前沿解读·第7期 ▏2024年USCAP年会肺癌精彩速递

KRAS突变是肺腺癌（LUAD）中最常见的基因突变，目前被认为是潜在的预测性治疗靶点，并与LUAD的临床结果较差相关。然而，特定KRAS突变亚型对LUAD预后的影响尚不清楚。本研究旨在评估KRAS突变亚型与预后之间的关联，并根据临床病理和分子特征评估其对临床结果的影响。

我们的队列包括1552名经过手术切除的LUAD患者。使用Oncomine™ Precision Assay GX Gene Panel（Thermo Fisher Scientific）进行了下一代测序（NGS），该panel 包含了50个基因的变异。我们使用Kaplan-Meier方法估计了无复发生存期（RFS）和总体生存期（OS），并通过Log-rank检验评估了KRAS突变亚型和野生型之间的差异。在调整临床病理学和分子特征的基础上，采用多变量Cox比例风险回归方法，重点关注共发生的基因突变、临床分期以及存在≥5% LUAD组织学亚型（实性、乳头状、腺泡状、鳞状、微小乳头状和筛孔）来确定KRAS突变亚型作为预后因素。

在这项研究中包括了1552例肺腺癌（LUAD），其中有699例观察到KRAS基因突变。在KRAS基因突变亚型中，只有KRAS-G12D（Kr-G12D，n=78）的患者与野生型相比显示出明显较差的总生存期（log-rank p=0.003）。多Cox回归分析证实，在整合共同发生的基因突变和临床病理特征后，KRAS-G12D突变亚型相比于野生型具有更差总生存期（风险比（HR）：1.42，95% CI：1.0-1.92，p=0.019），而对于无复发生存期则没有显著影响（HR：1.13, 95% CI：0.81-1.15, p=0.44）。值得注意的是，在这个队列中，存在≥5%（n=165）对OS（HR：0.31，95％ CI：0.22-0.44，p<0.0001）和RFS（HR：0.4，95% CI：0.28-0.57，p<0.0001）都有最强的影响。此外，在KRAS突变LUAD案例中，TP53（n=211），PIK3CA（n=21），FGFR3（n=13），GNAS（n=13）和其他基因突变（n=63）共同出现对OS有显著影响(HR：0.81，95％ CI：0.69-0.96,p=0017)。

在本研究中，我们发现KRAS-G12D突变与LUAD患者的不良预后显著相关，在整合临床病理特征和共发生突变后仍然显著。

NTRK基因融合在不到1%的NSCLC中是确定的致癌驱动因素。准确检测晚期NTRK融合患者对于确保最佳的治疗选择至关重要。我们研究了免疫组化（IHC）和荧光原位杂交（FISH）作为检测功能性NTRK融合的诊断测试的性能，与下一代测序（NGS）相比。我们还初步分析了与pan-TRK IHC表达的相关因素。

2020年10月至2022年8月，共1146例肺癌患者采用IHC进行常规NTRK融合筛查。阳性病例同时采用FISH和基于DNA和RNA的NGS进行分析。我们选择了278例泛TRK阴性病例作为进入NGS的对照。

结果显示，963例肺腺癌（LUAD）中的4例、130例肺鳞状细胞癌（LSCC）中的21例呈泛TRK阳性。IHC染色显示LUAD具有良好的同质性，而LSCCs显示明显的异质性。FISH分析显示，4例LUAD阳性病例中有2例分别出现NTRK1和NTRK3重排，泛TRK阳性LSCC均未出现NTRK重排。在进行FISH解释时，仍然存在一些令人困惑的模式，包括一个核中的多个单一的5‘信号和小于两个的信号的宽度。基于RNA的NGS证实了2例有功能性NTRK融合的病例，1例为TPM3-NTRK1，另1例为SQSTM1-NTRK3。基于DNA的NGS没有发现NTRK的任何功能融合，但确实发现了NTRK2的非功能融合。IHC在LUAD中检测NTRK融合的敏感性为100%（95% CI：19.79%-100%），特异性为99.70%（95% CI：98.83%-99.95%），远高于LSCC。Pan-TRK的表达与LSCC中PD-L1的肿瘤比例评分（TPS）显著相关（p < 0.05）；TPS越高，Pan-TRK的百分比越高。

IHC是一种敏感且特异的技术，适用于LUAD（而非LSCC）的NTRK融合筛查。LSCC中panTRK的表达与PD-L1的TPS相关。FISH是检测NTRK融合的可靠方法，然而，解释阳性NTRK融合存在一些困难。基于RNA的NGS比基于DNA的NGS更敏感。

EGFR扩增已被公认为对EGFR TKI治疗的敏感性和耐药性增加的标志。显示敏感性增加的研究主要是使用较老的TKIs，而不是目前的护理标准，奥希替尼。临床前研究已经确定了野生型EGFR等位基因的扩增是TKI耐药性的一个来源。然而，在临床实践中，这种区别并没有在NGS报告中常规出现，也在最近确定获得性EGFR扩增为奥希替尼耐药性机制的论文中没有直接提及。为了确定奥希替尼耐药性中EGFR扩增的真正临床意义，我们对我们机构的EGFR改变的NSCLC队列进行了回顾。

我们回顾性鉴定了2019年4月至2023年7月期间来自38例患者的44份EGFR扩增的NSCLC标本。其中11例患者接受了一线奥希替尼治疗，并进行了至少12个月的临床随访。NGS已作为OCA v3或OCA Plus平台的常规临床实践的一部分进行，这两种平台都被设计用于检测EGFR的改变和扩增。然后从电子病历中获得临床信息，包括分期、对奥希替尼的反应、其他治疗史和进展时间。另外还有一组14例EGFR敏感NSCLC患者（分期、收集日期和EGFR突变匹配），未经一线奥希替尼治疗扩增。

一线奥希替尼、EGFR扩增组与未扩增组的总缓解率（ORR）和中位无进展生存期（PFS）（91% ORR EGFR扩增与100%未扩增；p=0.44）（扩增14个月PFS EGFR与未扩增16个月PFS；p=0.9479）无显著差异。在随后的活检中发现了两例“新发”EGFR扩增。令人惊讶的是，这两例患者都未接受过EGFR TKI治疗。对NGS病例数据的比较显示，随访活检中的肿瘤细胞数量几乎是原始活检的两倍。

这些结果表明，在一线环境中的EGFR扩增对护理标准的奥希替尼保持了敏感性。在评估新的EGFR扩增的治疗决定时应谨慎，特别是当原始活检质量较差时。肿瘤细胞减少导致基因扩增假阴性结果是NGS检测中已知的现象。

小细胞肺癌（SCLC）仅占肺癌的15%，但仍是所有癌症死亡的第六大原因。5-10%的患者生存期超过三年。这种特殊的生存率可能归因于抗肿瘤免疫反应的增强，尽管小细胞癌通常被描述为“免疫沙漠”或沉浸在免疫抑制性肿瘤免疫微环境中（TIME）。迄今为止 , 免疫疗法仅对一部分患者有效。我们假设原发性和转移性SCLC中，TIME的特定的、可测量的TIME特征显着影响生存。此外，TIME特征可以为最佳免疫治疗选择提供信息，根据个体特定的免疫微环境条件进行定制治疗方案。

我们从SEER登记中识别出SCLC患者。创建了两个匹配的队列：一组有12名预期生存期（<14个月）的患者，另一组有12名特殊幸存者（>36个月）。使用 GeoMX（NanoString Inc）和Comet平台（Lunaphore），我们通过数字空间分析和肿瘤细胞块切片上的免疫荧光评估了78种免疫肿瘤学标记物。这些标记物包括谱系抗原、细胞因子和缺氧相关蛋白。此外，4名细胞病理学家评估了切片，以独立预测异常存活率。

在GeoMX空间分析中，异常幸存者的4个免疫应答相关蛋白（CCND1、CD27、CD274、CD74）与预期幸存者的基因表达有统计学意义的差异（主成分分析P =4.135 x 10^-3）。多重IF染色与通过空间分析平台定量的肿瘤细胞和免疫细胞相关。值得注意的是，CD27表达的减少与较短的生存率相关（P=0.003163）。在4位细胞病理学家独立设计的病例形态学分组中，有一种显示与生存率显著相关（P=0.014）。

来自12名预期幸存者和12名异常SCLC幸存者的初步研究结果强调了SCLC TIME对生存率的潜在重大影响。包括CD27表达水平在内的各种免疫标记物的表达模式可以推断出对特定免疫治疗方案的不同反应。生存与形态特征的部分成功关联表明，基于苏木精和伊红染色细胞块切片的显微镜检查具有开发预后和免疫治疗预测人工智能算法的潜力。

肿瘤相关钙信号转换器2（TROP2）是一种细胞表面糖蛋白，参与了多种癌症的高恶性潜能。靶向TROP2的抗体-药物偶联物是治疗表达TROP2的癌症，包括非小细胞肺癌（NSCLC）的一种很有前途的策略。然而，TROP2在高级别肺神经内分泌癌中的表达量及其临床病理特征仍在很大程度上是未知的。

该队列纳入90例手术切除的高级别神经内分泌癌（NEC）患者，其中77例为小细胞肺癌（SCLC），13例为大细胞神经内分泌癌（LCNEC）。我们使用免疫组化评估了TROP2情况。当≥10%的肿瘤细胞出现膜染色时，认为肿瘤为TROP2阳性。对于所有肿瘤，均有ASCL1、NEUROD1和POU2F3的免疫组化表达谱。根据ASCL1、NEUROD1和POU2F3染色模式，我们将肿瘤分为：ASCL1阳性（NEC-A）、NEUROD1阳性（NEC-N）、ASCL1/NEUROD1双阴性且POU2F3阳性（NEC-P），三种标记物均为阴性（NEC-I）。

10例（11%）患者中可见TROP2的表达：3例SCLCs，4例联合SCLCs（3例混合腺癌成分，1例混合鳞状细胞癌成分），2例LCNECs，1例联合LCNEC（混合鳞状细胞癌成分）。在TROP2阳性的病例中，在SCLC或LCNEC细胞中可见中度至强强度的膜性染色。TROP2阳性的癌细胞比例在10-90%之间（平均28%）。TROP2阳性NECs的表达与联合亚型显著相关（P=0.0246），而TROP2的表达与其他临床病理因素无相关性。根据转录表达，肿瘤的分子亚型分布为：NEC-A46（51%），22 NEC-N（24%），NEC-P17（19%），NEC-I5（6% ) 。其中，5例NEC-A、3例NEC-N和2例NEC-P肿瘤表达TROP2，而NEC-I肿瘤不表达TROP2。

我们的研究结果显示，约10%的NECs表达TROP2，并与联合亚型相关。TROP2在SCLC和LCNEC亚群中的表达提示TROP2可以作为TROP2定向治疗的治疗靶点，特别是在联合亚型中。

非小细胞肺癌（NSCLC）是全球最具破坏性的恶性肿瘤之一。近年来，以阻断程序性细胞死亡1（PD-1）及其配体程序性细胞死亡配体1（PD-L1）为代表的免疫治疗策略极大地改善了晚期NSCLC的预后。然而，目前仍缺乏理想的生物标志物来准确地指导患者分层，以进一步扩大免疫治疗的临床益处。在这里，我们从免疫细胞亚群的丰度和空间位置等方面对免疫微环境进行了全面的分析，以预测具有不同免疫治疗疗效的患者群体的特征。

回顾性收集46例接受抗PD-1/PD-L1免疫治疗的晚期NSCLC患者治疗前FFPE肿瘤样本；采用多重免疫组化（mIHC）同时检测PD-1、PD-L1、CD8、CD163、FoxP3和pan-CK；定量计算一系列免疫微环境细胞亚群的分区（肿瘤或间质）丰度和空间位置（邻近评分）；采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验评估患者组间细胞丰度和空间分布的差异；采用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验来评估生存预后的差异；用逻辑回归、Cox 回归和最小绝对收缩和选择算子 (LASSO) 回归分析来表征免疫治疗反应和生存的特征。

一般来说，CD8+细胞的丰度和接近度得分越高，反应和存活率越高，而CD163+细胞则相反；除CD8+细胞外，高丰度的PD-L1+基质细胞或免疫细胞可能是负面的生存预后因素。为了预测对免疫治疗的反应，我们根据CD8+FoxP3-PD-1-细胞的总体密度、CD163+细胞的肿瘤密度以及CD8+PD-1+和CD8+PD-L1的邻近评分建立了细胞多维特征（AUC=0.98）。该特征能够预测抗PD-1/PD-L1免疫疗法的客观反应和晚期NSCLC患者的生存率。

特异性的多维肿瘤免疫微环境特征作为晚期NSCLC免疫治疗疗效的潜在生物标志物，值得探索；检测晚期NSCLC基质或免疫细胞上的CD8、CD163和PD-L1可能具有临床应用潜力。

成纤维细胞生长因子（FGF）配体及其受体的改变已被确定为非小细胞肺癌（NSCLC）的有效靶点。然而，FGF/FGFR信号通路的复杂变异多样性尚未得到很好的解释。

本文总结478例存在FGF/FGFR改变的NSCLC病例，描述了其复杂的变异多样性，并分析了其临床病理特征。通过多重免疫荧光进一步对10例NOTCH1/FGF/FGFR突变的患者进行染色分析，以研究T细胞浸润和癌症相关成纤维细胞（CAFs）亚型。

首先，通过NGS测序，发现10.27% (478/4656) 的NSCLC患者存在FGF/FGFR突变（图 A）。FGF/FGFR 变异在鳞状细胞癌（SQ，40.68%，图B）中比在腺癌（AD，8.37%，图C）中更常见。此外，约24.69%（118/478）的病例携带致病性变异（PV），而78.45%（375/478）携带意义不确定的变异（VUS）。其中15例（3.14%，15/478）同时存在PV和VUS（图D）。其次，FGF/FGFR拷贝数的增加是致病性变异中最常见的一种（83.05%，图E）。而主要的FGFR基因融合亚型为FGFR3- TACC3（57.14%，图E)，在组织学上倾向于显示透明的细胞质。另一个惊人的发现是，几乎所有的FGF19 扩增都伴随着CCND1扩增（95.35%，41/43）。FGFR1扩增是NOTCH1突变病例中的主要变异（31.25%，5/16，图F)，尤其是鳞癌。此外，有趣的是，在KRAS突变病例中，FGF/FGFR错义突变的比例为70.83%（(34/48，图G）。此外，PD-L1高表达和高IASLC分级都与FGFR突变相关。而携带FGF/FGFR错义突变/KRAS突变的患者以吸烟者或既往吸烟者为主，其中14.71%（5/34）的患者预后较差。最后，与NOTCH1/other- FGF/FGFR突变组（6/10）相比，NOTCH1/FGFR1扩增组（4/10）的Treg^CD4+/FOXP3+和免疫抵抗CAFs^{FAP+/ α-SMA+}的比例明显较低，肿瘤内CD8+T细胞浸润较多（图H-J）。

FGF/FGFR的改变主要发生在鳞状细胞癌中。NOTCH1/FGFR1扩增亚型招募了一个免疫治疗敏感的微环境。此外，整合 FGF/FGFR和KRAS靶点治疗可能是革命性的。这些研究使我们能够丰富在NSCLC中与FGF/FGFR信号通路相关的特征。

目前的国家实践指南建议对多种生物标志物进行广泛的分子图谱分析，以识别可能受益于靶向治疗的晚期非小细胞肺癌（aNS CLC）患者。由于报道不一致，循环肿瘤DNA（ctDNA）在NSCLC中的应用的临床价值尚未明确。

我们的研究旨在将ctDNA的下一代测序 (NGS) 与标准组织检测 (STBT) 进行比较，以确定指南建议的aNSCLC改变。所有患者根据突变情况，被分为组1（组织阳性-ctDNA阴性）、组2（组织阴性-ctDNA阳性）和组3（组织阳性-ctDNA阳性）。

本研究共纳入28例患者。对初治患者的肿瘤进行STBT，在治疗期间随访/进展时采集血液进行ctDNA检测。研究包括13名（46%）女性患者和15名（54%）男性患者。中位年龄为62岁（范围为27-85岁）。16例（57%）患者曾有吸烟史，5例（18%）目前仍吸烟，7例（25%）从不吸烟。在确诊时，23名（82%）患者为临床T4，2名（7%）患者为T3，3名（11%）患者为T2，24名（86%）患者为转移性疾病。在组织学上，包括20例（71 %）腺癌，5例（17%）鳞状细胞癌，1例（4%）低分化癌，1例（4%）腺鳞癌和1例（4%）大细胞神经内分泌癌。所有患者均接受多线化疗 。在本研究进行时，22名（79%）名患者患有疾病，3名（10%）名患者没有患病，2名（7%）名患者因疾病死亡，1名（4%）名患者没有疾病证据而死亡。第1组患者（n=11）的分子结果显示有4例（36%）EGFR突变，4例（36%）KRAS突变，2例（18%）BRAF突变，1例（9%）NTRK扩增。第2组患者（n=5）的结果显示有2例EGFR（40%）突变，2例（40%）KRAS突变，1例（20%）BRAF突变。最后，在第3组患者中发现4例（27%）EGFR突变，4例（27%）KRAS突变，3例（20%）ALK融合，2例（13%）BRAF突变，1例（7%）RET融合，1例（7%）MET扩增（n=15）。其他确定的显著变化包括TP53（组1/n=4（14%）；组2/n=7（25%）；组3/n=10（36%）、STK11（组1/n=1（4%）和组3/n=3（11%）和PMS2（组1/n=4（14%）。

我们的初步研究表明，ctDNA和肿瘤组织NGS检测之间具有一定的相关性。当肿瘤组织受限时，ctDNA分析可作为辅助研究。

TERT启动子（TERTp）突变是人类癌症中最常见的非编码突变。然而，TERTp突变在一些常见的癌症中很罕见，如肺癌。因此，在本研究中，我们希望有系统地 研究具有TERTp突变的肺癌的临床、病理和分子特征。

我们回顾性地检索了2018-2023年的肺癌发病结果数据库。Oncomine是针对>150基因的靶向NGS检测，包括TERTp突变。收集临床、病理和分子信息进行进一步分析。我们还通过网站搜索了一些TCGA数据库。

我们收集了约800例肺癌的发病结果。我们鉴定了18例（~2%）肺癌TERTp病例，突变平均水平是72分。男女比例是8：10。无一例为鳞状癌或小细胞癌。大多数病例为TTF-1阳性（12/18），p40阴性（6/18）。所有带有MMR的病例都完好无损。已知13例患者的PDL1状态：8例为阳性，5例为阴性。TERTp突变c.1-124C>T至c.1-146C>T比率为14：4。其他最常见的突变包括TP53（11）、KRAS（8）和CDKN2A（2）。TCGA的数据也显示出了类似的结果。

我们对具有TERTp突变的肺癌进行了最大规模的队列研究。TERTp突变在所有2%的肺癌中反复突变。仅在肺腺癌和（TTF1-和P40-）NSCLC中可见，而在鳞状细胞癌或小细胞癌没发现。这些癌症与PDL1阳性率中较高的比例相关。在分子水平上，TERTp似乎是肺癌的驱动突变，而与任何其他靶向突变无关，如EGFR、MET、ALK或ROS1等。

MET（间充质-上皮转化）癌基因的激活代表着癌症治疗的新兴分子靶点。MET在多种人类肿瘤中失调。虽然MET外显子14跳跃突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中可靶向突变的作用已经得到深入研究，但MET外显子2跳跃突变在肺癌中的作用在文献中尚未得到评估。

利用ArcherDx 50基因FusionPlex实体瘤panel检测确定携带MET外显子2跳跃突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者。同时，采用Illumina MiSeq仪器进行Trusight 48基因panel检测，并利用Agilent Alissa平台对DNA变异数据进行分析。对2019年诊断为NSCLC并携带MET外显子2跳跃突变的患者进行了回顾性整理，并对其临床病理和分子特征进行了分析。通过病历回顾对患者进行了3年的临床随访。

经ArcherDx panel进行分子检测的患者中，有三分之一显示出MET外显子2跳跃突变。我们的患者群包括40名患者（20名男性和20名女性）携带MET外显子2跳跃突变。平均年龄为69.1岁（范围：42-90岁）。33名患者（82.5％）为吸烟者，并且38名患者（95％）在初诊时已有转移。在3年随访期内，有29名患者（72.5％）已故。已故患者的平均生存期为诊断后的16.4个月（见表1）。75%的病例中存在与MET外显子2跳跃突变共存的1/2级突变，即KRAS（n=13）、MET（n=11）、BRAF（n=7）、EGFR（n=6）、TP53（n=6）、RET（n=3）、VHL（n=2）、STK11（n=2）、MLH1（n=2）、ERBB2（n=1）和NRAS（n=1）。

MET外显子2跳跃被记录为肿瘤细胞的潜在自我调节机制，通过降低编码功能性Met受体的Met mRNA的丰度。我们的研究结果表明，晚期非小细胞肺癌可能会触发这种调节事件，以平衡肿瘤的恶性生长与MAPK途径基因等共存的致病性突变之间的关系。这些观察结果是新颖的，并可能有助于阐明调节肿瘤生长的机制，促进预后的生物标志物开发，并帮助设计治疗靶点。

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