文献：Chen P, Zhu Z, Geng H, Cui X, Han Y, Wang L, Zhang Y, Lu H, Wang X, Zhang Y, Sun C. Integrated spatial metabolomics and transcriptomics decipher the hepatoprotection mechanisms of wedelolactone and demethylwedelolactone on non-alcoholic fatty liver disease. J Pharm Anal. 2024 Apr;14(4):100910. doi: 10.1016/j.jpha.2023.11.017. Epub 2023 Nov 29. PMID: 38655398; PMCID: PMC11035064.
杂志：Journal of Pharmaceutical Analysis
几个世纪以来，墨旱莲（Eclipta prostrata L.）一直被用于传统医学，并以其保护肝脏的特性而闻名。Wedelolactone (WEL)和Demethylwedelolactone (DWEL)是墨旱莲中发现的主要香豆素类化合物，但这两种化合物对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的全面研究仍有待探索。利用硫代乙酰胺(TAA)诱导的斑马鱼肝损伤模型，本研究试图通过整合空间代谢组学和肝脏特异性转录组学分析，探讨WEL和DWEL对NAFLD的影响和机制。我们的结果表明，WEL和DWEL显著改善肝功能，减少肝脏脂肪蓄积。我们成功定位了这两种化合物在斑马鱼全身的生物分布和代谢，并确定了受WEL和DWEL处理反向调节的鉴别内源性代谢物。基于空间代谢组学和转录组学，我们发现类固醇生物合成和脂肪酸代谢主要参与WEL的肝保护作用，而不是DWEL。我们的研究揭示了WEL和DWEL改善NAFLD的独特机制，并提供了一个由空间代谢组学和肝脏特异性转录组学组成的“多组学”平台，以开发高效的化合物，进一步改进治疗。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的患病率不断上升，影响全球约30%的成年人，已成为主要的慢性肝脏疾病。NAFLD的本质是代谢功能障碍，以肝脏脂肪蓄积为特征，从良性脂肪肝发展为非酒精性脂肪性肝炎。随着肝脏损害的持续，NAFLD常进展为肝功能异常、原发性肝癌等严重结局，肝脏相关死亡率明显增加。NAFLD还与肥胖、胰岛素抵抗和其他代谢性疾病密切相关。尽管对NAFLD治疗的需求持续上升，但目前尚未有任何药物获得批准，开发有效且负担得起的NAFLD治疗方法仍然具有挑战性。
墨旱莲具有补肝作用，在亚洲、美洲和非洲被广泛应用于传统药物中，对酒精过量引起的各种肝脏疾病、感染性因子、毒素损伤、肝纤维化等均有良好的生物学作用。墨旱莲中天然存在的香豆素类物质WEL和DWEL被认为是其主要的生物活性成分。WEL不仅对肝损伤有治疗作用，还可缓解高脂血症、高血糖等多种代谢紊乱，可能是通过激活amp活化蛋白激酶(AMPK)/过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)来降低脂质。然而，WEL在NAFLD中的具体影响和机制仍不充分，而且对于DWEL对NAFLD的潜在益处仍缺乏认识，因此不确定DWEL中甲基的缺失是否导致了与WEL相比的生物学过程差异。
斑马鱼(Danio rerio)作为一种脊椎动物模式生物，具有多种优势，是许多重大肝脏疾病模型的首选。除了具有快速发育和成本效益的优势外，斑马鱼还与人类具有高度的生理和遗传相似性，尤其是在肝细胞的组成、功能和潜在的细胞过程方面。更值得注意的是，肝脏特异性荧光转基因品系可以实现精确和直接的体内可视化，加速疾病发病机制的研究以及治疗策略的推进。利用斑马鱼模型进行多组学分析已成为肝脏疾病研究的有力工具。代谢组学和转录组学的结合尤为显著。传统的代谢组学研究揭示了这些代谢性疾病中大量代谢物的改变，但在组织均质化后，这些空间信息完全丢失。利用质谱成像(mass spectrometry imaging, MSI)技术的空间解析代谢组学可以在不进行原位标记的情况下对数千种功能代谢物进行定位。它还有助于确定药物在癌组织和器官中的分布和代谢特征，促使我们研究斑马鱼的肝损伤。此外，整合空间代谢组学和转录组学将产生大量的差异表达基因和代谢通路，通过汇集两个不同的数据集，弥合表型和基因型之间的鸿沟。
本研究利用转基因斑马鱼肝脏特异性红色荧光，通过硫代乙酰胺(TAA)诱导构建NAFLD模型，探讨WEL和DWEL对NAFLD的影响及其机制。本研究的设计如图1所示。我们发现WEL和DWEL均可改善NAFLD引起的代谢紊乱，而WEL通过调节类固醇生物合成和脂肪酸代谢发挥其作用。空间代谢组学和转录组学的整合方法不仅为揭示NAFLD代谢重构的复杂动态提供了有价值的见解，而且增强了我们开发针对相关代谢紊乱的新治疗策略的能力。
材料与方法
1,5-二氨基萘(1,5-DNA)购自上海阿拉丁生化科技有限公司(中国上海)。乙腈(ACN)由默克公司(Darmstadt，德国)提供。氧化铟锡涂层载玻片由Bruker Daltonics (Billerica, MA, USA)提供。Superfrost Plus玻片购自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, USA)。weld和DWEL均购自TargetMol (Boston, MA, USA)，溶解于二甲基亚砜(DMSO;Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国)。从Sigma得到硫代乙酰胺(TAA)。
转基因斑马鱼系Tg (lfabp10:DsRed)在肝脏中选择性表达红色荧光蛋白DsRed，来源于山东省科学院斑马鱼药物筛选平台(济南)。成年斑马鱼被饲养在温度为(28±0.5)℃，光照时间为14小时，黑暗光照时间为10小时的水产养殖设施中。将胚胎置于E3培养基(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4和0.0001%亚甲蓝)中，在相同的温度和光周期下保存。所有实验程序均经齐鲁科技大学生物研究所动物伦理委员会批准(批准文号:SWS20210315)。
保肝活性测定
将受精后72h发育良好的斑马鱼幼鱼随机转移到6孔板，每孔20条幼鱼。为了检测WEL和DWEL的保肝活性，我们用10 mM TAA处理斑马鱼，同时用不同浓度的WEL或DWEL (30 μM、10 μM和3 μM)处理斑马鱼。模型组仅给予10 mM TAA。将未做任何处理的斑马鱼置于淡水中饲养作为空白对照。在120 hpf时，用三卡因(Sigma)麻醉幼鱼，并固定在3%甲基纤维素(Beyotime, Shanghai, China)中，然后在倒置荧光显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)下观察和拍照。
将0.5 g油红O粉末(Sigma)充分溶解于100 mL异丙醇中，4℃避光保存，制备油红O工作液。使用前用蒸馏水按3:2 (V/V)比例稀释原液，经0.22 μm微孔过滤器彻底过滤，得到无沉淀的工作液。处理后，斑马鱼幼鱼被固定在4℃4%多聚甲醛中过夜，然后分别以25%、50%、75%和100%丙二醇/磷酸盐缓冲盐水(PBS)梯度脱水10 min。用油红O工作液在室温下染色过夜，用100%、75%、50%、25%丙二醇/PBS复水。体视显微镜下观察病理改变。
收集斑马鱼幼鱼，在PBS中洗涤3次，然后在冷盐水中以1∶9的重量体积比均质化。然后将匀浆在4℃15,000 g离心15 min并且保留上清液并使用Bradford试剂盒(南京建成生物工程研究所，南京，中国)测量蛋白浓度。按照试剂盒和说明书检测上清液中天冬氨酸转氨酶(AST)和总甘油三酯(TG)的活性或含量。
将斑马鱼的整个身体嵌入最佳切割温度(OCT)化合物中，使用cryostat显微切片机(CryoStar NX50 NOVPD, Thermo, Bremen, Germany)将斑马鱼切片成连续的15微米组织切片。对每条斑马鱼，冷冻切片分别进行苏木精和伊红(H&E)染色，两个冷冻切片分别在正离子和负离子模式下进行基质辅助激光解吸/电离-质谱成像(MALDI-MSI)分析。
选取1,5-DNA作为基质，对斑马鱼全身切片进行MALDI-MS成像。借由使用HTX TM-Sprayer™(HTX Technologies, Carrboro, NC, USA)将2.5 mg/mL 1,5- dan于ACN/H2O (70:30, V/V)中喷撒至斑马鱼切片表面。1,5-DNA溶液的流速设定为75 μL/min。喷嘴氮气压力和温度分别设定为10 psi和55℃。在斑马鱼切片上喷洒1,5-DNA溶液14个循环，喷头-切片距离设定为4 cm。使用RapifleX MALDI Tissuetyper™TOF/TOF MS (Bruker Daltonics)在70-1,000 m/z范围内进行MALDI- msi实验。根据代谢物和脂质的离子强度和质量分辨率优化LasAtten值。激光重复频率设置为5000 Hz，激光照射次数设置为200次。离子源电压1为20 kV，离子源电压2为17.42 kV。Lens电压设置为11.6 kV。成像分辨率为20 μm。采用scil Lab 2018b软件(GmbH, Bremen, Germany)构建MS图像。采用SCiLS Lab 2018b软件进行离子强度和原位数据分析，包括主成分分析、概率潜在语义分析和数据驱动分割分析。
仔细解剖斑马鱼肝脏，使用TRIzol试剂(ThermoFisher)提取总RNA。利用Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)上的RNA Nano 6000检测试剂盒评估RNA完整性。然后使用Stranded mRNA LTSample Prep Kit (Illumina, Santa Clara, CA, USA)构建cDNA文库，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序，由OE生物技术有限公司(上海，中国)进行。原始转录组数据使用Trimmomatic进行处理，干净的reads使用HISAT2映射到Danio rerio基因组(组装GRCz11)。采用DESeq2 R软件包筛选组间差异表达基因(DEGs)，以差异倍数1.2或<0.8为阈值。使用cluster profile R包对差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。使用OECloud工具(https://cloud.oebiotech.com)进行基因集富集分析(GSEA)，使用GSVA R包进行单样本GSEA (ssGSEA)。
用旋柱动物总RNA纯化试剂盒(生工生物技术，上海，中国)提取总RNA，然后用AMeasy第1链cDNA合成试剂盒(Allmeek，北京，中国)进行反转录。采用2× PerfectHS SYBR QPCR Mixture Kit (Allmeek)进行qRT-PCR分析。特异性引物信息见表S1。采用2-△△Ct法计算靶基因mRNA相对表达量，以β-actin作为对照进行归一化。
采用GraphPad Prism软件(version 8.0, San Diego, CA, USA)进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差(SD)表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析和Dunnett's检验。P值低于0.05的阈值被认为有统计学意义。
结果
为了评估WEL和DWEL的潜在肝保护作用，我们将斑马鱼幼鱼暴露于TAA诱导的肝损伤中，同时给予WEL或DWEL处理至120 hdf。如图1A所示，与未处理的对照组相比，TAA处理组显示出肝脏大小和荧光强度的显著降低。值得注意的是，当采用WEL或DWEL治疗时，肝面积和积分光密度(IOD)显著增加(图1B和C)，提示WEL和DWEL均可减轻肝损伤。WEL和DWEL处理后斑马鱼均未见肉眼病理改变。
TAA可引起肝脏脂质代谢紊乱，诱导脂质蓄积，促进肝细胞功能受损。为了验证WEL和DWEL对斑马鱼幼鱼脂质积累的影响，我们对斑马鱼幼鱼进行了红油O染色。显然，TAA处理导致了比对照更高的脂质水平(图2)，这意味着TAA导致了斑马鱼的NAFLD。WEL或DWEL处理后斑马鱼的脂质减少，且呈剂量依赖性，这表明WEL或DWEL处理减少了斑马鱼肝脏中的脂质蓄积(图2A和图B)。斑马鱼的卵黄囊被认为是肝功能的重要表现，其中70%为中性脂质，主要在肝脏代谢。从图2C的结果可以看出，经TAA处理的斑马鱼卵黄囊面积增加，表明吸收延迟，肝脏损伤。值得注意的是，WEL和DWEL均能促进蛋黄吸收，导致卵黄囊面积减小，与红油O染色结果一致。我们还发现，WEL和DWEL可降低TAA诱导后升高的天冬氨酸氨基转移酶(AST)和总甘油三酯(TG)水平(图S1)。总之，WEL和DWEL处理减轻了斑马鱼肝脏中的脂质堆积。
质谱成像可以同时表征药物及其代谢物在异质性生物组织中的空间分布和相对含量。深入了解这些药物的生物分布和代谢规律，有助于进一步研究其安全性和有效性。本研究在斑马鱼全身切片中成功绘制了WEL和DWEL在斑马鱼不同器官中的空间分布。此外，我们还可以在斑马鱼全身切片中检测和成像WEL和DWEL的I相和II相代谢产物。
图3A显示了在斑马鱼中鉴定出的WEL的代谢产物。在WEL组中，WEL进行去甲基化处理生成DWEL，并检测WEL的甲基化代谢物。此外，我们发现WEL与DWEL和甲基化WEL一样，可以在斑马鱼中继续进行硫酸化和葡萄糖醛酸化II相代谢反应(图3A)。这一发现与先前报道的WEL在大鼠[36]中的代谢一致。更值得注意的是，我们在体内鉴定了WEL, DWEL和甲基化WEL的硫酸-糖苷代谢物，据我们所知，这在以前的研究中没有报道过。在斑马鱼中共鉴定出14种WEL代谢物。图3B显示了斑马鱼不同器官中WEL及其14种代谢物的质谱图像。WEL及其I相和II相代谢物主要分布于肝脏和肠道，而在脑、肌肉和眼睛等其他器官中的含量很低。这提示肝脏和肠道是斑马鱼WEL的主要代谢器官，也可能是WEL发挥生物学效应的主要靶器官。
在DWEL组中(图3C)，我们发现DWEL可以首先在斑马鱼中发生甲基化，产生甲基化的DWEL。随后，DWEL和甲基化DWEL可进一步与硫酸和葡萄糖醛酸结合，产生80 Da和176 Da的质量位移。此外，我们发现一个分子的DWEL和甲基化的DWEL可以与一个分子的硫酸和一个分子的葡萄糖醛酸结合，发生硫酸化和葡萄糖醛酸酸化反应，质量位移为256 Da。1分子的DWEL和1分子的甲基化DWEL可以与1分子的硫酸和1分子的葡萄糖结合，发生硫酸化和糖苷化反应，质量位移为242 Da。这一分析也代表了DWEL在体内代谢的第一个特征。与WEL一样，DWEL的母本化合物和代谢物主要在肝脏和肠道中表征，而DWEL的糖苷化或葡糖醛酸化代谢物也在全身其他器官中检测到(图3D)。表S2显示了WEL和DWEL代谢物的高效液相色谱-高分辨质谱(HPLC-HR-MS)数据，所有代谢物均通过精确分子量和小于5 ppm的质量准确度进行了验证。我们进一步对这些目标化合物进行了HPLC-HR-MS/MS分析，并使用目标分析物的结构特异性模式离子进行进一步的鉴定(图S2−11)。综上所述，我们的研究突出了WEL和DWEL在斑马鱼中的代谢，表明斑马鱼具有与人类相似的完整的代谢器官系统和代谢酶系统，为药物代谢研究提供了理想的模型。
我们进一步对斑马鱼全身切片进行了空间代谢组学研究，以探索NAFLD发生发展过程中的代谢改变，以及WEL和DWEL对NAFLD的代谢调节作用。在对照组、NAFLD模型组、WEL组和DWEL组之间，斑马鱼的大小和H&E染色结果没有明显变化(图4A)。然后，我们基于区域特异性代谢物指纹进行了数据驱动的全身分割分析(图4B)。在全身分割图中，将具有相似代谢物谱的不同区域分组并赋予特定颜色。斑马鱼全身切片呈现明显的颜色多样性，肝脏和肠道区域多为热红色，其他器官多为冷蓝色。更有趣的是，我们发现与对照组、WEL组和DWEL组相比，肝脏区域被给予了更强烈的红色(图4B)。这一结果提示NAFLD发生发展过程中肝组织发生了显著的代谢重编程，给予WEL和DWEL后其代谢轮廓逐渐恢复正常。
鉴于斑马鱼幼体大小的局限性，传统上对NAFLD相关代谢改变的分析是在整个斑马鱼幼体上进行，这导致无法准确获得器官特异性的代谢特征。将MSI引入代谢组学为精确表征NAFLD相关代谢改变提供了一种有洞察力的方法。如图4C和D所示，当我们提取斑马鱼全身切片的代谢图谱进行主成分分析(PCA)和概率潜在语义分析(PLSA)时，对照组、NAFLD模型组、WEL组和DWEL组的代谢特征难以识别和区分。然而，如果提取斑马鱼全身切片肝脏区域的肝脏特异性代谢谱进行PLSA分析，我们发现对照组、NAFLD模型组、WEL组和DWEL组有明显的聚类和分组趋势(图4E)。总体而言，与对照组相比，NAFLD组的肝脏代谢发生了显著改变，而WEL和DWEL组的代谢特征更接近对照组(图4E中的箭头)，这表明WEL和DWEL能够部分抑制NAFLD引起的代谢改变。这也呼应了我们之前的发现，即WEL和DWEL可预防或减轻肝损伤。
我们继续筛选和成像由WEL和DWEL调控的NAFLD的鉴别代谢物。作为机体氮代谢和能量代谢的主要参与者，谷氨酰胺在NAFLD中的表达显著增加，打破了代谢稳态。然而，WEL和DWEL的引入显著减轻了这一情况(图4F)。谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的催化下被代谢成谷氨酸，随后进入三羧酸循环进行能量产生或被用于谷胱甘肽合成。相应地，我们在谷氨酸和谷胱甘肽水平上发现了类似的趋势(图4G和H)。肝糖原代谢与全身脂质代谢错综复杂地交织在一起，脂肪肝也可导致肝脏糖异生的增加。本研究显示，NAFLD患者的葡萄糖和葡萄糖磷酸(GPP)水平升高，WEL和DWEL干预降低了这一水平(图4I和J)。TCA循环的参与者苹果酸和琥珀酸水平也在NAFLD患者中升高，表明肝脏对能量供应的迫切需求，随后在WEL和DWEL的影响下逆转了这一需求(图4K和L)。空间代谢组学显示NAFLD患者胆固醇、磷脂和脂肪酸升高，如硫酸胆固醇(CSS)、磷脂酰乙醇胺(PE)-34:0、磷脂酰丝氨酸(PS)-36:2、脂肪酸(FA)-16:0、FA-16:1、FA-18:0、FA-20:4、FA-22:5和FA-22:6。WEL和DWEL可逆转这些血脂紊乱(图4M ~ W)。然而，同样重要的是要注意，并非所有脂质都受到WEL和DWEL摄取的调节，例如磷脂酰甘油(PG)-36:4、PG-36:5和PG-38:4(图S12)。综上所述，我们发现WEL和DWEL可以显著减轻NAFLD引起的代谢改变。
为了深入研究WEL和DWEL对NAFLD治疗作用的复杂分子通路，我们对对照组、NAFLD组以及WEL和DWEL治疗组的斑马鱼肝脏进行了RNA测序。利用具有肝脏特异性荧光蛋白表达和可视化特征的转基因斑马鱼，在荧光显微镜下精确分离斑马鱼肝脏，确保了肝脏样本的独家采集和聚焦转录组学分析。与对照组相比，TAA诱导的NAFLD组中共鉴定出5 587个差异表达基因(DEGs)，其中2 664个上调，2 923个下调。与NAFLD组相比，WEL治疗组有1,408个DEGs(619个上调和789个下调)，而DWEL组和NAFLD组有529个DEGs(321个上调和208个下调(图5A-C)。FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值的堆叠直方图显示了组内基因表达模式的高度一致性(图5D)。值得一提的是，在三个实验比较中有71个DEGs重叠，代表了WEL和DWEL治疗对taa诱导的NAFLD的共同调控。聚类热图进一步说明了这71个基因的mRNA谱，明确区分了WEL和DWEL治疗组与NAFLD组(图5E)。通过KEGG富集分析，我们发现细胞信号传导、能量代谢、细胞凋亡和细胞外基质相互作用等多个生物学过程被深度富集，表明这些通路是WEL和DWEL调节NAFLD的共同机制(图S13)。
图5 WEL和DWEL广泛改变了斑马鱼肝脏中的基因表达模式
对WEL vs. NAFLD组和DWEL vs. NAFLD组的DEGs进行通路富集分析时，我们观察到明显的差异(图5F)。WEL治疗组与NAFLD组相比，差异基因主要富集在与类固醇生物合成、细胞凋亡、辅因子生物合成、叶酸生物合成和DNA复制相关的通路，这些通路与维持正常的肝功能和减少脂肪沉积密切相关。相比而言，DWEL处理组和NAFLD组的DEGs主要富集在细胞外基质(ECM)受体相互作用、MAPK信号通路、肠道免疫网络产生IgA、叶酸单碳库和Fanconi贫血通路等。这些通路涉及信号转导调节、免疫调节等生物学过程，表明WEL和DWEL通过不同的机制对NAFLD发挥作用。
为了更深入地了解WEL和DWEL处理引起的代谢通路的变化，我们进行了转录组学和代谢组学的整合分析。单样本基因集富集分析(ssGSEA)显示NAFLD患者在基因水平存在显著的代谢功能障碍。有趣的是，这些代谢通路中的大多数都可以被WEL治疗有效逆转。然而，DWEL的作用相对有限，这表明这些通路与WEL(而非DWEL)对NAFLD的调节作用直接相关(图6A)。然后，我们通过基因集富集分析(GSEA)对类固醇生物合成和脂肪酸延伸的代谢通路进行了测试，发现WEL处理后这些通路下调(图6B)。类固醇生物合成和脂肪酸延伸是与NAFLD高度相关的生物学过程，因为它们的失调会导致胆固醇和脂肪酸的积累，而胆固醇和脂肪酸是NAFLD进展中脂毒性的关键因素。这些结果强烈表明，WEL通过调节胆固醇和脂肪酸代谢发挥治疗NAFLD的作用，这与代谢组学分析的结果一致。
我们进一步通过qRT-PCR验证了几个相关基因的表达，以加强WEL对NAFLD的潜在机制的证据(图6C和D)。依帕米结合蛋白(Ebp)是胆固醇生物合成中的一种重要酶，催化δ(8)-固醇转化为其δ(7)-异构体，对类固醇稳态至关重要。其表达在TAA诱导的NAFLD中显著上调，而WEL可逆转其表达下调。此外，我们还验证了WEL对脂肪酸代谢通路中dgat2基因的显著下调。Dgat2负责编码二酰甘油o-酰基转移酶，该酶以二酰甘油和脂肪酰基辅酶a为底物催化甘油三酯的形成。参与甘油三酯酰基链重塑的下游基因pnpla3被评估为WEL治疗后上调。此外，我们验证了WEL可以反向调节chac1的表达，导致谷胱甘肽[47]的降解，这与代谢组学数据一致(图6D和图4H)。总之，我们证明了WEL和DWEL通过各自的机制改善NAFLD。抑制类固醇生物合成和调节脂肪酸代谢是与WEL效应特异性相关的重要途径，而不是DWEL。
我们的研究为WEL和DWEL对NAFLD的治疗效果提供了证据，并提出了一种将基于MSI的空间代谢组学与肝脏特异性转录组学相结合的新方法来探索其潜在机制。通过空间代谢组学，全面绘制了WEL和DWEL在斑马鱼体内的代谢通路以及区分的内源性代谢物。此外，转录组学分析揭示了WEL和DWEL对NAFLD的不同作用机制，并揭示了WEL的肝保护作用主要与调节类固醇生物合成和脂肪酸代谢有关。我们的研究结果不仅提供了对WEL和DWEL对NAFLD影响的整体理解，而且强调了整合空间代谢组学和肝脏特异性转录组学对阐明有效干预的复杂机制的意义。
原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095177923002836?via%3Dihub
