Chestnut Studying
摘要
CD8+ T cells control tumors but inevitably become dysfunctional in the tumor microenvironment. Here, we show that sodium chloride (NaCl) counteracts T cell dysfunction to promote cancer regression. NaCl supplementation during CD8+ T cell culture induced effector differentiation, IFN-γ production and cytotoxicity while maintaining the gene networks responsible for stem-like plasticity. Accordingly, adoptive transfer of tumor-specific T cells resulted in superior anti-tumor immunity in a humanized mouse model. In mice, a high-salt diet reduced the growth of experimental tumors in a CD8+ T cell-dependent manner by inhibiting terminal differentiation and enhancing the effector potency of CD8+ T cells. Mechanistically, NaCl enhanced glutamine consumption, which was critical for transcriptional, epigenetic and functional reprogramming. In humans, CD8+ T cells undergoing antigen recognition in tumors and predicting favorable responses to checkpoint blockade immunotherapy resembled those induced by NaCl. Thus, NaCl metabolism is a regulator of CD8+ T cell effector function, with potential implications for cancer immunotherapy.
CD8+ T细胞可控制肿瘤,但在肿瘤微环境中不可避免地会功能失调。在此,我们证明氯化钠(NaCl)可抵消T细胞功能障碍,促进癌症消退。在CD8+ T细胞培养期间补充氯化钠可诱导效应细胞分化、干扰素-γ的产生和细胞毒性,同时维持负责干细胞样可塑性的基因网络。因此,在人类化小鼠模型中,肿瘤特异性T细胞的移植可产生卓越的抗肿瘤免疫。在小鼠身上,高盐饮食通过抑制CD8+ T细胞的终端分化并增强其效应能力,抑制了实验性肿瘤的生长,这种抑制作用依赖于CD8+ T细胞。从机制上讲,NaCl可增强谷氨酰胺的消耗,而谷氨酰胺的消耗对于转录、表观遗传和功能重编程至关重要。在人体中,CD8+ T细胞在肿瘤中识别抗原并预测对检查点阻断免疫疗法的良好反应,与NaCl诱导的反应类似。因此,NaCl代谢是CD8+ T细胞效应功能的调节剂,对癌症免疫治疗具有潜在意义。
实验结果1
高盐可促进人体CD8+ T细胞效应子分化
作者首先研究了高盐处理对体外CD8+幼稚T细胞分化及功能的影响。由于接触白介素-2(IL-2)等效应细胞因子有限,肿瘤中的CD8+ T细胞激活功能受损。为了模拟这种情况,作者用抗CD3/CD28和次优浓度的IL-2(1 ng·ml-1,而不是之前研究中用于产生完全效应T细胞的10 ng·ml-1)激活细胞5天,并加入过量的NaCl(图1a)。最多可添加80mM的NaCl来调节与T细胞分化相关的标记物,而不会严重影响其活性。尿素和甘露醇的渗透压与80mM NaCl相同,对激活相关标记物的表达影响不大,因此排除了渗透压的主要影响,正如之前其他研究中提出的。因此,尿素仅用于初始实验,随后被移除。作者观察到,与尿素处理过的细胞相比,NaCl可增加颗粒酶B(GZMB)和TIM3的表达以及CCR7-CD45RO+细胞的频率,从而揭示了激活效应记忆T细胞的诱导(图1b、c)。接下来,作者使用高维流式细胞术将分析扩展到效应功能、激活或衰竭、记忆等标记,发现NaCl处理过的细胞与尿素处理过的细胞截然不同(图1d,左)。使用PhenoGraph算法进行聚类分析发现,前者主要由1(C1)和4(C4)簇组成(图1d,右),识别出分别表达T-bet和PD-1的CD27效应记忆T细胞,以及表达GZMB的CD27效应记忆T细胞(图1d,e)。这些簇表达记忆标记物CD127和转录因子LEF1,两者对于CD8+ T细胞的长期持久性都很重要。根据这些数据,作者通过RNA测序(RNA-seq)观察到,与尿素处理相比,NaCl诱导了整个转录组水平的变化,揭示了效应或细胞毒性相关转录物的上调,如IFNG、 TNF、GZMB和TBX21(编码T-bet)以及干细胞相关转录物,如FOXO1、RUNX1、SATB1和ID3(图1f)。同时,作者观察到T细胞代谢重编程的主调控因子MYC、与糖酵解相关的转录因子PKM和LDHA以及质膜谷氨酰胺转运体SLC1A5和SLC7A5的诱导,这表明NaCl可以重塑代谢。接下来，作者研究了NaCl对激活的CD8+ T细胞功能的影响。为此,作者在为期5天的培养结束时用12-肉豆蔻酸-13-乙酸-12-磷酰基-5-胆碱(PMA)和离子霉素刺激T细胞,并观察到与尿素处理过的细胞相比,NaCl处理过的细胞产生更多的干扰素-γ(IFNγ)和脱颗粒标记物CD107a(图1g、h)。根据体外细胞毒性测定,NaCl处理过的细胞比IL-2(对照)处理过的细胞更有效地杀死了624.38个黑色素瘤细胞,在所有受试的效应细胞与靶细胞比率下都是如此(图1i)。与对照细胞相比,这些细胞在用固定抗CD3和可溶性抗CD28进行再刺激后,磷酸化ERK显著上调,pS6也有上调趋势,表明T细胞受体(TCR)信号增强。有趣的是,在单独存在IL-2的情况下添加NaCl并不影响激活、效应和记忆标记的表达这表明NaCl必须与TCR刺激结合才能重新编程T细胞。此前的研究表明,NaCl通过SGK1影响CD4+ T细胞的分化。为了测试同样的机制是否适用于CD8+ T细胞,作者在SGK1特异性抑制剂GSK 650394(SGK1i)的作用下激活了这些细胞。作者发现,SGK1i部分抑制了NaCl诱导的GZMB和T-bet上调,但对PD-1和TIM3上调或CD27下调没有影响。对照细胞对SGK1i不敏感。总体而言,这些数据表明,体外TCR刺激后过量的NaCl通过转录重编程促进强效人CD8+ T细胞效应子分化,并增强TCR信号,而不会影响干细胞样T细胞转录物的表达。
实验结果2
HSD促进CD8+ T细胞依赖性肿瘤控制
接下来,作者研究了过量的氯化钠是否能够促进CD8+ T细胞在体内对抗肿瘤的功能。作者采用了一种既定的方案,即在皮下注射MC38结肠腺癌细胞前两周通过饮食补充NaCl(食物中4%,水中1%),并维持自由采食(图2a)。这种高盐饮食(HSD)已被证明会导致NaCl在肿瘤中积聚,而在其他器官中则较少,且不会影响小鼠的整体健康状况。与先前的结果一致,与正常盐饮食(NSD)相比,HSD显著抑制了MC38肿瘤的生长。在抗CD8单克隆抗体有效耗竭小鼠CD8+ T细胞后,这种肿瘤控制作用完全丧失,这表明CD8+ T细胞在肿瘤排斥中起核心作用(图2a、b)。HSD导致CD8+和CD4+ T细胞在肿瘤中的浸润增加约两倍,但在脾脏中却没有增加且CD8+ T细胞的整体频率没有改变,具有CD44loCD62hi中央记忆或CD44loCD62lo效应记忆表型。值得注意的是,HSD对肿瘤内CD4+FOXP3+调节性T细胞的频率没有影响。作者还观察到肿瘤内自然杀伤细胞数量略有增加,这与之前的一项研究一致。为了更好地了解饮食在肿瘤排斥过程中如何调节免疫系统,作者对接受NSD或HSD的小鼠(每组2只)分离出的CD45+细胞进行了单细胞RNA-seq(scRNA-seq)。聚类分析发现CD8+ T细胞(C4)、自然杀伤细胞(C3)和CD4+ T细胞(C7)的频率增加(图2c、d)。两组小鼠的其他先天免疫细胞群(包括巨噬细胞的C1)没有出现一致的变化(图2d)。作者重点关注CD8+ T细胞的C4,观察到与最终分化与衰竭相关的转录物(如Prdm1、Eomes31、Maf32、Hspa1a33和Gzmk31)减少,而编码细胞毒性分子(Gzmf、Gzme、Gzmd、Prf1)或与激活(Tnfrsf9、Nfkb1)和效应器分化(Irf8、Csf1、Id2)相关的转录物增加(图2e)。HSD并未降低调节性T细胞相关转录物的表达,总体而言,这表明该模型中的肿瘤排斥并非由NaCl破坏调节性T细胞稳态所致,这与之前的假设不同。通过基因集富集分析,作者发现,从喂食HSD的小鼠中分离出的CD8+ T细胞中富含与代谢重塑、增殖和激活相关的通路,而喂食NSD的小鼠中分离出的CD8+ T细胞中富含与1型干扰素信号传导(支持急性感染中CD8+ T细胞的效应功能,但也导致慢性病毒感染和癌症中衰竭CD8+ T细胞的 衰竭的CD8+ T细胞在慢性病毒感染和癌症中的最终分化)、衰老、IL-10信号传导和DNA损伤(图2f),表明过量的NaCl可促进免疫激活,同时抵消免疫抑制。接下来,作者应用了单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)算法,这是一种通过研究scRNA-seq数据中差异表达基因启动子富集的共识主题来识别转录因子活性的计算算法。根据基因表达数据,SCENIC识别出HSD后转录因子网络的主要变化,预测参与终末分化或衰竭的转录因子(Prdm1、Eomes、Nfatc2、Fli1)和1型IFN信号传导的活性降低 (Irf1、Stat1、Irf7)和参与效应分化(Tbx21、Stat4、Irf8、Id2)、细胞毒性(Runx3)和炎症信号传导(Nfkb2、Rela、Relb)的转录因子的活性增加(图2g)。值得注意的是,与干细胞样CD8+ T细胞长期存活相关的转录因子活性(Foxo1、Myb40)在HSD的作用下有所增加,这与图1中的数据一致,该图显示NaCl可促进效应功能,而不会影响干细胞样转录。对CD8+ T细胞亚群的分析(通过scRNA-seq)进一步揭示了HSD后Gzmkhigh TRM样细胞的减少和Cx3cr1high效应器样衰竭细胞的扩张,这些细胞过度表达Gzmb和Ifng(图2h-j。奇怪的是,后者还表达高水平与激活或衰竭相关的转录物Tox、Ctla4、Pdcd1和Havcr2以及与记忆相关的转录物Il7r和Ccr7(图2j),从而表明获得了与肿瘤排斥相关的混合转录状态。
实验结果3
HSD诱导的CD8+ T细胞与抗PD-1诱导的类似
接下来,作者想要研究HSD在体内诱导的细胞状态是否与CD8+ T细胞在肿瘤抗原识别和免疫治疗反应后的状态相似。为此,作者使用HSD处理的小鼠CD8+ T细胞的转录特征,并筛选出人类同源基因(称为HSD CD8),用于挖掘从口腔鳞状细胞癌中分离的人类CD8+ T细胞的scRNA-seq数据。在肿瘤中,该特征与增殖性MKI67high细胞高度重叠,但与ITGAEhigh(编码CD103)组织驻留记忆细胞或作者先前鉴定的其他scRNA-seq簇重叠较少(图3a)。为了在蛋白质水平上证实这些数据,作者重新分析了之前非小细胞肺癌患者队列,这些患者的肿瘤浸润性CD8+ T细胞通过高维流式细胞术进行了研究。在这些样本中,Ki-67蛋白表达主要局限于CD39+细胞(图3b),这是真正的肿瘤反应性细胞的标志物。与Ki-67-细胞相比,Ki-67+细胞表现出更强的激活性,包括HLA-DR激活标志物、IRF4和T-bet转录因子以及GZMB的表达增加(图3c),表明正在进行抗原识别。同样,作者发现,在口腔鳞状细胞癌患者接受免疫检查点阻断(ICB)免疫治疗后,血液中诱导的CD8+ MKI67高表达细胞中HSD CD8标志物显著富集(图3d)。MKI67高表达CD8+ T细胞也表达比其它亚群更高的Na+-依赖性谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5(图3e),表明这些细胞同时使用NaCl和谷氨酰胺(见下一节)。重要的是,对HSD CD8在转录组数据中的特征进行过度表达分析后,可以区分出ICB反应者和非反应者的CD8+ T细胞,分别来自两组不同的黑色素瘤和非小细胞肺癌患者(图3f)。最后,在后续研究中,作者以连续变量形式测量了173名参与我院候选免疫调节药物早期临床试验的实体瘤患者血浆中Na+水平的增加与无进展生存期延长相关(log-rank检验,危险比,0.92;置信区间,0.85-0.99;P=0.04;补充表6)。总体而言,这些数据表明,CD8+ T细胞对NaCl的消耗增加,可增强人体对癌症免疫疗法的反应。
实验结果4
NaCl对CD8+ T细胞的重编程依赖于谷氨酰胺
作者的转录组分析确定了在体外添加NaCl后诱导的代谢基因和营养转运蛋白,表明代谢重新连接。为了获得这方面的更多见解,作者对喂食HSD或NSD的小鼠的肿瘤浸润CD8+ T细胞进行了非靶向代谢组学分析,如图2a所示(样品一式三份)。高糖饮食影响了几种代谢途径(图4a)和代谢产物(图4b),但最显著的变化出现在氨基酸代谢水平,包括精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺等(图4a)。在用80mM过量NaCl或对照培养基培养的人CD8+ T细胞(n=3)中,也发现了类似的富集途径和差异代谢物(图4c)。作者重点关注谷氨酰胺,它是活化T细胞的核心营养素,因为它参与核苷酸和谷胱甘肽的生物合成,并为α-酮戊二酸(αKG)提供来源,α-酮戊二酸是克雷布斯循环的中间产物和表观遗传重塑的辅助因子。在T细胞激活过程中,培养基中谷氨酰胺的浓度限制对细胞活力影响不大,但会广泛影响NaCl诱导的转录重编程(图4d)。对NaCl处理过的细胞进行配对比较后发现,缺乏谷氨酰胺会阻止多种效应分子和激活相关转录因子的上调,例如GZMB、HAVCR2(编码TIM3)、IFNG、IL2、TNF和LDHA等。相反,谷氨酰胺缺乏对Ctrl细胞激活的影响要小得多(图4d)。流式细胞仪验证显示,当谷氨酰胺供应逐渐减少或完全移除(图4e、f)时,NaCl处理的人CD8+ T细胞无法上调效应分子GZMB和激活标记TIM3。接下来,作者旨在确定NaCl和谷氨酰胺调控的转录程序。在NaCl处理中,去除谷氨酰胺后,差异表达基因的数量从6768个减少到2722个。通过重叠上调基因列表,作者发现NaCl和谷氨酰胺均诱导了细胞因子、活化分子和细胞毒性分子编码转录物的表达,包括IFNG、IL2、CSF2、CD40LG、CD70、TNFSF9、 GZMB、IL23R和GZMH等,以及与T细胞活化和效应细胞分化相关的转录特征。谷氨酰胺单独优先诱导代谢转录物(PDK1、PGK1、ENO2、GAPDH、ENO1、IDH2)以及与糖酵解和葡萄糖代谢相关的代谢特征,而NaCl单独诱导与效应子分化和炎症相关的额外转录物(TBX21、PRDM1、PDCD1 、LAG3、IRF8、FASLG、CXCL10、CCL3、CCL4)、与谷氨酰胺代谢和转运相关的转录(GLS、SLC1A5、SLC7A5)以及与细胞周期检查点、双链断裂、DNA修复和细胞凋亡相关的转录特征(扩展数据图5c、d)。综合来看,作者得出结论,NaCl介导的重新编程很大程度上取决于环境中的谷氨酰胺供应量。
实验结果5
氯化钠可增强谷氨酰胺依赖性表观遗传重塑
作者之前观察到,在用NaCl处理过的CD8+ T细胞中,SLC1A5 mRNA的表达上调,这表明这种Na+-依赖性谷氨酰胺转运蛋白在细胞重编程中起着积极作用。事实上,用SLC1A5特异性抑制剂V-9302孵育可阻断NaCl诱导的GZMB上调,但对对照组CD8+ T细胞没有影响(图5a、b)。为了更好地了解谷氨酰胺进入细胞后的命运(图5c),在谷氨酰胺存在的情况下,用NaCl或Ctrl处理5天的活化CD8+ T细胞在培养基中切换到含有均匀标记的13C谷氨酰胺的新培养基中,并在15分钟和60分钟后收集,用于液相色谱-质谱(LC-MS)分析。作者证实,与对照组相比,NaCl处理组CD8+ T细胞中谷氨酰胺总量增加,这与之前的分析结果一致(图4b),并进一步发现谷氨酸和谷胱甘肽总量增加,α-酮戊二酸和草酰乙酸水平下降(图5c)。通过关注13C的掺入,作者发现与对照细胞相比,NaCl处理过的细胞中包括αKG和草酰乙酸在内的几种代谢物的标记加载速度更快(图5d),这表明在克雷布斯循环中,谷氨酰胺的利用更优先,但αKG和草酰乙酸的消耗也更迅速(谷氨酰胺再循环)。为了进一步测试αKG在NaCl介导的效应功能诱导中的直接参与,作者向CD8+ T细胞补充了二甲基-αKG(一种能够穿过细胞膜的αKG类似物),发现它能够将谷氨酰胺缺乏的CD8+ T细胞中的GZMB上调恢复到与谷氨酰胺充足的CD8+ T细胞相似的水平(图5e)。值得注意的是,二甲基亚羟基谷氨酸对在无氯化钠(对照组)条件下激活的细胞没有影响,这表明氯化钠在T细胞重编程中特别依赖于谷氨酰胺转化为α-酮戊二酸。α-酮戊二酸也是参与表观遗传重塑的酶的辅助因子。特别是,它激活了十-十一转位酶和JMJD3酶,分别对表观遗传抑制标记5-甲基胞嘧啶(5mC)和组蛋白3赖氨酸27(H3K27me3)进行脱甲基化。在6名供体中,有5名供体的CD8+ T细胞在NaCl培养时比对照组(Ctrl)显示出更高水平的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),即5mC的氧化产物(图5f、g),表明十-十一转位活性增强。同样,作者发现,与对照组相比,先前用NaCl激活的CD8+ T细胞中H3K27me3的总体水平降低(图5g)。重要的是,JMJD3特异性抑制剂GSK-J4可阻止NaCl诱导的GZMB上调,但对对照细胞没有影响(图5h、i),从而揭示了表观遗传修饰在NaCl诱导的重编程中的机制作用。接下来,作者使用转座酶可访问染色质测序(ATAC-seq)方法,这是一种快速且通用的方法,用于研究染色质可访问性,并间接研究全基因组的表观遗传修饰。对差异可访问区域的全局分析显示,与对照组相比,NaCl的孵育显著改变了激活的CD8+ T细胞的访问情况(图5j)。作者发现,效应相关基因IFNG和GZMB的基因体以及上游和下游非编码基因组区域的染色质可访问性增加(图5k),作者的研究结果显示,NaCl在mRNA和蛋白质水平上诱导了这种变化。与作者的转录组学和功能实验结果一致,谷氨酰胺的缺乏几乎完全阻止了染色质的重组(图5j)。值得注意的是,在NaCl的作用下,作者几乎没有看到与记忆相关的干细胞基因LEF1(其表达不受NaCl的影响)和CCR7(其表达被NaCl下调)的基因位点发生改变(图5k和1e)。最后,根据启动子中可变可及区域的生物信息学分析,确定了可变可及的转录因子结合主题,其中与T细胞活化和效应子分化相关的转录因子主题,包括AP-1、AP-1家族成员FOS、JUNB和FRA1(也称为FOSL1)以及AP-1转录伴侣BATF56在NaCl对照组CD8+ T细胞中富集(图5l)。总之,NaCl通过谷氨酰胺分解代谢和效应相关基因的表观遗传重编程来促进效应功能。
实验结果6
NaCl在CD8+ T细胞移植后增强其功能
体外获得完全效应功能已被证明会损害体内CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫,这是由于转移细胞的末端分化与衰竭。因此,作者测试了NaCl处理对体外获得衰竭特征的影响,以及体内采用移植模型的长期抗肿瘤功能。为此,将用NaCl处理5天的人CD8+ T细胞洗涤,并在仅含IL-2的培养基中静置7天(图6a)。作者观察到,通过流式细胞术测量,在第5天存在于几乎所有细胞中的抑制性受体PD-1和TIM3在第12天的大部分细胞中消失(图6b、c),表明仅短暂上调。此外,这些细胞重新获得了干细胞样记忆标记物CCR7和CD27的表达,这与作者的ATAC-seq数据一致,表明NaCl并未对编码这些分子的基因的染色质可及性产生实质性影响。值得注意的是,作者还观察到持续性变化,在第12天,与对照组相比,静止的人CD8+ T细胞在PMA和离子霉素再刺激后仍能分泌更多的IFN-γ(图6d、e)。为了测试NaCl促进的效应功能增强是否能够转化为增强的抗肿瘤免疫,在将人MART-1特异性CD8+ T细胞与同源肽在体外扩增之前,用对照培养基或60mM NaCl处理5天,然后将其转移至携带人类黑色素瘤的NSG小鼠体内。与未经处理的细胞相比,用NaCl处理人CD8+ T细胞能够更好地控制肿瘤生长(图6f)。总的来说,作者的结论是,在体外用过量NaCl进行短脉冲处理能够重新编程CD8+ T细胞的功能,使其发挥更强大的效应功能,长期控制肿瘤。
