【文献解读】锰过度暴露改变斑马鱼幼鱼神经粒蛋白表达并引起行为缺陷

影响因子：5.6

锰(Mn)是多种酶的辅因子，是生物体必需的微量金属。然而，过量接触锰可引起神经毒性。在这里，我们评估了暴露于氯化锰(MnCl₂)对斑马鱼幼鱼的生存能力、形态、突触功能(基于神经粒蛋白表达)和行为的影响。受精后2.5小时MnCl₂暴露导致受精后5天存活率降低(60%)。表型变化影响身体长度，眼睛和嗅觉器官的大小，以及视觉背景适应。同时，神经粒蛋白免疫染色的荧光强度和神经粒蛋白编码基因nrgna和nrgnb的表达水平下降，表明存在突触改变。此外，过度暴露于MnCl₂会导致幼鱼表现出姿势缺陷、运动活动减少和对光环境的偏好受损。在去除水中的MnCl₂后，斑马鱼的幼鱼恢复了它们的色素沉着模式，并恢复了它们的运动行为，表明Mn的神经毒性在某些方面是可逆的。综上所述，我们的研究结果表明，锰过度暴露会导致斑马鱼幼鱼明显的形态改变、神经颗粒蛋白表达改变和行为障碍。

介绍

锰(Mn)是一种必需的微量金属，在细胞生理的许多方面都是必需的。它作为多种酶(如谷氨酰胺合成酶、精氨酸酶和超氧化物歧化酶)的辅因子，从而参与神经递质信号传导、免疫功能以及碳水化合物、维生素和能量代谢。锰稳态的严格调节对其生物学功能至关重要，肠道和肝脏在其稳态控制中起关键作用。尽管Mn是必需的，但高水平的锰具有神经毒性，因为锰在大脑中积累，特别是在基底神经节、小脑和额叶皮质。由于职业和环境过度暴露、肝功能障碍导致的排泄障碍或SLC30A10和SLC39A14突变导致的遗传性锰转运体缺陷，都可能导致锰超载。锰通过血脑屏障(利用各种转运蛋白)进入大脑或通过嗅觉系统到达中枢神经系统。

锰在脑内蓄积呈剂量依赖性。高浓度时，它可以通过电压依赖性Ca²⁺通道运输到突触前神经元和突触后神经元。有研究认为其积累可降低γ -氨基丁酸(GABA)、谷氨酸和多巴胺的水平，从而影响突触神经传递。在人类中，锰过量暴露会导致锰中毒，这是一种与精神症状相关的运动障碍。此外，锰稳态失调是常见的神经退行性疾病的特征，如阿尔茨海默病和帕金森病。脊椎动物，包括豚鼠，小鼠和斑马鱼，已经被用于研究锰的神经毒性机制，因为它们具有相同的细胞或整体生物表型，包括暴露于锰时的姿势行为障碍。

神经变性和神经元损伤的生物标志物包括许多突触蛋白的表达改变，包括钙调蛋白结合蛋白神经粒蛋白(NRGN)。在人类，神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)会导致大脑中NRGN表达减少和脑脊液中NRGN水平升高，这些变化与认知能力下降相关。在本研究中，我们评估了MnCl2对斑马鱼幼鱼的急性毒性效应，包括基于NRGN表达的对突触的潜在影响，以及幼鱼的探索行为、明暗偏好和视动反应。

材料与方法

野生型斑马鱼(TL和AB系)在标准条件下饲养。简单地说，每天喂食两次商业干鳞片饲料(TL系:JBL NovoBel和Sera Vipan)，并在28.0±1.0°C和14/10小时的明暗周期下饲养。系统水参数(pH，电导率，硝酸盐，亚硝酸盐和铵)根据Aleström等进行监测。为了繁殖，两只雌鱼和一只雄鱼被转移到交配池。胚胎和幼鱼密度为50只/ 25 mL，置于无菌脱氯自来水(pH = 7.4±0.3;电导率= 730±30µS)，在28.0±1.0℃和14/10 h的明暗周期下。

所有实验程序均在英国内政部(United Kingdom Home Office)许可下进行，遵循英国内政部(United Kingdom Home Office)法规和/或欧洲共同体(European Community)关于动物护理和实验的指南，并获得了动物护理和使用委员会的批准。

将斑马鱼胚胎移植到4孔板(每孔10 ~ 12只胚胎)，暴露于四水合物氯化锰(MnCl2;Sigma Aldrich, M-3634, St. Louis, MI, USA)，在浓度为100-500µM的无菌脱氯自来水中进行半静态实验(每24小时更换一次培养基)。在无菌脱氯自来水中保留阴性对照，每24小时更换一次培养基。

通过比较未处理的幼鱼和暴露于不同浓度MnCl2(200、300和500µM)的幼鱼的生存分析。在没有添加MnCl2的无菌脱氯水中饲养未经处理的幼鱼。每24小时监测一次鱼，直到5 dpf，注意是否存在OECD指南中包括的5个终点中的任何一个(斑马鱼胚胎毒性测试N°236;Oecd)。简单地说，对个体进行以下分析:(i)是否存在水肿;(ii)尾部未脱离卵黄囊;(iii)未形成体;(iv) 2 dpf后无心跳;或(v)受精卵凝固。此外，在暴露于行为研究中分析的相同时间后，监测100µM MnCl2的存活率;即2 ~ 4 dpf (Mn 2 ~ 4 dpf)、3 ~ 5 dpf (Mn 3 ~ 5 dpf)和2 ~ 5 dpf (Mn 2 ~ 5 dpf)。

将斑马鱼胚胎暴露于MnCl2(500µM)中，从2.5 hpf到5 dpf (Mn 2.5 hpf - 5 dpf)，从1.5 dpf到3.5 dpf (Mn 1.5 dpf - 3.5 dpf)，从2.5 hpf到2 dpf (Mn 2.5 hpf - 2 dpf)。在5 dpf时分析7个参数，包括标准体长(µm)、全脑大小(µm2)、眼睛和嗅上皮器官的标准化尺寸值(结构尺寸与体长的比值)、端脑半球表面积(侧位图)、嗅球和端脑叶表面积(侧位图)。

通过与奥林巴斯DP71数码相机耦合的尼康Eclipse 90i光学显微镜拍摄的图像，分析了体长和眼球直径大小。体长为鱼口到尾鳍起点的距离(µm)。为了测量眼睛和嗅觉器官的大小，我们测量了根据体长标准化的直径。双眼在侧位图像上测量，嗅觉器官在背位图像上测量。为了确定脑区，我们在侧位片上使用obex作为尾侧限测量脑区。为了确定端脑及其各亚区(嗅觉器官、端脑半球(从嗅球前缘至端脑叶尾端测量)、嗅球和端脑叶)的面积，我们在全铺片中使用了微管蛋白免疫荧光技术(见下文)，并且在侧位视图中进行了测量。

为了确定MnCl₂暴露后对脑和嗅觉器官大小的影响以及神经粒蛋白表达的变化，根据Turner等人描述的方案，分别分析了微管蛋白和神经粒蛋白的免疫反应。简单地说，用三卡因甲烷磺酸盐0.3 mg/mL (MS222;Sigma, St. Louis, MO, USA)，并在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中用4%多聚甲醛(PFA)固定，在4°C下过夜。如果需要，通过在体视显微镜下手动去除皮肤、眼睛和骨头来暴露大脑。然后，将幼鱼在磷酸盐缓冲液(50、75和100%)的甲醇梯度中脱水，并在- 20℃100%甲醇中储存过夜。次日，样品用0.04 mg/mL蛋白酶K (Sigma-Aldrich, P2308，圣路易斯MO，美国)再水化和渗透20分钟(解剖的大脑)或40分钟(整个幼鱼)。幼鱼用10%正常山羊血清(NGS;Sigma Aldrich, G6767-19B409)， 1%二甲基亚砜(DMSO;Panreac Química S.L.U, A3672，巴塞罗那，西班牙)和0.5% Triton-X-100 0.1 M生理盐水磷酸盐缓冲液(PBST;pH 7.4)在室温下作用1 h。用一抗IB (Tubulin:小鼠抗微管蛋白乙酰化单克隆抗体，Sigma, T6793, 1:500稀释;Nrgn:兔抗神经颗粒素多克隆抗体，德国达姆施塔特默克公司AB5620，批号3091673,1:500稀释)。次日，在PBST中洗涤4次(每次30 min)后，样本在二抗(Tubulin: Goat anti-Mouse Alexa Fluor 568, Invitrogen, A11004;Nrgn:山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 488, Invitrogen, A11008;在室温下将IB (Waltham, MA, USA)各稀释1小时。在PBST中清洗2次(每次30 min)后，将样本转移到80%甘油/磷酸盐缓冲液中(30 min)，并将其安装在1%低熔点琼脂糖的80%甘油/磷酸盐缓冲液中进行成像。

用倒置显微镜(Olympus CKX53, Barcelona, Spain;10×;0.25 NA)，配备数码相机(奥林巴斯DP74)。采用CorelDRAW 2019设计软件(v21.0)在图像上测量形态学差异。

采用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜，分别搭载尼康Plan Fluor 10× (0.30 NA)和20× (0.50 NA)靶点。斐济软件(https://fiji.sc/;于2022年12月1日访问)，用于处理共聚焦z-堆栈并量化平均荧光强度(以相对单位强度或RUI测量)。

扫描电镜观察大鼠嗅觉器官形态;每种条件下有2条幼鱼被固定在4℃2.5%戊二醛中过夜。经过3次PBS洗涤后，样品在2%四氧化锇(Electron Microscopy Science, 19172, Hatfield, PA, USA)中后固定1-2小时，并在蒸馏水中保存。然后，样品脱水，通过分级乙醇系列和临界点干燥方法使用CO2 (Bal-Tec, CPD 030，维也纳，奥地利)。接下来，样品在溅射镀膜器(Cressington, 208HR, Watford, UK)中被铂钯覆盖，并在扫描电子显微镜(JSM 6400;JEOL，东京，日本)配备数码相机(奥林巴斯，日本东京)。

按照推荐方案(Ambion, 1596026;500µL，沃尔瑟姆，MA，美国)。总RNA用DNase (Promega, M610A, Madison, WI, USA)在37°C下酶切15分钟。根据制造商推荐使用RNeasy MiniKit (Qiagen, Seoul, Korea, 74104)纯化RNA。用GoScript Reverse Transcriptase (Promega, A501C)和OligodT引物(Promega, C110A)从1 μg总RNA中合成cDNA，并在以下温度循环条件下进行:25℃5分钟，42℃1小时和70℃15分钟。根据制造商的建议，使用GoTaq qPCR Master Mix (Promega, A600A)在CFX96触摸系统(Bio-Rad)上进行定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)，最终体积为20µL，并在以下冷热循环条件下进行:95℃下2分钟，之后在95℃下15 s的40个循环和60℃下1分钟。引物序列见表S5。每对引物的引物效率均为> 90%。以延伸因子1α (ef1α)为内参基因，进行了3次反应。2^-ΔΔCt方法用于确定基因表达的相对定量。

行为分析

每次将4条鱼置于6 cm的培养皿中，通过投影仪从下方跟踪它们的运动，并通过均匀的全视野照明、半视野光刺激(光/暗偏好)和暗刺激(投影仪强度调至最低)进行呈现，每一项持续5分钟。

每条鱼被放置在一个6厘米的培养皿中，并通过一个带有移动光栅刺激的投影仪以闭环方式从下面呈现。实验的时间过程包括5次重复的向右和向左移动光栅(每个20 s)，间隔10 s的静态光栅(暂停)，每条鱼的总时间为5分钟。

采用SPSS 28.0.0.0 (IBM®)进行统计学分析。两组间比较采用Student 's双侧t检验。对于两组以上的分析，采用Tukey或Games-Howell事后检验(分别具有或不具有方差齐性)的单因素方差分析。以p < 0.05为差异有统计学意义。

结果

为了确定用于研究MnCl₂毒性对斑马鱼发育的影响的合适浓度，胚胎从受精后2.5小时(hpf)开始暴露于浓度不断增加的MnCl₂，并在受精后5天(dpf)分析了存活率(图S1)。截至4dpf时，生存率为100%(表S1)。当µM浓度超过200µM时，与对照组相比，µM浓度超过5 dpf的幼鱼死亡率增加(200µM: 94%存活率;300µM: 80%存活率)，500µM MnCl₂可使存活率降低至64%(表S1)。

考虑到500µM MnCl₂暴露后的存活率下降，我们确定了该浓度对幼鱼形态的影响(图1a-d)。MnCl₂暴露(500µM)从2.5 hpf到5 dpf导致体长显著减少，而较短的暴露时间对这一参数没有影响(图1a(I-IV)，b;表S2)。与此同时，相对于体长，眼睛增大，嗅觉器官减小(图1c,d;表S2)。斑马鱼嗅觉上皮包含不同类型的细胞，包括纤毛感觉细胞和微绒毛感觉细胞。标记细胞骨架的微管蛋白免疫组化和扫描电子显微镜分析表明，MnCl₂暴露导致嗅觉器官的结构改变，提示嗅觉上皮感觉细胞的顶端突起长度增加(图2a-d)。

鉴于我们观察到暴露于500µM MnCl₂后嗅上皮体积减小，因此我们探讨了这种暴露是否影响完整大脑的侧貌区域，或者更具体地说，是否影响接受嗅觉传入的端脑区域(端脑、嗅球和端脑叶)。虽然嗅觉器官的大小发生了改变，但嗅球外侧轮廓的面积(接收来自嗅上皮的传入信号的端脑区)没有变化。在暴露幼鱼和未治疗幼鱼之间，我们未观察到全脑和端脑侧貌区域的大小有差异(图3)。

虽然MnCl₂暴露后大脑和端脑的区域(侧位图)没有明显变化(500µM从2.5 hpf到5 dpf)，但它导致5 dpf时NRGN蛋白表达减少，反映为斑马鱼幼鱼全脑的平均荧光强度降低(图4a,b,d)。MnCl₂暴露前2 dpf没有导致任何分析区域的Nrgn表达的任何明显变化(图4a,c,d)，表明对MnCl₂的敏感性取决于暴露的持续时间和/或胚胎发育的时间点。为了评估MnCl₂暴露是否影响nrgn的转录调控和蛋白丰度，我们通过qRT-PCR检测了斑马鱼的两个同源基因nrgna和nrgnb的mRNA水平。事实上，MnCl₂暴露导致4 dpf时nrgnna和nrgnb的mRNA表达降低(图4e)。

MnCl₂神经毒性以前被认为与斑马鱼幼体的运动受损有关。为了进一步确定MnCl₂暴露引起的行为变化，我们在6 dpf对斑马鱼幼鱼进行了行为分析(表S3)。在这些实验中，我们将MnCl₂浓度降低至100µM，这并不影响存活率(表S1)。浓度超过100µM的MnCl₂导致重度运动障碍和没有鱼鳔膨胀(图S2)，因此不适用于评估行为学改变。在行为学测试期间，用100µM处理的6dpf幼鱼在暴露期间的锰积累得到证实(图5)。幼鱼的整体锰水平随着暴露时间的延长而增加。从4 dpf中去除MnCl₂导致6 dpf的Mn水平接近正常化(图5a，表S3)。

在100µM MnCl₂处理的幼鱼中，Mn积累伴随着斑马鱼色素沉着的变化，黑素团分散，也称为无视觉背景适应(图5b,c和图S3)。在携带锰转运蛋白Slc39a14功能缺失突变(导致Mn超载)的斑马鱼中，也有类似的色素模式改变。从4 dpf中去除MnCl₂导致色素沉着模式正常化，这表明Mn水平与黑色素细胞的变化直接相关(图5b,c)。

我们观察到100µM MnCl₂暴露导致以异常游泳模式为特征的姿势缺陷。不同暴露时间的分析表明，随着MnCl₂暴露时间的延长，这些姿势缺陷在幼鱼中更明显(视频S1和S2)。暴露于2-4dpf的幼鱼在6dpf时恢复了色素沉着，也恢复了它们的运动行为，这表明至少一些锰的毒性作用是可逆的(图5b;视频S3-S5)。

运动行为分析表明，在探索过程中，MnCl₂处理的幼鱼在光照和黑暗中都较少游泳(图6a)。这些差异随着MnCl₂暴露时间的延长而增强。根据光照的不同，未暴露的幼鱼会调节它们的运动，在黑暗中倾向于较少移动，这与之前的研究一致，但暴露于MnCl₂的幼鱼没有表现出这种调节(图6a)。行为学分析提示其他运动参数存在差异，如平均回合速度和平均回合位移;然而，这些均无统计学显著性(图6b,c;表S4)。

为了评估接触MnCl₂的幼鱼是否表现出目标导向导航的缺陷，以及焦虑相关行为的潜在改变，我们对幼鱼进行了明暗偏好实验。当斑马鱼幼鱼被吸引到被照亮的区域时，它们表现出正的趋光性，迅速定位并向光源导航。此外，黑暗回避行为曾被用于测量焦虑相关表型MnCl₂。在6 dpf时，未暴露的鱼迅速游到行为区被照亮的区域，并在那里待到实验结束(5分钟)，暴露于MnCl₂从2-6 dpf和3-6 dpf的鱼显示在照明半场中花费的时间比例减少(图6d)。当暴露时间从2到6dpf较长时，这种缺陷更为明显。Mn 2-4 dpf暴露的鱼在6dpf时表现出与未暴露的鱼类似的行为(图6d)，这表明在去除MnCl₂后行为缺陷是可逆的，或者Mn的积累不足以引起毒性。

为了测试MnCl₂暴露是否会像之前在携带Slc39a14功能缺失突变的斑马鱼中观察到的那样影响视觉功能，我们检测了视动反应(OMR)，这是一种稳定反射，在这种反射中，鱼将自己定位并朝感知到的全视野视觉运动的方向游动。当受到向左和向右的全视野运动时，MnCl₂暴露和未暴露的鱼都根据感知的视觉运动方向调节它们的转向行为，这表明MnCl₂暴露未导致总体视觉缺陷(图6e，表S4)。

综上所述，MnCl2暴露会导致运动缺陷，其特征是姿势受损，回合启动减少，回合动力学改变，光偏好/暗回避受损，特别是在长时间的Mn暴露后，这表明可能存在焦虑表型。OMR的视觉功能似乎得到了保留。

鉴于人类活动导致的环境污染持续增加，锰过量暴露对人类健康和动物的影响是一个重要的公共卫生问题。我们的研究表明，斑马鱼幼鱼的MnCl₂过度暴露产生了一个稳定的疾病模型，暴露的幼鱼表现出明显的形态和行为缺陷。神经粒蛋白表达减少所提示的突触改变进一步将Mn过度暴露与神经元毒性联系起来。我们的结果支持了对锰进行严格的稳态控制以保护神经元功能的重要性。

我们的研究结果证实，在斑马鱼胚胎和幼鱼发育过程中，MnCl₂暴露会影响斑马鱼的存活率，暴露于500µM的幼鱼中，只有约60%的幼鱼存活超过5 dpf，这与之前的观察结果一致。锰的蓄积和毒性不仅取决于MnCl₂的浓度，还取决于暴露的时间和发育时间。早期发育阶段似乎对锰毒性特别敏感，导致大脑发育、神经元功能和行为缺陷。

我们的研究表明，MnCl₂暴露导致斑马鱼幼鱼的体长变短，眼睛和嗅觉器官的大小发生改变。其他生物如家畜、猪、家禽和小鼠暴露于锰后体长变短。

金属长期以来被认为是嗅觉毒物。Mn²⁺可被初级嗅觉神经元摄取，并通过这一途径进入大脑。我们观察到在暴露于MnCl₂的所有时期，嗅上皮的大小都在减少。这种减少似乎不是由于器官发生障碍造成的，因为嗅上皮已经分化，暴露于1.5~3.5 dpf的MnCl₂也会导致嗅上皮体积变小。因此，体积缩小可能是细胞死亡和/或细胞更新减少的结果，如其他金属。嗅上皮中不同类型的细胞对金属毒性的敏感性存在差异，纤毛嗅感觉神经元比微绒毛嗅感觉神经元更敏感。Mn是否也是如此还有待确定。我们的结果表明，暴露于MnCl₂后，与铜和锌毒性类似，存在影响嗅上皮尖突的形态学改变。锰暴露后斑马鱼神经突顶端结构发生改变，导致功能发生改变。嗅上皮的结构改变是否会导致功能改变将是未来研究的主题。

神经粒蛋白是神经退行性疾病中突触功能障碍的生物标志物，我们的工作表明，MnCl₂暴露降低了神经粒蛋白的免疫反应性。这与nrgnna和nrgnb表达的转录下调有关。这与其他研究表明锰暴露导致突触相关蛋白的改变是一致的。例如，突触黏附蛋白neurexin 2a mRNA水平的变化先前被认为与锰神经毒性有关。NRGN是一种钙调蛋白结合蛋白，其磷酸化依赖于细胞内Ca²⁺水平。NRGN磷酸化导致钙调蛋白释放，有利于长期增强而不是长期抑制。因此，Mn在斑马鱼体内过度暴露导致的NRGN减少可能会影响其他突触相关蛋白，包括谷氨酸受体、RNA结合蛋白、选择性离子通道等，最终影响突触可塑性的调节。Mn和其他金属干扰Ca²⁺稳态，这可能继发影响NRGN的表达。

我们证明，锰在斑马鱼早期的一些神经毒性作用是可逆的。这表明锰在神经变性之前引起突触功能障碍。之前的研究表明，在神经细胞培养和斑马鱼神经系统中，锰毒性会增加细胞凋亡。然而，与我们研究中使用的浓度相当的MnCl₂并没有显示slc39a14^−/−斑马鱼中凋亡细胞数量的变化。这进一步表明MnCl₂神经毒性在导致神经变性之前产生了神经元功能的缺陷。这也与从水中去除MnCl₂后，暴露于MnCl₂的幼鱼的运动缺陷在很大程度上是可逆的一致。

我们观察到MnCl₂暴露会导致斑马鱼幼鱼在光照和黑暗条件下的姿势缺陷、运动活动减少和异常游泳模式。我们的研究结果与先前的结果一致，也显示了游泳距离的减少和游泳模式的改变。虽然在我们的研究中没有进行分析，但锰暴露后鱼胚胎的姿势不稳定与神经肥大功能障碍有关，表明锰过度暴露后毛细胞不仅在结构上而且在功能上也会发生改变。此外，姿势稳定性与正常耳石发育密切相关。其他金属，如镉，已被证明通过干扰钙生理来干扰耳石发育，从而导致斑马鱼幼鱼的平衡控制和游泳活动受损。

除了姿势缺陷外，暴露于MnCl₂的幼鱼表现出运动输出减少，其特征是较少的回合启动。较长时间的MnCl₂暴露导致回合数逐渐减少，因此，在光明和黑暗条件下行进的距离都有所减少。在野生型鱼类中观察到的光和暗环境之间的行为调节不如锰处理的鱼类明显，这表明它们对环境变化的适应性较差。此外，在光/暗选择实验中观察到，暴露于MnCl₂的幼鱼表现出较低的光偏好和避暗行为。这不太可能是由于鱼检测光照差异的能力下降，因为尽管观察到眼睛大小的改变和异常的视觉背景适应，处理后的鱼没有表现出明显的OMR行为缺陷。虽然行为的改变可能反映了焦虑调节受损，但对环境刺激的普遍反应降低也可能是这一表型的基础，也支持黑暗环境转换后缺乏运动调节。虽然有证据表明锰毒性影响多种神经递质系统，如多巴胺能、谷氨酸能和gaba能信号传导，但锰如何干扰神经递质信号传导的机制仍有待确定。

综上所述，我们的工作表明，MnCl₂暴露导致斑马鱼幼鱼的锰神经毒性，其特征是不同的形态，运动和突触蛋白的变化，从而为进一步研究锰相关的神经生物学机制提供了一个疾病模型。

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