非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要类型，其中表皮生长因子受体（EGFR）的致癌突变在亚洲人群中尤为常见。尽管EGFR-TKI在靶向治疗EGFR突变NSCLC患者的初期显示出显著的疗效，但随着时间的推移，患者往往会产生耐药性，限制了长期疗效。此外，PD-1/PD-L1抑制剂在此类患者中的疗效也有限，因此寻找新的治疗靶点和策略至关重要。2024年3月27日，中山大学肿瘤防治中心方文峰教授团队在Journal of thoracic oncology期刊上发表了重要研究成果，旨在探讨EGFR致癌突变如何影响NSCLC中的巨噬细胞吞噬功能，并通过上调CD47介导先天免疫逃逸的机制，进而为开发更有效的治疗方法提供理论依据。【肿瘤资讯】整理主要内容，以飨读者。
从基因表达到免疫应答：EGFR突变NSCLC中CD47角色的深度剖析
本研究利用患者和细胞系水平的数据集，对EGFR突变与一系列免疫检查点相关基因之间的关联性进行了筛选和相互验证。通过体外调控EGFR信号通路，并利用免疫印迹分析、定量聚合酶链反应、流式细胞术、免疫荧光染色和染色质免疫共沉淀（ChIP）等方法，深入探讨了相关机制。同时，研究者使用免疫正常和免疫缺陷的小鼠模型，评估了不同治疗策略的体内疗效。
为探索EGFR突变状态是否与42个免疫检查点相关基因的转录谱存在关联。该研究对233例NSCLC患者的内部基因组和RNA测序数据进行了分析。结果显示，EGFR突变NSCLC样本中CD47、CD80、CD86、CEACAM1、HHLA2、HAVCR2、LGALS9、TNFRSF14、TNFRSF9和TNFSF15等基因显著上调，而LAG3和PDCD1则显著下调（图1A）。同时，TCGA和EAS两个公共数据集的分析结果均显示，EGFR突变患者中CD47、HHLA2、CEACAM1和TNFSF15基因的表达显著上调（图1B）。此外，本研究从CCLE数据库中获取了137个NSCLC细胞系的体细胞突变和mRNA表达数据，发现只有CD47的表达水平与EGFR的表达水平呈正相关（图1C）。另外，通过评估七种常见NSCLC细胞系及Beas-2B细胞系中CD47的基础表达水平，发现携带EGFR激活突变的细胞系中CD47的表达水平高于野生型EGFR细胞系（图1D、图1E），这表明EGFR和CD47之间可能存在潜在的调控关系，即EGFR的激活可能导致CD47的上调，从而促进EGFR突变NSCLC的先天免疫逃避。
图1 CD47表达与EGFR突变状态相关
为阐明EGFR与CD47之间潜在的调控关系，本研究在三种具有较低EGFR信号活跃度的细胞系（A549、H1299、Beas-2B）中转染了两种最常见的EGFR激活突变体（EGFR19del和EGFRL858R）。通过流式细胞术评估EGFR19del/EGFRL858R A549和H1299细胞膜上CD47的表达进一步验证了这些发现（图2E）。免疫荧光结果显示，EGFR19del/EGFRL858R H1299和A549细胞系的膜荧光强度更高，表明CD47表达升高。相反，在H1975或PC-9细胞系中使用小干扰RNA（siRNA）敲低EGFR后，CD47在蛋白质和mRNA水平的表达均显著减少（图2F、图2G）。流式细胞术分析和免疫荧光成像也证实了这一发现（图2H）。
图2 EGFR信号通路调控CD74表达
随后，研究分析了暴露于EGF刺激或奥希替尼抑制浓度梯度下的H1299（EGFRWT）和H1975（EGFRL858R/T790M）细胞系中EGFR下游蛋白的变化。CD47的剂量依赖性表达模式与AKT和ERK通路的变化相协调（图3A、图3B）。此外，在H1975和PC-9细胞系中使用了靶向RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT通路的特异性抑制剂，当阻断任一通路时，均观察到CD47表达的剂量依赖性下降（图3C、图3D）。在H1975或PC-9细胞中使用RNA干扰技术靶向敲除NF-κB（p65）或c-Myc后，CD47表达的减弱进一步证实了上述结果（图3E）。相反，在H1299或A549细胞系中过表达RELA或MYC会增强CD47的表达（图3F）。结果表明，RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT途径均可调节CD47的表达。同时，ChIP结果显示，与阴性对照相比，当使用针对c-Myc或NF-κB的抗体时，CD47启动子DNA片段的富集程度较高。相反，用奥希替尼处理6小时后，抗c-Myc或抗NF-κB抗体富集的ChIP信号显著降低，这表明c-Myc和NF-κB作为转录调节因子能够直接结合到CD47启动子区域（图3G）。
图3 通过AKT/NF-κB和ERK-/c-Myc信号通路调节CD47
将稳定转染EGFRL858R或EGFR19del的A549和H1299癌细胞用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行荧光标记，并与来自人外周血单个核细胞（PBMC）的活化M1巨噬细胞在体外共培养。结果发现，将EGFRL858R或EGFR19del引入A549或H1299细胞系后，显著降低了癌细胞的巨噬细胞吞噬作用。当阻断CD47时，这种受损的吞噬作用能得以恢复（图4A、图4B）。结果表明，NSCLC中的EGFR突变会通过上调CD47来驱动先天免疫逃逸。
图4 EGFR 激活突变削弱巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，抗CD47单抗可恢复这种作用
研究者使用H1299和H1299-EGFR19del细胞系，在BALB/c裸鼠中建立了皮下细胞来源的异种移植（CDX）模型。在肿瘤接种后10天，将CDX模型随机分组，分别接受抗人CD47（hCD47）mAb或IgG腹腔注射。与IgG对照相比，抗hCD47 mAb显著抑制了肿瘤生长，特别是在EGFR激活突变的背景下（图5A）。
图5 抗CD47单抗和EGFR-TKI治疗EGFR突变NSCLC协同增效
小结
本研究揭示了EGFR致癌突变通过上调CD47介导NSCLC先天免疫逃逸的新机制，为开发针对EGFR突变NSCLC的更有效治疗方法提供了重要的理论依据。同时，联合CD47阻断剂在临床转化中具有巨大的前景，有望为EGFR突变NSCLC患者带来更好的治疗效果。
本材料由阿斯利康提供，仅供医疗卫生专业人士参考
审批编号：CN-145213
Hu LY, Zhuang WT, et al. EGFR Oncogenic Mutations in NSCLC Impair Macrophage Phagocytosis and Mediate Innate Immune Evasion Through Up-Regulation of CD47. J Thorac Oncol. 2024 Aug;19(8):1186-1200. doi: 10.1016/j.jtho.2024.03.019. Epub 2024 Mar 27. PMID: 38553005.
排版编辑：肿瘤资讯-Rex
