【文献解读】PP2A调节因子IER5L支持前列腺癌进展

影响因子：8.1

前列腺癌的发病率高，是癌症相关死亡的主要原因。发现和表征侵袭性前列腺癌的分子决定因素是一个活跃的研究领域。即刻早期反应（IER）基因家族调控蛋白磷酸酶2A（PP2A）活性，已成为影响癌症生物学的因素之一。在这项研究中，我们发现较少研究的该家族成员——即刻早期反应5类似蛋白（IER5L）在侵袭性前列腺癌中上调。有趣的是，IER5L表达的上调在前列腺癌中的转移性疾病中表现出显著的关联，并在其他癌症类型中得到了重复验证。与这一观察结果一致，IER5L沉默减少了多种人类和小鼠前列腺癌细胞系的焦点形成、迁移和侵袭能力。在体内，通过使用斑马鱼和免疫缺陷小鼠模型，我们证明了IER5L沉默减少了前列腺癌肿瘤的生长、扩散和转移。在机制上，我们描述了IER5L沉默细胞的转录组和蛋白质组景观。该方法使我们能够通过与PP2A调控一致的途径识别DNA复制和单体G蛋白调节器作为IER5L的下游程序。总而言之，我们报告了IER5L在前列腺癌及其他癌症中的改变，并提供了其对肿瘤侵袭性贡献的生物学和分子证据。

据估计，每年有近1000万人死于癌症。个体癌症的预后高度可变，取决于肿瘤类型、等级和初次诊断时的阶段。基因组变化、基因表达水平和蛋白质结构或功能的改变可以用作分子标志物，在复发发生之前预测患者的结果。识别这些预后特征对于预测患者的疾病轨迹并克服由转移导致的高死亡率至关重要。在不同的肿瘤类型中，前列腺癌（PCa）是男性中第二常见的癌症，每年导致全球超过35万人死亡。转移是与这种疾病相关的发病率和死亡率的主要原因。虽然由于早期检测和一线治疗的有效性增加，局限性肿瘤患者的预期寿命显著提高，但识别高复发风险患者仍然是一个挑战，因为难以确定区分侵袭性前列腺癌与惰性前列腺癌的特定分子变化。

即刻早期反应（IER）家族基因编码了一系列参与细胞分化、代谢和增殖等多种细胞功能的因子。IER家族基因是细胞周期调控的，其蛋白质产物通常不稳定，并迅速被靶向进行蛋白酶体降解。然而，许多肿瘤类型表现出IER基因的异常高表达。即刻早期反应2（IER2）、即刻早期反应5（IER5）和即刻早期反应5类似蛋白（IER5L）是该家族中在N端区域具有同源性的三个成员。所有三种蛋白质都通过其N端区域与蛋白磷酸酶2A（PP2A）的B55调节亚基相互作用。它们还与PP2A的靶蛋白结合，并协助PP2A介导的去磷酸化。有趣的是，据报道IER2和IER5都对肿瘤进展有贡献。高IER5水平通过在应激条件下维持增殖来诱导异常的热休克转录因子1（HSF1）活性。同样，IER2被认为参与多种癌症类型中的肿瘤形成过程，如细胞运动和粘附、血管生成、侵袭和转移。与IER2和IER5不同，IER5L在癌症侵袭性中的作用研究较少。

在这项研究中，我们利用公共转录组数据集的生物信息学分析，发现IER家族基因中IER5L表达与肿瘤病理、进展和转移之间存在一致且独特的关联。我们的结果显示，IER5L是一个预后基因，其表达在不同癌症类型中上调，特别是在转移性前列腺癌中显著上调。利用细胞系统，我们发现IER5L维持了前列腺癌细胞在应激条件下的增殖、迁移和侵袭能力，其缺失在体内通过斑马鱼和小鼠模型抑制了肿瘤生长和扩散。在机制上，IER5L沉默引起的分子改变与PP2A抑制和单体G蛋白调节器的下游程序的抑制一致。总之，我们揭示了IER5L作为一个新的IER家族基因在前列腺癌进展中的调控作用。

材料与方法

PC3和DU145细胞购自Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，提供了相应的认证证书。22RV1细胞购自American Type Culture Collection，提供了认证证书。TRAMP-C1细胞系由Marco Piva博士提供。PC3、DU145、HEK293FT和TRAMP-C1细胞培养在含有10%灭活胎牛血清（FBS）（Gibco™；10270-106）和1%青霉素/链霉素（Gibco™；15140-122）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Gibco™；41966-029）中。22RV1细胞培养在含有10%灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的Roswell Park Memorial Institute（RPMI 1640；11875-093）培养基中。TRAMP-C1细胞使用10%抗生素-抗真菌剂（Gibco™；15240062）代替青霉素/链霉素。细胞系常规使用MycoAlert检测试剂盒（Lonza；LT07-318）检测支原体污染。

1 × 10^6 PC3细胞反向转染Lipofectamine 2000（ThermoFisher；11668027）和20 nM指定的小干扰RNA（siRNA）（Sigma-Aldrich），按照制造商指南操作。使用4条序列的混合物靶向IER5L。并行使用4条非靶向siRNA作为对照。单独的siRNA用于ARHGEF1和RCC2实验。所有序列详见补充表S5。

HEK293FT细胞用于慢病毒生产。表达针对人和小鼠Scramble和IER5L的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒载体购自Sigma-Aldrich。细胞按照标准程序转染慢病毒载体。使用嘌呤霉素（2 μg/ml；Sigma-Aldrich；P8833）进行选择。shRNA序列详见补充表S6。

使用Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit(Promega；AS1390)提取总RNA。从1 μg RNA使用Maxima™ H Minus cDNA合成主混合物(Invitrogen；M1682)生成互补DNA。扩增在Viia7、QS5或QS6实时PCR系统(Applied Biosystems)中运行，使用来自Life Technologies的以下Taqman探针：

PTGES3(Hs04187819_g1)

使用通用探针库（Roche，瑞士巴塞尔）引物和探针(Roche；ThermoFisher)检测FOS：正向(ctaccactcacccgcagact)，反向(aggtccgtgcagaagtcct)和探针编号67。个别基因的表达计算并归一化到GAPDH/Gapdh(Hs02758991_g1/Mm99999915_g1)或β-Actin(Mm00607939_s1)，如所示。

增殖实验 将五千个细胞以三次重复的方式接种在12孔板中。细胞在0、3和6天后用10%福尔马林（Avantor）固定，并用0.1%结晶紫（0.1% 结晶紫在20%甲醇中；Sigma-Aldrich）染色30分钟。

焦点形成实验 将五百个细胞/孔接种在6孔板中，以三次重复的方式。10天后用10%福尔马林（Avantor）固定细胞，并用0.1%结晶紫（Sigma-Aldrich）在20%甲醇中染色。手动计数可见的焦点数量。

无锚定生长 通过软琼脂克隆形成实验测量无锚定生长能力。简要地，将六孔组织培养皿底部涂上一层琼脂（含有0.6%琼脂的完整DMEM），并在4°C储存≥30分钟以使琼脂固化。将细胞（TRAMP-C1：375个细胞/孔，PC3：2500个细胞/孔）重悬在0.3%低熔点琼脂（Agarose LM, Conda）中，并涂在底部琼脂上。培养皿在37°C和5% CO2中孵育3周以生长克隆。使用Olympus IX-83倒置显微镜操作CellSens软件成像，并使用Fiji软件计数可见克隆数。

伤口愈合实验 伤口愈合实验通过在6孔板中以高密度接种2 × 10^5个细胞进行。一支20 µL移液器吸头用于划伤细胞单层。在0、24和32小时拍摄图像，使用Olympus IX-83倒置显微镜操作CellSens软件。通过计算伤口闭合的线性增长并将斜率除以初始划痕面积的2倍来测量细胞迁移率。实验以三次重复的方式进行。使用Fiji软件量化划痕面积。

侵袭生长实验 准备含6%甲基纤维素（Sigma-Aldrich；M0387）和DMEM的700个细胞滴，体积为25 µL。滴液在37°C和5% CO2中孵育48小时。形成后，将球体收集并重悬于胶原I溶液（Advanced BioMatrix PureCol；5005）中，并加入12孔板。每种条件进行五次实验重复。4小时后，加入培养基，并在0和72小时拍摄图像，使用Olympus IX-83倒置显微镜操作CellSens软件。侵袭生长通过计算第0天和第3天的面积差异来测量，使用Fiji软件。

斑马鱼 斑马鱼实验按之前描述的进行。简而言之，将230个稳定表达GFP-荧光素酶（GL）的PC3细胞重悬于PBS中，浓度为0.5 × 10^8个细胞/ml。48小时孵育的斑马鱼胚胎（Casper品系）用tricaine麻醉，并安装在琼脂中，心包腔注射4.6 nl癌细胞（约230个细胞/胚胎）。注射后，将异种移植胚胎放置在含0.2 mM N-Phenylthiourea（Sigma-Aldrich；P7629）和青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich；P4333）的E3培养基中，在33°C孵育。过夜孵育后，将胚胎麻醉，并将GFP阳性且注射成功的胚胎放入96孔板中进行成像（每孔1个胚胎）。使用Nikon Eclipse Ti2-E宽场显微镜，2× Plan-Apochromat物镜（NA0.06），荧光（ex475/28 nm LED，Chroma 84000v2 DAPI/FITC/TRITC/Cy5 Quad滤光片）和明场照明。手动计数扩散细胞的数量，使用Fiji软件。

小鼠 所有小鼠实验均按照CIC bioGUNE生物安全和动物福利委员会制定的伦理指南进行。所采用的程序遵循实验动物护理和使用国际评估和认证协会（AAALAC）的建议。对于原位实验，将5 × 10^5个表达shScramble或sh2 IER5L的PC3-GL细胞注射到10只6-12周龄的雄性Nu/Nu免疫缺陷小鼠的腹前叶。一个小鼠在操作过程中死亡。其余9只Nu/Nu小鼠的肿瘤生长和扩散通过体内生物发光成像技术（IVIS，PerkinElmer）监测20天。在随访过程中通过眼眶内注射50 µL，浓度为15 mg/mL的荧光素进行生物发光成像。生物发光信号和实验终点时的肿瘤重量被测量。通过体外检测小鼠器官中的细胞扩散。生物发光信号超过10^7被认为是转移病变阳性。

RNA-Seq和蛋白质组学分析的样本平行种植。种植了四个100 mm培养皿的shScramble或sh2 IER5L细胞，达到80%的汇合度。使用Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit（Promega；AS1390）提取RNA，并在Genomics平台进行RNA QC后，使用TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Globin kit（Illumina Inc.，Cat.# 20020612）和TruSeq RNA CD Index Plate（Illumina Inc.，Cat.# 20019792）制备总RNA文库，遵循“TruSeq Stranded Total RNA Sample Prep-guide（Part # 15031048 Rev. E）”指南。文库在Illumina NovaSeq 6000仪器上测序，以生成至少4000万对100 bp读长的读取。

读取通过STAR（version_2.7.5c）在两次通过模式下比对到人类参考基因组（hg38），遵循STAR最佳实践和推荐。数据质量使用STAR（version 2.7.5c）和samtools（version 1.15）评估。PCR重复通过samtools（version 1.15）从比对的bam文件中去除。读取计数通过subread的FeatureCounts（version 2.0.3）从比对的bam文件中提取。读取计数的归一化按照EdgeR推荐的方法进行，使用方差比方法，该方法考虑了样本间的差异，并在R环境（version 3.6.0）中遵循EdgeR和Limma的最佳实践和推荐进行归一化读取计数的差异表达分析。用于数据分析的所有代码可根据要求提供。使用FDR < 0.05和log2倍数变化（FC）为0.5来选择差异表达基因（DEGs）。

样本制备 用于蛋白质组学分析的样本中提取了20 µg的蛋白质，使用含7 M尿素、2 M硫脲、4% 3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐（CHAPS）和5 mM二硫苏糖醇（DTT）的缓冲液。蛋白质提取物按照Wisniewski等人描述的滤膜辅助FASP协议（带有轻微修改）进行消化。胰蛋白酶按胰蛋白酶：蛋白质比1:20加入，混合物在37°C下孵育过夜，在RVC2 25离心浓缩仪（Christ）中干燥，并重悬于0.1%甲酸中。肽段使用C18柱（Millipore）进行脱盐和重悬于0.1%甲酸中。

用于磷酸蛋白质组学分析的样本按上述FASP协议处理后，使用高选择性TiO2磷酸肽富集试剂盒（ThermoFisher）纯化磷酸肽，按照制造商说明操作。样品直接加载到质谱仪上。

质谱分析 样品在带PASEF的timsTOF Pro（Bruker Daltonics）上分析，在线连接到Evosep ONE（Evosep）液相色谱仪。总蛋白样品加载在0.1%甲酸中，而磷酸蛋白质组学样品直接加载在含约5% TFA的溶液中。这两种样品类型均使用30样品/天方案（15 cm柱和44分钟梯度运行）分离。

蛋白质和磷酸肽的鉴定和定量 蛋白质的鉴定和定量使用PEAKS X软件（Bioinformatics solutions）进行。搜索针对Homo sapiens条目（Uniprot/Swissprot）进行，前体和碎片的公差分别为20 ppm和0.05 Da。半胱氨酸的羧酰胺化作为固定修饰，甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。在磷酸蛋白质组学数据集中，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化被认为是可变修饰。

从PEAKS推断出的蛋白质或磷酸肽丰度加载到Perseus平台中。这些值被log2转换，且仅考虑在任何分析组中至少70%的样本中存在的蛋白质或磷酸肽。使用每个样本中最少10%丰度的蛋白质或磷酸肽的值进行缺失值填补。

数据分析和功能富集分析 在每个分析组内使用t检验（p < 0.05）分析蛋白质，使用t检验（q值 < 0.05）分析磷酸肽。使用log2 FC为0.5和log 2 FC为1分别识别IER5L沉默引起的蛋白质和磷酸肽。

使用Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery（DAVID）网络界面对分子改变进行功能富集分析。我们的蛋白质组学分析中鉴定的整个蛋白质列表用作KEGG分析的背景。在DAVID中使用Homo sapiens作为背景进行Reactoma分析。

没有使用统计方法预先确定样本大小。实验未随机化。分配实验期间实验者未被蒙蔽。没有样本/动物被排除在分析之外。使用参数检验分析的数据由汇总实验的平均值 ± SEM表示，除非另有说明。n值表示进行的独立实验次数或单个小鼠或患者标本的数量。对于每个独立的体外实验，至少进行了三个技术重复，并进行了至少三个实验以确保足够的统计能力。在体外实验中，假设正态分布，并对一组分量的比较应用单样本t检验，对两组分量的比较应用学生t检验。对于体内实验，使用非参数Mann-Whitney U检验。对于无预测结果的实验设计，使用双尾统计分析，对于验证或假设驱动的实验，使用单尾统计分析。所有统计分析的置信水平为0.95（alpha值 = 0.05）。p值：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

结果

为了分析IER家族成员（IER2、IER5和IER5L）与肿瘤病理和进展的关联，我们利用CancerTool分析了包含不同肿瘤类型基因表达数据的公共转录组数据集（补充表S1）。IER2和IER5在部分前列腺癌、结直肠癌和肺癌数据集中表达发生了改变，但在不同肿瘤类型中没有表现出方向上的一致性（补充图S1）。相比之下，IER5L在结直肠癌（2/2数据集）、肺腺癌（1/1数据集）和前列腺癌（2/4数据集）肿瘤标本中相对于非癌组织一致上调（图1a），这与最近的报道一致。为了进一步探讨IER5L水平的增加是否是不同肿瘤类型的共同特征，我们利用TIMER网络界面，探索了癌症相关的TCGA队列中的改变。IER5L水平在不同癌症类型中一致增加（在前列腺癌中有类似但不显著的趋势），而IER2表达在很大程度上减少，IER5表现出不一致的变化（补充图S2）。 

不同于其他数据集，CancerTool中包含的前列腺癌数据集包括转移样本的基因表达信息。为了阐明IER家族基因在转移标本中的表达变化，我们比较了56个转移样本和200个原发性肿瘤的基因表达。值得注意的是，IER5L在4个前列腺癌数据集中的3个转移样本中增加（图1b），而IER2表达主要减少，IER5没有表现出一致的模式（补充图S3）。

接下来，利用各种数据集中的临床随访信息，我们通过无疾病生存期（DFS）分析了IER基因家族的预后潜力。有趣的是，在家族成员中，IER5L上调时表现出最显著的预后能力（图1c，补充图S4）。考虑到在各种病理情况下IER5L上调的高度一致性以及其在癌症中作用的有限信息，我们决定利用前列腺癌作为研究其生物学和分子功能的肿瘤类型。

为了测试IER5L在前列腺癌侵袭性中的作用，我们分析了体外IER5L沉默的生物学后果。通过小干扰RNA（siRNA）转染或短发夹RNA（shRNA）转导减少IER5L mRNA水平并未影响PC3细胞的总体生长（补充图S5a, b）。相比之下，当减少IER5L水平的细胞被迫单独生长时，它们在焦点形成实验中的克隆形成能力较低（图2a, b）。这一结果在另外两个人前列腺癌细胞系（DU145和22RV1）和一个小鼠前列腺癌细胞系（TRAMP-C1）中得到了重复验证（图2c, d，补充图S5c-f）。同样，IER5L沉默也削弱了人和小鼠前列腺癌细胞在无锚定情况下的生长能力（图2e，补充图S5g）。值得注意的是，两个人IER5L靶向shRNA的沉默效率与比例肿瘤抑制表型相关（图2，补充图S5）。此外，符合IER5L在维持细胞增殖中的基本作用，其沉默在传代过程中逐渐丧失（补充图S5h），这表明沉默细胞在体外负选择，使我们无法生成基于CRISPR/Cas9的IER5L敲除细胞。

除了在应激条件下的生长能力外，转移细胞通常获得迁移和侵袭能力，从而促进其转移潜力。因此，我们确定了IER5L对PC3细胞这些过程的贡献。一方面，在前列腺癌细胞中转染IER5L靶向siRNA减少了它们在伤口愈合实验中的迁移率（图2f）。另一方面，IER5L沉默减少了PC3细胞在胶原基质中球体实验中的侵袭能力，这在IER5L沉默程度最大的细胞中显著（图2g，补充图S5b）。总之，这些数据表明IER5L在前列腺癌中维持侵袭性特性。

我们的生物信息学分析揭示了IER5L上调与癌症进展的关联（图1）。此外，体外实验表明IER5L对在应激条件下的细胞生长、迁移和侵袭的必要性。因此，我们设计了体内策略，能够监测所有这些不同的参数。作为第一种方法，我们利用斑马鱼模型评估IER5L对前列腺癌细胞在体内扩散的因果贡献。年轻胚胎的透明性、缺乏免疫系统以及快速形成原发性肿瘤和转移的能力，使斑马鱼成为研究肿瘤细胞从原发部位扩散的合适且有吸引力的模型。稳定表达GFP-荧光素酶（GL）的PC3细胞转导了shScramble或shIER5L并注射到斑马鱼胚胎的心包腔中。在注射后4天分析扩散细胞的数量（图3a）。如图3b, c所示，在该模型中，IER5L的沉默显著减少了PC3细胞的扩散能力。

为了进一步验证IER5L对前列腺癌细胞生长和扩散的因果贡献，我们进行了体内原位实验，其中PC3-GL细胞转导了Scramble或IER5L靶向shRNA（图4a）。表达荧光素酶的细胞随后被注射到免疫缺陷裸鼠的腹叶中，并通过体内成像监测肿瘤质量20天。IER5L沉默细胞在整个实验过程中显示出较低的荧光素酶信号（图4b, c），这与实验终点时较低的原发性肿瘤重量相关（图4d）。重要的是，远处器官中的荧光素酶信号分析证实了注射IER5L沉默前列腺癌细胞的小鼠中较低的转移负担。这一表型在包括肋骨和股骨的骨骼中更为显著（图4e, f，补充图S6）。

总之，这些数据强调了IER5L在维持前列腺癌细胞转移特性中的重要性。

为了深入了解IER5L对侵袭性特征获得的分子机制，我们研究了IER5L沉默引起的转录组和蛋白质组改变。转导了IER5L靶向shRNA的PC3细胞在转录景观上表现出显著变化（GSE249359，补充表S2，补充图S7a）。通过比较转导了shScramble或shIER5L的PC3细胞，我们鉴定出120个差异表达基因（DEG）（图5a）。其中63个基因在IER5L沉默细胞中上调，57个基因下调。IER5L沉默还改变了126种蛋白质的水平，其中59种增加，67种减少（图5b，补充表S3，补充图S7b）。值得注意的是，转录组和蛋白质组的联合分析揭示了6个在mRNA和蛋白质水平上一致下调的候选基因（图5c）。在独立样本集中验证了这6个基因在IER5L沉默下的变化（图5d，补充图S7c），其中IER5L靶向shRNA的不同沉默效率反映在所评估基因表达的较温和效应上。此外，利用第二种细胞系22RV1验证了目标基因的下调（补充图S7f）。在该前列腺癌细胞系中，IER5L沉默后HK2、PTGES3和RCC2的下调现象得到了观察。

功能富集分析显示IER5L沉默引起的分子改变涉及DNA复制和单体G蛋白活性（图5e, f），这与我们的细胞生物学实验中观察到的细胞生长和运动性的减少一致。值得注意的是，染色体浓缩调节因子2（RCC2）和Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子1（ARHGEF1），是IER5L沉默后显著下调的两个候选基因，它们是上述过程的调节因子。因此，我们研究了这些因子的下调是否可能是IER5L沉默表型的贡献事件。为此，我们分别用2个独立的siRNA沉默RCC2和ARHGEF1，并评估生物学后果（图5g, h）。与IER5L沉默的结果一致，siRNA介导的RCC2或ARHGEF1靶向沉默减少了焦点形成，但不影响常规二维生长（图5g, h，补充图S7e, f）。这些结果表明，IER5L靶向引起的转录程序是肿瘤抑制表型的关键贡献事件。

有关IER家族基因作用机制的信息指出了PP2A的调控，IER家族成员至少部分调节PP2A的功能和靶标。为了研究这种磷酸酶在IER5L作用中的相关性，我们进行了两种独立的方法。一方面，我们使用无标记蛋白质组学分析了IER5L沉默引起的磷酸肽变化。符合IER5L维持PP2A活性的角色，我们观察到该基因在PC3细胞中沉默后磷酸肽显著增加（图6a，补充表S4）。推测磷酸化状态改变的蛋白质识别出报道的PP2A靶标，例如RB转录共抑制因子2（RBL2）、蛋白激酶C Iota（KPCI）、蛋白激酶C Alpha（KPCA）和Paxillin（PAXI）（图6a）。有趣的是，这些蛋白质的功能富集分析突出了与IER5L沉默生物学和分子后果相关的过程（细胞周期和单体G蛋白活性）（图6b）。另一方面，我们评估了PP2A药理学抑制是否会模拟IER5L沉默引起的转录改变。FOS原癌基因（FOS）在okadaic酸处理后上调，证实了该化合物在未引起细胞毒性的剂量下的活性（图6c, d）。重要的是，PP2A抑制减少了IER5L调控基因的表达，包括RCC2和ARHGEF1，而不改变IER5L水平（图6d）。在22RV1细胞系中，IER5L沉默引起的RCC2减少也通过PP2A抑制在未引起细胞毒性的剂量下得到了重复验证（补充图S8）。总体而言，我们的结果与IER5L的生物学和转录效应相关，后者与报道的PP2A调控一致。

识别能够提供疾病预后信息的细胞和分子特征是一项迫切的临床需求，这对于预见癌症患者的疾病进展至关重要。这一概念，加上揭示肿瘤侵袭性分子节点和驱动因素的需要，对于减少由转移引起的高死亡率至关重要。在这项研究中，我们确定了IER5L作为一种在不同癌症类型（包括前列腺癌）中上调的基因，并且IER5L上调有助于前列腺癌肿瘤细胞在体外和体内维持转移特性。

IER5L是IER家族的一员，其N端区域与IER2和IER5具有同源性，据报道IER2和IER5分别对癌症生物学的不同方面有贡献。与IER2和IER5不同，IER5L的作用研究较少，因此我们对其在肿瘤进展和转移中的潜在贡献缺乏基本的理解。在这方面，我们的研究表明IER5L沉默影响前列腺癌细胞在应激条件下的增殖、迁移和侵袭能力。IER5L沉默会抑制肿瘤生长，并减少前列腺癌细胞在焦点形成实验和无锚定生长中的克隆形成能力，而在二维未受挑战的条件下，其群体倍增率保持不变。这些数据表明IER5L在细胞面临应激条件时维持增殖过程，而非在指数生长期。IER5L沉默还限制了前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力，以及其在斑马鱼和小鼠模型中的扩散和转移能力。观察到的多种效应与IER5L作为多面细胞因子PP2A的调节剂的作用一致。

在机制上，我们的结果表明IER5L靶向引起的肿瘤抑制表型与增殖和单体G蛋白调节因子的转录程序变化有关，如RCC2和ARHGEF1。此外，IER5L沉默显著增加了磷酸肽的数量，特别是来自众所周知的PP2A靶标的磷酸肽，如RBL2、KPCI、KPCA和PAXI，这些都支持了IER家族成员调节PP2A活性的证据。然而，我们不能排除IER5L除了调节磷酸酶外，还可能有其他分子机制。

PP2A是一种多功能且重要的磷酸酶，参与细胞分裂，其抑制对细胞增殖有深远影响。然而，IER5L沉默对细胞增殖的影响仅限于特定实验条件，这表明PP2A与IER5L之间的功能相互作用是复杂的。虽然我们没有观察到IER5L沉默后IER2和IER5的基因表达变化，但我们不能排除其他家族成员通过调节PP2A在特定细胞环境下补偿IER5L的缺失。

本研究的结果揭示了IER5L在前列腺癌和其他癌症中的表达改变，并且其水平对癌症相关的生物学过程有贡献。IER5L沉默引起的转录变化具有与PP2A活性减少一致的生物学后果。围绕IER5L调控和功能的机制进一步研究，可能为解构癌症病理和进展的分子基础提供重要信息。

原文地址：https://www.nature.com/articles/s41419-024-06907-z