Chestnut Studying
摘要
Tumor-associated macrophages (TAMs) are a heterogeneous population of cells whose phenotypes and functions are shaped by factors that are incompletely understood. Herein, we asked when and where TAMs arise from blood monocytes and how they evolve during tumor development. We initiated pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) in inducible monocyte fate-mapping mice and combined single-cell transcriptomics and high-dimensional flow cytometry to profile the monocyte-to-TAM transition. We revealed that monocytes differentiate first into a transient intermediate population of TAMs that generates two longer-lived lineages of terminally differentiated TAMs with distinct gene expression profiles, phenotypes, and intratumoral localization. Transcriptome datasets and tumor samples from patients with PDAC evidenced parallel TAM populations in humans and their prognostic associations. These insights will support the design of new therapeutic strategies targeting TAMs in PDAC.
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是一类异质细胞群,其表型和功能受多种因素影响,目前尚不完全清楚。在此,我们研究了TAM何时何地从血液单核细胞中产生,以及它们在肿瘤发展过程中如何演变。我们在诱导性单核细胞命运追踪小鼠中诱发胰腺导管腺癌(PDAC),并采用单细胞转录组学和高维流式细胞术来分析单核细胞向TAM的转化过程。我们发现单核细胞首先分化成一种瞬时中间群体,即肿瘤辅助性巨噬细胞(TAM),该群体可产生两种具有不同基因表达谱、表型和肿瘤内定位的终末分化TAM。胰腺导管腺癌患者的转录组数据和肿瘤样本证实了人类中平行TAM群体的存在及其与预后的关联。这些发现将有助于设计针对胰腺导管腺癌中TAM的新治疗策略。
实验结果1
TAMs源自PDAC小鼠模型
为了量化胚胎前体细胞和循环单核细胞对胰腺癌TAM池的相对贡献,作者使用了Ms4a3 Cre x Rosa tdTomato小鼠,其中所有粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)衍生的循环单核细胞及其后代都稳定地标记有荧光,而胚胎衍生的巨噬细胞则没有。作者将Pdx1Cre LSL-KrasG12D LSL-Tp53R172H (KPC)细胞原位注射到这些小鼠的胰腺中,并在35天后对从肿瘤中分离出的免疫细胞(CD45+)进行单细胞转录组测序(图1A)。然后,作者测量了典型标记基因的表达,以对存在的免疫细胞群进行聚类和注释。正如预期的那样,tdTomato在所有中性粒细胞和一些单核吞噬细胞中表达,但在T、B或浆细胞群中不表达。在单核吞噬细胞群中,作者发现了三种细胞群:tdTomato+单核细胞(表达Ly6c2、Hp、S100a4和Plac8);巨噬细胞(表达Pf4、C1qa、C1qc和Arg1),其中约90 %为tdTomato+;树突状细胞(DCs;表达Clec10a、H2-Aa、H2-Dmb2和Ckb),其中约10%为tdTomato+(图1,B至E)。作者观察到,tdTomato-细胞(胚胎来源)表达特定于驻留组织巨噬细胞(RTM)的基因(例如Folr2和Timd4),而tdTomato+巨噬细胞(GMP来源)表现出更强的炎症表型(表达Il1b和Il6)(图1F)。基因本体(GO)分析表明,胚胎来源的TAM表达与细胞外基质重塑相关的基因,而单核细胞来源的TAM则表现出促炎性表达模式(图1G),这与之前在小鼠胰腺癌(11)中的研究结果一致。
实验结果2
单核细胞来源的TAM与胚胎来源的TAM不同
由于PDAC模型中的大多数TAM来自单核细胞,作者接下来使用Ms4a3 CreERT2 x Rosa tdTomato小鼠研究了这些肿瘤中单核细胞向巨噬细胞转化的动态过程。在该模型中,使用他莫昔芬治疗可诱导GMP衍生的短寿命循环Ly6Chi单核细胞表达tdTomato达6天,之后它们在循环中被新生成的tdTomato-细胞取代。作者按照上述方法注射了KPC细胞,然后在第17/18天给予他莫昔芬,在肿瘤生长中期诱导GMP标记,以测量已形成肿瘤中的单核细胞募集情况。在注射肿瘤细胞后35天,作者收集了肿瘤和对照健康胰腺,通过单细胞RNA-seq(图2A)表征存在的免疫细胞(tdTomato+和tdTomato-细胞)。作者重点关注单核吞噬细胞亚群。根据典型差异表达基因(DEG)对细胞簇进行注释后,作者确定了PDAC中富集的五个簇:单核细胞、TAM簇1至3和分裂细胞。单核细胞和TAM细胞聚集在一起,表明转录相似,但TAM细胞独特地表达特定标记,包括Arg1、Spp1和Mmp12。
作者重点关注富含胰腺导管腺癌的单核细胞和TAM群,分别用统一流形逼近和投影(UMAP)可视化这些亚群,并识别出差异表达基因(图2、B和C)。这些细胞群与之前描述的亚群高度相似,其中TAM1s代表表达Tnf和Ccr2的单核细胞样TAMs,TAM2s与缺氧巨噬细胞相似,TAM3s与之前描述的脂质相关巨噬细胞(LAMs)相似。为了确定这些群集之间的发育关系,作者应用了scVelo拼接分析工具,发现单核细胞可能产生TAM1,然后分化成TAM2或TAM3(图2D)。这些发现可以用细胞谱系和假时推断工具Slingshot(图2E)进行概括。因此,TAM1细胞代表一种离散但短暂的转录状态,可能构成单核细胞和TAM2/TAM3分化之间的中间阶段(图2F)。
为了验证这一假设,作者利用模型的时间标记功能,比较了每个TAM群中tdTomato+细胞的比例。作者发现标记的TAM1比TAM2或TAM3少,这证实了后者主要来自在17/18天激活tdTomato标记后不久募集的单核细胞,而到第35天,TAM1群体主要来自最近募集的tdTomato-单核细胞(图2,G和H)。正如预期的那样,在肿瘤采集时,单核细胞大多为tdTomato-,这证实了它们的寿命短,并且不断由GMP补充。因此,通过将单细胞转录组测序与单核细胞时间标记相结合,作者揭示了单核细胞向TAM过渡的瞬态细胞状态,以及随后分化成两个不同的TAM群。
实验结果3
高通量筛选可识别与单核细胞和TAM亚群相关的表面标记物
为了进一步研究和验证这些TAM簇,作者使用Infinity Flow管道评估单核细胞和TAM1至TAM3的表面标记物的表达。作者首先将KPC细胞注射到Ms4a3CreERT2 x RosatdTomato小鼠的胰腺中;在肿瘤形成的早期(第14/15天)、中期(第21/22天) 或晚期(第28/29天)阶段,用他莫昔芬处理;然后在第35天收集、标记和标记肿瘤细胞,以评估流式细胞仪可检测的270种蛋白质的表面表达(图3A)。
单核细胞和TAM的tdTomato标记呈现出预期的模式:在晚期他莫昔芬治疗后,标记的单核细胞(Ly6C+)明显可见,证实了它们的寿命很短,而TAM(CD64+ F4/80+)标记不太明显,反映了肿瘤中单核细胞向巨噬细胞的持续过渡。仅考虑tdTomato+单核细胞和TAM,作者根据流式细胞术数据生成UMAP,并根据基因模式(图2)和蛋白质表达(图3B)的相似性,将四个簇标记为单核细胞和TAM1至TAM3。因此,作者将单核细胞定义为Ly6C+,TAM1s定义为CCR2+ CD64+,TAM2s定义为CD73+,TAM3s定义为CD36+ CD11c+细胞(图3C)。利用这些标记物,作者制定了一种基于有限表面标记物的门控策略,通过常规的流式细胞光谱仪检测目标细胞群,从而区分单核细胞、TAM1、TAM2和TAM3(图3D)。为了验证这种分选策略的准确性并验证作者的scRNA-seq,作者对Ly6C+单核细胞、TAM1、TAM2和TAM3进行了分选,并通过整体RNA测序对其进行了分析。当将它们的特征投射回scRNA-seq数据时,每个分选群体都有与其各自感兴趣的簇相对应的独特的转录谱。然后,作者比较了所有tdTomato+单核吞噬细胞中每个群体在不同时间点的相对丰度,发现单核细胞和时间标记的晚期单核细胞中单核细胞和TAM1的含量较高。相比之下,早期阶段几乎完全由TAM2和TAM3组成(图3,E和F)。通过对这些表面标记数据进行Slingshot分析,也证实了单核细胞向瞬态TAM1状态以及随后的TAM2和TAM3状态的演变轨迹(图3,G和H)。这些结果验证了基因表达产生的结果,并在蛋白质水平上证实了单核细胞与不同TAM亚群之间的时间关系。由于TAM1亚群是更稳定的TAM2和TAM3巨噬细胞亚群的中间前体,作者建议将这些细胞命名为中间TAM(IntTAM)。
实验结果4
IntTAMs 产生 TAM2s 和 TAM3s,它们由 Maf 进行差异调节
接下来,作者探索了单核细胞和TAM亚群在胰腺癌发展过程中的相对比例变化。正如预期的那样,与相邻/健康的胰腺相比,肿瘤中的单核细胞、IntTAM、TAM2和TAM3更为丰富。然而,这些群体在肿瘤发展过程中表现出动态变化: 肿瘤形成后7天,IntTAM数量达到峰值,而TAM2和TAM3的数量随着肿瘤的发展而增加,这与作者关于它们从IntTAM依次分化的假设一致。
为了进一步验证TAM群落对单核细胞分化的依赖性,作者将KPC细胞原位注射到Ccr2基因敲除(KO)小鼠体内。在接种3周后,作者发现与野生型(WT)小鼠相比,Ccr2-KO小鼠体内的单核细胞、IntTAM、TAM2和TAM3均减少,但RTM没有减少。为了精确定义单核细胞向TAM的转化,作者在不同时间点用他莫昔芬处理携带PDAC的Ms4a3CreERT2 x RosatdTomato小鼠,以提供连续的单核细胞时间标记,然后对肿瘤样本应用常规的流式细胞仪门控策略(图4A)。IntTAMs大多在晚期他莫昔芬诱导后标记,表明最近被招募(图4B)。相反,TAM2s和TAM3s(在较小程度上)大多在早期诱导后标记,表明它们存活时间长,且与早期招募的单核细胞不同(图4B)。如上所述,先前的研究报道了在包括癌症在内的多种疾病中存在一种名为LAM的Trem2表达巨噬细胞。根据作者的基因和蛋白表达数据,作者推测TAM3相当于这些TREM2+ LAM。作者通过在Trem2EGFP报告基因小鼠中诱发胰腺癌来检验这一假设,发现TAM3被特异性标记(图S6,B和C)。
为了验证IntTAMs分化成TAM2s和TAM3s的可能性,作者从肿瘤移植CD45.2小鼠(原位肿瘤注射后21天)中分离出IntTAMs,并将其肿瘤内移植到肿瘤移植CD45.1小鼠(原位肿瘤注射后21天)体内。作者使用流式细胞术分析了移植后第3天和第7天的CD45.2+细胞的后代(图4C)。大多数CD45.2+细胞在移植后的第3天仍为IntTAMs,但到第7天已转化为TAM2s和TAM3s(图4D),证实了IntTAMs具有同时产生TAM2s和TAM3s的潜力。
为了更好地理解胰腺癌中单核细胞、IntTAM、TAM2和TAM3的转录组特性和推测功能,作者将SCENIC分析工具应用于作者的scRNA-seq数据,根据基因表达预测转录因子的活性。该分析揭示了不同细胞群中不同的调控子: 单核细胞优先使用Irf1和Klf3相关基因,而IntTAMs则使用与Fosl2相关的基因;TAM2s使用Maf和Irf8相关基因,TAM3s使用与Bhlhe41相关的基因(图4E)。在确定Maf是TAM2分化的潜在调节因子后,作者使用LysMcre x Mafflox小鼠模型来研究TAM分化是否发生了改变。Maf缺陷型骨髓细胞小鼠的TAM2数量显著减少,但肿瘤生长没有变化(图4,F和G)。这些结果表明,靶向转录因子可以调节TAM亚群的分化。
实验结果5
IntTAM、TAM2和TAM3具有不同的运动和细胞相互作用特征
为了进一步了解TAM亚群的功能潜力,作者使用MetaScape进行了GO分析。IntTAM表达的基因与趋化作用有关,TAM2表达的基因与缺氧有关,TAM3表达的基因与脂蛋白反应有关。鉴于单核细胞向TAM分化过程中这些途径的基因评分不断变化,似乎IntTAM在从单核细胞分化时开始表达趋化相关的程序,大概是为了使其能够在肿瘤内迁移到初始程序逐渐被TAM2的缺氧相关特征或TAM3的脂蛋白反应相关特征所取代的位置。
为了进一步研究IntTAM的预测作用,作者对单核细胞、IntTAM、TAM2和TAM3进行了分类,并测量了它们的运动能力。单核细胞的运动能力最强,IntTAM的运动能力居中,TAM2和TAM3的运动能力相对较弱。这些结果表明,在单核细胞向巨噬细胞过渡的过程中,IntTAM表现出中等迁移能力,与长寿命的分化TAM2和TAM3相比,仍然具有迁移能力。一旦IntTAM穿过组织并进一步成熟,从而失去其迁移能力,作者质疑空间定位的作用是否会影响TAM亚群的功能特征。为此,作者使用单细胞转录组测序数据,并将其与公开可用的单细胞转录组测序数据集整合,以预测不同亚群与TME其他成分之间的相互作用。为了识别单核细胞、IntTAM、TAM2和TAM3的输出和输入相互作用,作者计算了细胞类型之间显著相互作用的数目,并发现了不同的偏好相互作用。这些结果表明,不同的TAM群可以在特定的肿瘤微环境中与不同的细胞类型相互作用,从而受到不同的影响和微环境因素的影响,这些因素可能会影响它们的分化和功能特征。
实验结果6
TAM2和TAM3与PDAC中不同的空间位点相关联
由于作者的基因评分分析表明胰腺导管腺癌中TAM群体可能存在不同的定位和功能分化,作者接下来通过分析最近发表的胰腺导管腺癌肿瘤切片空间转录组学数据(Visium,10x Genomics)(图5A),来探究是否存在体内证据。利用贝叶斯空间联合聚类,作者确定了七个不同的空间簇,分别对应于与不同基因表达和假定功能相关的七个肿瘤微环境(图5,B和C): 第1组与缺氧有关,第3组与细胞呼吸有关,第4组与RNA剪接有关,第5组与炎症反应有关,第6组与端粒延长有关,第7组与细胞周期有关,而第2组由于仅限于坏死区域且测序数据质量较低而被排除在分析之外(图5C)。作者使用BayesSpace软件预测了与每种细胞类型相关的基因,以预测肿瘤中多种免疫和非免疫细胞类型。作者还预测了IntTAM、TAM2和TAM3的基因特征(图5D),并测量了它们在不同组织切片中的比例。TAM2在1号簇缺氧组织的所有组织切片中的含量显著增加,表明低氧水平与TAM2程序之间存在关联(图5,E和F)。观察到TAM2和TAM3相互排斥。因此,这些结果表明,分化的TAM2和TAM3群体在肿瘤中占据不同的位置。
为了验证这些细胞群在蛋白质水平上的分布,作者使用支持共检测(CODEX)的高维组织学。首先,作者使用苏木精和伊红(H&E)染色对肿瘤区域进行注释。接下来,作者使用58个参数的染色试剂盒,使用常见的标记物和流式细胞术先前确定的门控策略来鉴定细胞类型(图5G)。CODEX分析显示,TAM2更靠近肿瘤坏死核心,而TAM3则远离肿瘤核心(图5H),这与作者的空间转录组分析结果一致。为了确定TAM与TME之间的细胞相互作用,作者确定了每个TAM群落存在的区域。区域1富含IntTAMs,区域2富含单核细胞,区域3富含TAM2,区域4富含TAM3。在区域3和区域4中,成纤维细胞、中性粒细胞和B细胞与TAM2频繁相互作用,而TAM3与癌细胞、自然杀伤(NK)/T细胞和DC相互作用。TAM2与中性粒细胞的相互作用与最近的发现相吻合,即肿瘤的缺氧区域也可以重新编程中性粒细胞,从而影响其功能。这些观察结果综合了时间和空间维度,揭示了胰腺癌中募集的单核细胞的命运,突出了瞬态IntTAM群,该群产生两种不同的稳定TAM群,它们占据TME中的不同位置,表现出与不同功能专业化相一致的基因表达模式。
实验结果7
人类PDAC包含TAM亚群,其在转录和空间上与小鼠TAM相对应
最后,作者评估了胰腺导管腺癌患者体内是否存在类似巨噬细胞群。利用公开可用的胰腺导管腺癌和相邻健康胰腺的scRNA-seq数据,作者识别出了单核吞噬细胞并应用了聚类分析(图6A)。这揭示了一个单核细胞群和八个人类TAM群(Hu.TAMs a至h)(图6B),它们具有不同的转录组特征,在代表96名患者的每个数据集中均可识别。在肿瘤组织中,与相邻的健康组织相比,Hu.TAMs a至f的含量更高(图6C)。然后,作者进行了标记转移配对分析,发现小鼠和人类单核细胞、小鼠IntTAM和Hu.TAM a、小鼠TAM2和Hu.TAM b/c以及小鼠TAM3和Hu.TAM d/e之间存在显著的转录相似性(图6D)。作者没有发现Hu.TAM f群的同源物,这表明物种特异性值得进一步研究TAM群。当作者将小鼠和人类胰腺癌单核细胞和TAM的差异表达基因进行预测时,作者观察到物种间聚类中相似的基因表达(图6E),以及配对群组间保守的功能通路。
为了确定单核细胞来源的TAM在人类胰腺癌中是否具有相似的分化轨迹,作者使用PAGA预测单核细胞向TAM的分化途径。作者发现单核细胞首先连接到Hu.TAM a,然后进一步分化成不同的TAM(图6F)。此外,通过伪时间分析,作者观察到单核细胞先分化成Hu.TAM a,然后进一步分化成Hu.TAMs b/c或Hu.TAMs d/e,并确定了与每个群体相关的基因(图6G)。为了进一步证实这些观察结果,作者预测了用M-CSF处理0、3、9、24和48小时的人单核细胞中的差异表达基因。作者发现,最初,单核细胞表现出其经典特征,3小时后,该特征与Hu.TAM a重叠。随后的时间点显示与不同的Hu.TAM群体重叠,进一步支持Hu.TAM a首先出现并导致其他Hu.TAM群体的出现。
作者使用公开可用的PDAC NanoString数字空间分析仪(DSP)数据集(GSE199102),该数据集可对组织切片上感兴趣区域(ROI)内的肿瘤(PanCK+)和免疫(CD45+)细胞进行转录组学表征,然后预测胰腺导管腺癌组织不同部位是否存在巨噬细胞特征。作者解卷积每个ROI中的CD45+部分,使用每个群体的DEG来评估单核细胞、Hu.TAM a、Hu.TAMs b/c和Hu.TAMs d/e的存在。同时,作者使用基因集富集分析(GSEA)中公开的基因集追踪PanCK+部分中的缺氧或脂质代谢特征。然后,作者将这两个层面联系起来,以确定TAM群体和环境肿瘤表型之间的任何关联。正如在小鼠胰腺癌中观察到的,作者发现缺氧评分高的肿瘤区域也具有较高的Hu.TAMs b/c特征,而其他TAM群体的定位与不同的功能特征没有显著关系。
基于这种转录同源性,作者利用小鼠表面标记物分析来定义Hu.TAM亚群的假定标记物。作者对人类胰腺导管腺癌组织的存活区和坏死区进行了注释,并确定了Hu.TAM a(CCR2+ CD68+)、Hu.TAMs b/c(CD68+ CD73+)和Hu.TAMs d/e(CD68+ TREM2+)(图7,A和B)。在肿瘤切片上,这些细胞群位于不同的区域,其中Hu.TAMs b/c在坏死肿瘤中含量较高(图7C)。此外,通过研究一个TAM细胞群与另一个TAM细胞群的接近程度,作者发现Hu.TAMs b/c和Hu.TAMs d/e彼此之间的距离较远,表明它们的空间分离模式与小鼠胰腺癌中的分离模式类似(图7D)。
最后,作者探索了TAM亚群特异性/相关基因的表达是否与PDAC患者的预后相关。作者使用Dirichlet-多变量回归法对单核细胞和Hu.TAM丰度进行了标准化,比较了患者对标准PDAC治疗(FOLFIRINOX、5-FU、放疗和少量患者中的洛沙坦)的反应。作者发现,大多数Hu.TAM群在治疗后减少;然而,在反应不佳的患者中,作者观察到Hu.TAM c、d和e的丰度持续存在。此外,作者使用癌症基因组图谱(TCGA)数据库筛选了每个TAM群体中30个差异表达基因(DEG),发现Hu.TAM b/c标志物的高表达与胰腺癌患者生存期缩短显著相关(图7E)。这些结果表明,不同TAM群体的丰度可用作患者预后的工具。
