑马鱼幼鱼的脂质含量。100、200、400 μg/mL FVPT1将斑马鱼的脂质含量分别降低到53.89%、73.76%、83.89%，而以蛋黄粉作为高胆固醇饲料喂养的模型组的脂质含量为100%(图7)。体内实验结果表明，FVPT1对脂质积累具有良好的抑制作用。