影响因子：8.1
鱼类与人类具有共同的神经递质通路，表现出显著的保守性和同源性。因此，暴露于氟西汀使鱼类可能易受生化和生理变化的影响，这与在人类身上观察到的情况类似。多年来，多项研究证实了氟西汀对不同鱼类和不同水平生物组织的潜在影响。然而，亲代暴露于未暴露的后代的影响仍在很大程度上未知。以斑马鱼为模式生物，评估亲代暴露于相关浓度(100和1000 ng/L)的氟西汀15天对后代的影响。亲代暴露导致子代早孵化，游泳囊不膨胀，畸形频率增加，心率和血流量降低，生长发育减慢。此外，还发现了显著的行为损伤(早期阶段的惊吓反应减少、基础运动活动和非联想学习改变，后期阶段的负向地趋和暗趋、趋触减少和反社会行为)。这些行为改变与焦虑降低、单胺能基因slc6a4a (sert)、slc6a3 (dat)、slc18a2 (vmat2)、mao、tph1a和th2表达显著增加以及单胺能神经递质水平改变一致。行为、单胺能基因表达和神经递质水平的改变持续至子代成年。鉴于鱼类和人类之间的神经元通路高度保守，数据显示了药物暴露产生潜在跨代和多代效应的可能性。这些结果强调了在现实情况下对鱼类进行跨代和多代研究的必要性，从而为了解这些药物的影响提供现实的见解。
由于药品生产和消费造成的日益严重的水生污染一直是一个环境问题，因为这些生态系统接收含有这些化学物质和/或其代谢物的废水，具有未知的生态影响。选择性血清素再摄取抑制剂(SSRIs)是处方和消耗最多的抗抑郁药物，作为新兴的环境污染物而日益受到关注。这些抗抑郁药用于治疗抑郁症和其他精神疾病，通过阻断突触前神经元中的5-羟色胺再摄取转运体，导致中枢神经系统(CNS)中的5-羟色胺水平(5-羟色胺或5-HT)的细胞外增加。氟西汀是地表水中最常检测到的SSRIs之一，估计浓度范围为0.012 - 1.4 μg/L。此外，氟西汀还能影响生物体中枢神经系统中单胺能系统神经递质的合成、再摄取和代谢。
单胺能系统在包括鱼类在内的大多数脊椎动物中进化保守，在大脑发育中发挥重要作用，参与细胞增殖、迁移、分化、突触发生和神经发生等不同的生理过程。在硬骨鱼中，很少有研究了解在一代人中暴露于氟西汀是否会对后代的健康和行为产生影响。一些研究结果提示，其他污染物对鱼类和其他动物物种(如大型水蚤)的行为、神经发育和生殖结局有潜在的跨代和多代影响。与未暴露于卡马西平的斑马鱼相比，暴露于卡马西平(10 μg/L) 6周的斑马鱼在成年期的11-酮睾酮水平、生殖性能、求偶行为、攻击性和精子形态均发生了改变，成年斑马鱼暴露于10 μg/L的卡马西平和吉非罗齐6周后，其繁殖成功率和繁殖力降低，在清洁水中饲养的F1代后代的求偶行为、形态和精子速度发生改变。亲代砷暴露改变斑马鱼的运动活动，增加焦虑行为，直至F2代，并诱导表观遗传改变。Hao等报道，暴露于1和100 μg/L双酚S的斑马鱼，从3 hpf到120 dpf, F1睾丸DNA甲基化和F2卵巢DNA甲基化增加，导致类固醇生成酶表达降低，血浆17β-雌二醇升高，睾酮水平降低。Minguez等人研究了舍曲林和文拉法辛(0.3、30和100 μg/L)对magna Daphnia的跨代效应，结果表明舍曲林暴露增加了F0 Daphnia的繁殖力并减少了后代F1的数量，而文拉法辛暴露降低了后代F0的数量并提高了F1代对药物的耐受性。
多项研究表明，氟西汀可在水生生态系统中产生生物蓄积，并可引起多种影响，影响多种生物的基因表达、生化和代谢参数、组织学、生殖和行为。然而，目前关于SSRI的跨代效应的研究仍然很少。据我们所知，只有5项研究探讨了氟西汀在鱼类中的亲代和跨代效应。这些研究主要关注子代的行为变化，忽视了远期后果。因此，有必要在更广泛的终点范围内探索长期效应。
目前的研究评估了成年斑马鱼暴露于相关浓度的氟西汀15天是否会影响后代的健康。研究亲代暴露对子代胚胎发育、行为(受精后8天)、遗传和神经化学特征的影响，以及对子代行为(1、2和3个月)、成年期基因表达和神经递质特征的持续影响(8个月比3个月)。
材料与方法
成年野生型斑马鱼(AB株，3.1-3.5 cm)来自CID-CSIC斑马鱼设施的Pisciber BSF (Terrassa, Barcelona)。所有程序均获得了机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees)的批准，并在获得当地政府许可(协议编号9027)的情况下按照机构指南实施。
盐酸氟西汀(CAS编号:56296-78-7，分子量345.79 g/mol，纯度:>98%)购自荷兰ChemCruz公司。测试溶液(100和1000 ng/L盐酸氟西汀)是在实验当天从4 μg/L的原液新鲜制备的鱼水。从CID-CSIC设施中随机选取成年斑马鱼(18雌:15雄)，在半静态测试条件下分别暴露于100和1000 ng/L盐酸氟西汀15天，温度为28.5℃，光周期为12L:12D。测试的浓度范围覆盖了地表水中记录的自然浓度，而采用的暴露时间是基于以下事实:SSRI的抗焦虑效应在暴露两周后显现(Martin et al.， 2017)。对照鱼在相同条件下维持在鱼系水中。每种处理进行3次实验，在每个含1.5 L水的玻璃容器中，雄性和雌性分别在不同的容器中(5只雄性和6只雌性)。每个试验处理共使用33条鱼。实验溶液每48小时更新一次，根据之前的工作中讨论的氟西汀浓度稳定性，在当天的第一次喂养后30分钟。每天检查动物的死亡率，每天喂食两次。在暴露期结束时(第15天)，动物在清洁的培养基中冲洗两次，并转移到养殖池的鱼类系统水。第二天早上收集卵子，用鱼水清洗，在体视显微镜下检查(Leica Microsystems - Leica eEZ4 16x, 4.4:1)，其中呈现相似发育阶段的胚胎(阶段2:囊胚)被选择并分为两组:A组-用于胚胎发育评估，B组-用于后期生命阶段的评估。
将受精后4小时(hpf)的斑马鱼胚胎置于含10 mL清洁鱼水的6孔板(每孔10个胚胎)中，直至受精后8天(dpf)。每一种情况总共评估了540个胚胎。每48h进行1次完全补水。在此期间每天对动物进行检查，并对死亡率和畸形(192 hpf)、早期孵化(48和72 hpf)、游泳膀胱膨胀(96和120 hpf)、心脏活动分析、总体长和行为进行评估。
使用DanioScope软件(Noldus Wageningen，荷兰)测量斑马鱼幼鱼(n = 15个生物/条件)8 dpf的心率和血流活动。幼鱼未被麻醉，被固定，并在幻灯片上放置在4%甲基纤维素的侧视图或腹视图中。该操作在27°-28°C的隔离行为室中进行。使用GigE摄像机(AVI格式为30 fps;UI-5240CP-NIR-GL，成像开发系统，德国)。按照Cunha等人的描述，使用DanioScope软件分析视频。
为了评估亲代暴露于氟西汀对斑马鱼后代总体长的影响，每隔30天(≈1、2和3个月)测量个体(n = 20个生物/条件)。从鼻前部到尾部最后方测量体长。采用Noldus ethvision©XT 15.0软件测量8 dpf幼鱼量。1个月、2个月和3个月的生物用显微镜(Nikon SMZ1500, Nikon Instruments INC.)拍摄。使用GIMP 2.10.12软件进行测量(详见补充资料(图S1A))。
所有行为学测试均在27 ~ 28℃的隔离行为室中进行。在测试前1小时，鱼被转移到行为室，以适应该房间。行为学测试在10:00 ~ 14:00进行。所用斑马鱼的总体长相似。
所有的子代(8 dpf幼鱼和1个月大的幼鱼)的行为分析均按照之前描述的方法，使用由Noldus ethvision©XT 11软件控制的DanioVision系统(Noldus, Wageningen, Netherlands)(补充材料，更多细节)进行。评估4种不同的行为:振动惊吓反应(VSR)、适应(振动刺激)、基础运动活动(BLA)和视觉运动反应(VMR)。
对于2月龄斑马鱼，新型水箱试验(NTT)和浅滩试验(图S2A和B)分别使用Faria 等人描述的实验设置来评估焦虑和社会行为效应，并测试每个实验组的24-27条斑马鱼。在每次测试中，使用放置在实验水箱前面的GigE相机(UI-5240CP-NIR-GL，成像显影系统，德国)记录6分钟的视频(AVI格式，30 fps)，由uEye座舱软件(成像显影系统，德国)控制。录像后使用Noldus ethvision©XT 15.0 (Noldus, Wageningen, Netherlands)软件进行处理。对于NTT，通过分析地理趋动性来单独评估焦虑行为，地理趋动性是鱼在新环境(例如新水箱)中表现出的“潜水”行为(图S2A)。确定在顶层和底层移动的距离(%)、移动总距离(cm)、到顶层的过渡、在顶层和底层停留的时间(%)和冻结时间(%)。浅滩试验可以评估社会凝聚力的变化。每种实验条件(n = 24-27条斑马鱼)的9条鱼被用于分组，并确定了平均鱼间距离(cm)和最远鱼间距离(cm)(图S2B)。测试结束后，鱼被送回斑马鱼养殖箱继续生长30天。
对3月龄斑马鱼进行行为学测试:NTT、浅滩活动、社会偏好(SPT)、明暗活动(LDT)和新物体活动(NOT)。视频录制设置、用于录制和视频处理的硬件和软件与上一节使用的相同。在生命的这一阶段，无法区分后代生物的性别。
SPT包括使用社会刺激来调查对一群同种个体的行为反应。在28℃下使用一个含有5 L鱼水的实验矩形水箱(20 cm长、20 cm宽和25 cm高)实施SPT。左侧放置10条斑马鱼鱼群(体长与被测试的鱼相似)，右侧放置一个有水的水箱(里面没有鱼，中性刺激)(图S2C)。在每组24条斑马鱼中单独评估SPT。为了进行视频分析，我们将坦克分为3个相等的虚拟区域:最接近浅滩的区域、中间区域和远处区域，以及所行驶的距离，并测量了在每个区域所花费的时间(图S7)。
LDT是根据Faria等人的方法进行的，用于评估斑马鱼的焦虑行为，即当出现轻度厌恶刺激(新奇)时，斑马鱼对黑暗背景的偏好。每个实验组的24条斑马鱼的行为被单独研究，摄像机被放置在测试水箱的顶部(图S2D)。分析在白区和暗区停留的时间。
NOT是根据Hamilton等人的实验设计进行的，用于评估鱼的焦虑和大胆程度，使用乐高®人物作为新对象，用魔术贴固定在竞技场中心(图S2E)。将摄像机置于测试箱顶部，分别记录24条斑马鱼的行为，分析3个虚拟区域(远、中、中)的距离和时间(图S8)。
行为学测试后，通过热休克将鱼安乐死，并分别收集大脑，冷冻在液氮中，并保存在- 80℃，用于基因表达和神经递质分析。
按照Agra等人的描述进行了适用于斑马鱼的呼吸测定。通过对2个月和3个月的后代(每条件和年龄各10条鱼)的水中溶解氧水平的定量测定氧耗量。简单地说，每条鱼都被引入一个气密的50毫升注射器(汉密尔顿，美国)中，其中装满了50毫升氧气饱和的清洁鱼水(氧合24小时)，并使用氧计(Strathkelvin Instruments, Glasgow)测量溶解氧水平，该氧计安装有氧电极(Strathkelvin Instruments, Glasgow)。对每个处理进行3个空白对照测试，以校正环境氧消耗并用作校正因子。
单胺能基因的表达水平在两个不同的时间点进行评估:8 dpf (A组)和3月龄(B组)。对于8 dpf幼鱼的基因表达分析，使用8个库，每个处理10条幼鱼，对于3月龄生物，使用8个成年斑马鱼大脑(每个处理)。简而言之，使用Trizol试剂(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)提取所有样本的总RNA，所有操作均按照之前的描述进行。我们在分析前验证了所选的6个单胺能系统相关基因(slc6a4a、slc6a3、slc18a2、mao、th2和tph1a)的引物序列(Sigma-Aldrich, Steinheim，德国)的效率和特异性(补充表S1)。
在两个不同的时间点：8个月(A组)和3个月(B组)，对后代的单胺能神经递质水平进行评估。对于8个月幼鱼的神经递质分析，使用了6个池，每组15条幼鱼头部(来自每个处理)，对于3个月生物，使用了6个成年斑马鱼大脑(来自每个处理)。神经递质水平通过之前研究中描述的色谱和质谱条件进行分析。采用MassLynx v4.1软件包对数据进行处理。
数据分析采用IBM SPSS v28 (Statistical Package 2010;芝加哥,IL)。采用Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk检验评估正态性。正态分布组采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。对于不符合正态性的组，我们使用了Kruskal-Wallis检验，随后使用了Dunn多重比较检验。使用Microsoft Excel 2016绘制3个独立实验的数据，并以平均值±标准误表示，p < 0.05的值表示统计学显著性。
结果
亲代暴露于氟西汀对子代死亡率没有显著影响(图1D)。但对胚胎发育有影响。在孵化率方面，观察到浓度之间的统计学显著差异，其中暴露父母的后代在48 hpf的孵化率显著高于对照组(图1A)。在96 hpf和120 hpf时，氟西汀子代的鱼鳔膨胀显著延迟(图1B)。此外，还观察到了畸形的发生(头部、眼睛和尾部畸形以及心包和卵黄囊水肿)，在暴露于100 ng/L氟西汀的后代中观察到显著增加(图1C)。氟西汀对子代的心率和血流活动也有影响，100和1000 ng/L时心率和血流活动均显著降低(图1E，F)。
幼鱼总体长在8日龄和1月龄时受到影响。8日龄时，在两种氟西汀浓度下，幼鱼的总体长均显著减少(图2)，而在两种浓度下，1个月大的后代显著大于对照组(图2)。在2月龄和3月龄的后代中，未观察到与对照组的差异。
热图(图3)显示了振动惊吓反应(VSR)、习惯化、基础运动活动(BLA)和视觉运动反应(VMR)的结果。8 dpf幼鱼的所有行为反应均显著受损，而1月龄后代仅影响BLA和VMR。
在8 dpf的幼鱼中，当振动刺激浓度为1000 ng/L时，VSR显著降低，而振动刺激的适应所需时间显著增加。幼鱼BLA在两种浓度下均下降，而VMR表现为双相反应，氟西汀浓度为100 ng/L时幼鱼由亮转暗诱发的逃避反应减少，浓度为1000 ng/L时幼鱼由亮转暗诱发的逃避反应增加。
在1月龄斑马鱼中，当VMR浓度为1000 ng/L时，BLA含量显著增加。
100 ng/L和1000 ng/L的后代NTT显示鱼类具有负趋地性，在池顶移动的距离显著增加，底层探索减少(图4A)。在每一层的时间上，我们观察到类似的反应模式，鱼在鱼缸顶部的时间更多，在底部的时间更少(图4A)。在整个罐内移动的总距离方面，两种氟西汀浓度均显著降低(图S5A)。此外，在1000 ng/L氟西汀的后代中也观察到向顶端过渡的数量有减少的趋势(图4B)，以及冻结行为，但没有统计学意义(图4A)。100 ng/L氟西汀暴露组的子代鱼群的平均鱼间距离和最远距离均显著增加(图4C)(详细图见补充材料(图S3))。
图S3 亲代暴露于氟西汀对2月龄斑马鱼后代的影响
3月龄子代的NTT结果与2月龄子代的NTT结果相似。1000 ng/L条件下的3个月子代表现出负趋地性，在水箱顶层移动的距离显著增加，在底层移动的距离显著减少(图4A)。在两层中所花费的时间也可以观察到这种反应模式(图4A)。在整个水箱中移动的总距离中，观察到1000 ng/L氟西汀的后代显著减少(图S5B)。此外，在1000 ng/L氟西汀的后代中也观察到向顶端过渡的次数有减少的趋势(图4B)，以及在氟西汀暴露的后代中观察到冻结行为有下降的趋势(图4A)。
在3个月时，通过第二次LDT检测，分析亲代暴露于氟西汀对子代焦虑样行为的影响。我们在暴露于两种剂量氟西汀的亲代生物的后代中观察到阴性的暗趋化，在白色场地的时间显著增加。
除了向地趋向性和向暗趋向性，胆量还可以提供动物焦虑水平的信息。在NOT的3个月子代中，胆量显著增加。如图4A所示，来自暴露的父母的后代增加了在区域中心移动的距离，也就是新反对点所在的位置。
当对3个月大的鱼的社会行为进行分析时，发现鱼群的大小发生了显著变化。与对照相比，在1000 ng/L浓度下，平均鱼间距离显著降低，而最远的鱼间距离在两种浓度下均降低(图4C)。3月龄子代的SPT表现也存在显著差异。两种氟西汀浓度在最接近同种异体的区域移动的总距离显著减少(图4a)。在时间上，1000 ng/L氟西汀组的斑马鱼后代在同种异体附近的时间明显少于对照组后代(图4A)(补充资料的其他详细图(图S4和S6))。
在2月龄和3月龄的子代中，亲代暴露于氟西汀显著影响其氧耗量，两种浓度的子代在研究的两个时间点均显示出氧耗率显著增加(图5)。
我们分析了8日龄(A组)和3月龄(B组)斑马鱼子代5 -羟色胺再摄取(slc6a4a或sert)、单胺能神经递质囊泡转运(scl18a2或vmat2)、多巴胺再摄取(scl6a3或dat)、5 -羟色胺氧化(mao)和5 -羟色胺和多巴胺合成(分别为tph1a和th2)相关基因的表达。8日龄时，亲代氟西汀对sert和dat的表达有明显影响，1000 ng/L氟西汀组子代sert和dat的表达上调。1000 ng/L氟西汀组子代mao表达增加。在5 -羟色胺和多巴胺合成相关基因中，与对照子代相比，1000 ng/L的子代tph1a和th2的表达显著上调。亲代氟西汀对vmat2的表达无明显影响。
在3月龄的鱼脑(B组)中，氟西汀子代的单胺能基因表达水平仍然改变。dat表达显著改变，两种浓度均显著上调。vmat2和th2的表达也受到影响，1000 ng/L氟西汀组vmat2和th2的表达增加。在mao的表达方面，父母氟西汀暴露，尤其是100 ng/L的氟西汀可上调子代mao的表达。对于sert和tph1a的表达，尽管有上调的趋势，结果没有发现显著的影响。总的来说，100和1000 ng/L氟西汀组的dat表达分别增加了47.1和2.0倍。当氟西汀浓度为1000 ng/L时，vmat2和th2的表达分别增加了7.1倍和3.3倍。100 ng/L和1000 ng/L后代的mao基因表达也增加了7.5倍和1.1倍的变化(其他详细图的补充材料(图S9))。
热图显示了8日龄(A组)和3月龄(B组)的单胺能神经递质水平(图7)。就8日龄幼鱼的5-羟色胺能系统而言，亲代暴露显著影响了5-羟色胺(5-HT)和色氨酸的水平。100 ng/L的子代血清素水平降低，而色氨酸水平显著升高。
在多巴胺能系统方面，两种浓度的氟西汀均促进了后代多巴胺水平的升高，而高香草酸(HVA)水平显著降低。神经递质酪氨酸呈非单调反应，100 ng/L氟西汀组子代的酪氨酸水平显著高于对照组和1000 ng/L氟西汀组子代。亲代暴露也影响了去甲肾上腺素水平，促进了1000 ng/L子代去甲肾上腺素水平显著升高。
在3个月龄的鱼脑(B组)中，氟西汀暴露的后代的单胺能神经递质水平仍然与对照组不同。多巴胺、酪氨酸、HVA和色氨酸水平发生明显改变，在1000 ng/L时显著降低。5-HT和去甲肾上腺素水平分别呈下降和上升趋势，但差异无统计学意义。
亲代暴露于污染物可显著损害生物反应(例如行为、生长、生殖、激素水平、酶和基因表达)和后代的生存能力。由于氟西汀是一种具有生物蓄积潜力的药物，这种SSRI可以转移到卵母细胞。对于胚胎发育至关重要的母体因子(如蛋白质、脂质和转录本)向后代的储存和转移发生改变，可直接影响后代的健康。本研究的结果证实，成年鱼暴露于环境浓度的氟西汀可将长期效应传递给下一代，表明DoHAD范式在鱼类中具有潜在的代际遗传和生态相关性。
在斑马鱼中，鱼鳔起着维持浮力、呼吸、感知压力波动、减少深层环境中的能量消耗的作用，在96 hpf时显得膨胀。暴露于氟西汀的生物的后代表现出早期孵化和延迟的鱼鳔膨胀。其他作者在直接暴露于浓度范围为0.64 ng/L - 276.6 μg/L的氟西汀24小时至8天的斑马鱼胚胎中发现了与本研究中观察到的类似的发育效应。对于本研究中观察到的发育效应，一个可能的假设可能与代谢活性低(卵黄囊吸收少)和呼吸频率低间接相关。代谢活性低也可能与观察到的这些生物的低心率、较小的体长和高畸形发生率有关。胚胎发育过程中利用氧气进行氧化呼吸的能力是正常发育所必需的，因此进一步的研究应探讨氟西汀在鱼类早期阶段诱导代谢变化的潜力。在鱼类发育的早期阶段，甲状腺激素(THs)水平下降和脱碘酶(参与激活或灭活甲状腺激素的酶)受到抑制也可导致鱼鳔膨胀受损。未来的研究应探讨TH水平对氟西汀疗效的影响。
1000 ng/L氟西汀暴露组仔鼠对声/振动刺激(或惊跳反应)反应减弱。这些结果与斑马鱼幼鱼直接暴露于同一药物(从4 hpf到8 dpf或24小时暴露)和其他同类药物的研究数据一致。100 ng/L和1000 ng/L氟西汀暴露组仔鼠的血乳酸也明显降低，这可能与仔鼠的总体长显著减少有关。
习惯化测试是一种简单的非联想学习方法，其基础是减少对无关和重复刺激的反应。1000 ng/L氟西汀组仔鼠的习惯化速度明显慢于对照组，提示仔鼠存在记忆和学习问题。在一项将SSRI药物舍曲林暴露于斑马鱼幼鱼8天的研究中，在浓度低于1 μg/L的情况下观察到类似的效果。在VMR方面，在本研究中，100 ng/L的子代表现出活性反应降低。VMR表明，鱼类能够区分明暗，这与躲避捕食者有关。这一结果与Faria等人(2021b)的结果一致，Faria等人报告，直接暴露于较高浓度的氟西汀(154.65 μg/L) 24小时后，斑马鱼幼鱼的VMR在8 dpf时降低。然而，在1000 ng/L的子代中观察到的VMR增加，表现出整体尺寸的减小，似乎是一个效应，具体激活了参与这种反应的一些神经元环路。
在生命后期(青少年和成年)，虽然鱼鳔充血延迟不再明显，但代谢改变仍然存在，表现为后代的高耗氧量、行为改变、基因表达和单胺能系统的神经递质水平改变。
在2个月和3个月大的氟西汀子代中观察到的氧消耗增加可能表明柠檬酸循环(或Krebs循环)的可能改变，表明亲代暴露于氟西汀对大脑能量代谢的调节。因此，未来的研究应探讨氟西汀和其他SSRIs对Krebs循环的影响。
在幼年期(1月龄)，1000 ng/L氟西汀处理的仔鼠出现BLA和VMR活动增强。尽管运动活动增加，这些青少年的多巴胺水平显著低于相应的对照组。因此，对这些结果最合适的解释再次是观察到的总身长的差异，1000 ng/L氟西汀处理的后代总身长的增加最终导致运动能力的增加。关于氟西汀对幼鱼的直接作用的研究也很少。其他作者也发现直接暴露于氟西汀对光照条件变化的反应有影响。1000 ng/L氟西汀暴露12 d后，斑马鱼幼鱼在黑暗期的游泳时间增加。对结果的分析清楚地表明，关于氟西汀对青少年的潜在影响，无论是直接接触氟西汀还是父母接触氟西汀的影响，仍然相当缺乏信息，这支持对这一主题的进一步研究。
在2月龄子代行为学上，首先进行两种不同的行为:焦虑样行为(NTT)和社交行为(浅滩试验)。这些行为在这个年龄已经存在并形成，可能对外部干扰(如压力和药物)敏感。据报道，氟西汀对直接暴露的鱼有明显的抗焦虑作用。在2个月大时，氟西汀的后代表现出负趋地性，游的距离更长，在水箱顶部停留的时间更长，向水箱顶部的过渡次数更少，冻结行为明显减少。所有这些因素表明氟西汀对暴露于氟西汀的斑马鱼后代具有抗焦虑作用。这种效应一直持续到成年期(3个月)，证明了其持续性。这些结果与其他作者直接暴露于氟西汀时观察到的结果相似。
成年鱼避开明亮区域(或暗驱)的倾向被抗焦虑药物逆转，增加了它们对捕食者的脆弱性。在本研究中，暴露于氟西汀的子代鱼在3月龄时呈阴性的暗趋化。这一结果支持NTT数据，提示氟西汀具有抗焦虑作用。这些结果与其他直接暴露于0.01 ~ 100 μg/L氟西汀10 ~ 14天的斑马鱼、青鳉和食蚊鱼成虫的研究结果一致。
NOT旨在评估新恐惧行为，即对未知物体的恐惧(在我们的研究中，是一个乐高图形)。在斑马鱼中，自然行为是远离这个物体(通过靠近墙壁(触壁))，它被认为是潜在的捕食者。在目前的研究中，两种氟西汀浓度的后代在最接近图形的区域的持久性增加，这一行为与焦虑的减少一致。接近图形的行为也可以被视为大胆的衡量(主动行为)。主动或大胆的鱼会更快地探索新环境，这种行为与血清素水平的变化和低基础皮质醇水平相关，导致行为表型的可能调节。另一方面，这幅图也暗示了对捕食者逃跑行为的干扰。
斑马鱼的社会行为贯穿其一生，这使得它们能够识别同种动物(相同的年龄和体型)，及早发现捕食者，改善喂养和交配。社会凝聚力受到焦虑状态的强烈影响，焦虑性化学物质导致鱼群缩小，而焦虑性化学物质导致鱼群缩小。因此，本研究中发现，暴露于100 ng/L氟西汀的父母在2个月大的幼鱼中增加了鱼群的大小。然而，当在3个月大的生物上进行评估时，100和1000 ng/L氟西汀的后代表现出更强的鱼群凝聚力。有趣的是，SPT对社会亲密度的影响与观察到的对SPT的影响不同，更符合在来自相同父母的成年人中发现的焦虑抑制效应。由于浅滩试验和SPT提供了关于社会行为的不同要素的信息，这些试验往往提供不同的结果。SPT结果与Giacomini等在直接暴露于50 μg/L 15分钟的斑马鱼成虫中，以及Ansai等人在暴露于100 μg/L氟西汀10天的青鳉成鱼中报告的结果相似。
所有这些行为的改变都会损害它们躲避捕食者、寻找食物和繁殖的能力，从而影响它们在自然栖息地的生存。
为了阐明与观察到的子代行为变化相关的潜在机制，我们评估了子代的单胺能基因表达水平。直接暴露于氟西汀可影响单胺能系统，这是调节鱼类各种脑功能的主要机制之一，如行为和生理变化。
在8日龄子代幼鱼(A组)中，亲代暴露导致slc6a4 (sert)， tph1a和mao转录本上调。slc6a4编码SERT, SERT是一种跨膜蛋白转运体，负责将5-HT从突触间隙再摄取到突触前5-羟色胺能神经元。tph1a编码色氨酸羟化酶(5-羟色胺合成中的限速酶)，mao(单胺氧化酶)编码催化单胺氧化的酶。观察到的tph1a上调可能是由5-HT水平降低触发，导致色氨酸羟化的正反馈回路，从而导致5-羟色胺水平升高。sert表达水平的增加也可能与观察到的5-HT水平降低有关，表明有大量的这种神经递质被转运。这些效应可能与观察到的氟西汀子代的非联想学习(习惯化)延迟有关。与毛纳细胞(位于鱼后脑的网状脊髓中间神经元)相关的5 -羟色胺能系统神经元在调节非关联学习过程中发挥重要作用，可能受到亲代氟西汀暴露的影响。
儿茶酚胺在运动调节和运动系统控制中也起着重要作用，多巴胺能系统的损害会导致硬骨鱼的运动改变。氟西汀子代的多巴胺和去甲肾上腺素水平以及slc6a3和th2的表达水平均显著高于对照组。有趣的是，多巴胺代谢的最终产物HVA的水平下降了。由于th2编码酪氨酸羟化酶(儿茶酚胺合成中的限速酶)，因此观察到的该转录物表达增加可能与观察到的多巴胺和去甲肾上腺素的增加直接相关。slc6a3基因编码DAT(多巴胺转运体)，这是一种跨膜蛋白，负责将多巴胺从突触转运和再摄取到多巴胺能神经元的细胞质中。在氟西汀后代中观察到的儿茶酚胺水平的增加也可能与slc6a3表达水平的增加有关，导致神经递质在多巴胺能神经元中的转运和重吸收增加。此外，HVA水平的降低强烈提示，参与多巴胺降解为HVA的酶MAO或儿茶酚- o -甲基转移酶(COMT)可能受损，并伴有多巴胺β-羟化酶的增加，从而产生更高水平的去甲肾上腺素。氟西汀子代的BLA水平下降，而多巴胺水平升高，表明这些幼鱼的总长度减少是导致其运动能力下降的主要因素。然而，亲代暴露于氟西汀对后代多巴胺受体的特定影响不能被抛弃。
当子代成年后，单胺能基因的表达仍保持较高水平，在某些情况下，其倍数显著增加。这些数据表明上述合成途径仍然受到影响。
我们观察到的持续至成年期的行为效应(负向地趋性和暗趋性、冻结行为减少、社交和新恐惧行为的变化)、单胺能系统相关基因表达和神经递质水平的变化可能表明表观遗传改变的参与。鉴于这种可能性，需要在这一领域进行更多的研究，以了解可能涉及到在后代中观察到的变化的表观遗传机制，以及这些变化如何影响物种的生存和连续性。
本研究的结果表明，斑马鱼暴露于环境相关浓度的氟西汀对其后代的胚胎发育和行为反应有影响。这种暴露，即使在低浓度的氟西汀下，也会引起单胺能系统关键基因表达水平的增加和神经化学改变。鉴于这一证据，显然需要对亲代和多代人进行与环境相关的氟西汀浓度暴露。对不同水生物种进行的这一性质的进一步研究可以提供与跨代长期影响相关的潜在环境风险的信息，加强监测水生环境中这些精神药物和其他污染物的重要性，需要重新评估在水生生物野生种群中暴露于SSRI的生态和进化后果。
原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045653524007446?via%3Dihub
