【前沿进展】PARP1通过激活PI3K/AKT信号通路促进EGFR-TKI耐药

学术   2024-11-06 18:09   北京  
整理:肿瘤资讯
来源:肿瘤资讯

根据国际癌症研究机构(IARC)提供的最新统计数据,肺癌是全球第二常见的原发性恶性肿瘤,也是癌症相关死亡的主要原因。近年来,尽管综合治疗与个体化治疗的有机结合显著改善了癌症患者生存,但1年生存率仍仅为15-19%,预后仍然不容乐观。EGFR-TKI为EGFR突变NSCLC靶向治疗带来了革命性进步。但是尽管EGFR激活突变NSCLC患者在早期使用EGFR-TKI疗效较优,但是经治一段时间后均会不可避免地产生耐药。EGFR T790M突变、小细胞肺癌表型的演变、旁路信号通路的异常激活等是获得性耐药的主要机制。不同耐药机制有着截然不同的后续用药策略,关乎患者的临床获益。
聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP1)是一种具有ADP核糖基化同源催化结构域的PARP蛋白家族成员,参与RNA加工、DNA复制、转录和DNA损伤修复。PARP1在乳腺癌、卵巢癌、白血病、胃癌和口腔鳞状细胞癌中高表达并与化疗耐药相关。最新研究表明,PARP1可以通过调节自噬促进EGFR-TKI耐药。为进一步明确EGFR-TKI的潜在耐药机制,西南大学医学院研究团队探讨了PARP1与PI3K/AKT信号通路在NSCLC EGFR-TKI耐药中的作用及其潜在分子机制[1]以期为克服EGFR-TKI耐药提供新的潜在靶点。【肿瘤资讯】特整理主要研究结果,以飨读者。


关键结果



PARP1在NSCLC组织和细胞中高表达并与不良预后相关

研究者首先通过分析GEO数据库 (GSE10072) 发现,PARP1在NSCLC肿瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织(图1A)。进一步通过Kaplan-Meier分析发现,PARP1高表达与NSCLC患者较差的总生存期 (OS) 相关(图1B)。TCGA数据库分析也证实,PARP1高表达与肺腺癌患者的不良预后显著相关,但在肺鳞状细胞癌中未观察到显著相关性(图1E,F)。

为进一步验证PARP1的表达情况,研究者采用qRT-PCR和Western blot方法检测了方法检测了多种NSCLC细胞系 (H1650、PC9和HCC827) 和正常肺上皮细胞系BEAS-2B中PARP1的表达水平。结果显示,PARP1在NSCLC细胞系中的mRNA和蛋白表达水平均显著高于BEAS-2B细胞系(图1G,H)。

此外,临床病理特征分析表明,PARP1的表达与NSCLC患者的性别 (P < 0.0001)、病理分期 (P < 0.0001)、T分期 (P < 0.01)和N分期 (P < 0.05) 显著相关,但与年龄无关(表1)。

图1 PARP1 在 NSCLC 组织和细胞系中的表达分析

表1 TCGA 队列中NSCLC患者 PARP1 表达水平与临床病理特征之间的关系



PARP1参与EGFR-TKI耐药的形成

为探讨PARP1在EGFR-TKI耐药中的作用,研究者首先检测了EGFR-TKI对PARP1表达的影响。研究者将EGFR-TKI敏感细胞系PC9细胞分别用不同浓度 (0.1、0.25、0.5和1 μM) EGFR-TKI处理24小时,或用0.5 μM EGFR-TKI处理不同时间 (24、48、72和96小时)。Western blot结果显示,EGFR-TKI可诱导PARP1表达的显著上调,且呈现浓度和时间依赖性(图2A,B)。

随后,研究者比较了PC9和其耐药细胞系PC9-ER中PARP1的表达水平。药物敏感性实验结果显示,PC9-ER细胞对EGFR-TKI的IC50值 (6.20 ± 0.59 μM) 显著高于PC9细胞(0.28 ± 0.07 μM),耐药指数 (RI) 为22(图2C)。Western blot和qRT-PCR结果表明,PC9-ER细胞中PARP1的mRNA和蛋白表达水平均显著高于PC9细胞(图2D,E)。

图2  PARP1 的高表达与 NSCLC 中的EGFR-TKI耐药性相关



下调PARP1表达可逆转EGFR-TKI耐药

为进一步验证PARP1在EGFR-TKI耐药中的作用,研究者通过RNA干扰技术下调了PC9-ER细胞中PARP1的表达。在成功构建两株PARP1敲低的PC9-ER细胞株(sh1PARP1和sh2PARP1)后,研究者通过qRT-PCR和Western blot结果证实了PARP1基因敲低的有效性(图3A,B)。CCK-8实验结果显示,下调PARP1显著增加了PC9-ER细胞对EGFR-TKI的敏感性,IC50值从8.29 ± 0.6 μM降低至0.69 ± 0.72 μM (sh1PARP1)和0.92 ± 0.10 μM (sh2PARP1),表明PARP1敲低可将耐药细胞的EGFR-TKI敏感性恢复至接近亲本PC9细胞的水平(图3C)。

研究者开展的细胞功能实验进一步证实了PARP1下调对EGFR-TKI耐药的影响。流式细胞术分析表明,下调PARP1可细胞凋亡,并抑制细胞增殖和细胞周期进程。克隆形成实验结果也显示,PARP1敲低显著抑制了PC9-ER细胞的克隆形成能力(图3D-F)。

图3  下调PARP1 表达与可逆转PC9- ER 细胞对EGFR-TKI的获得性耐药



PARP1通过PI3K/AKT/mTOR/P70S6K通路调控EGFR-TKI耐药

为探究PARP1介导EGFR-TKI耐药的分子机制,研究者对PC9-ER-NC和shPARP1-PC9-ER细胞进行了转录组测序分析。差异表达基因分析和KEGG通路富集分析结果显示,PI3K-AKT信号通路在PARP1下调后发生了显著改变。考虑到PI3K/AKT/mTOR/P70S6K通路在细胞生长、增殖和凋亡中的重要作用,研究者进一步验证了该通路的变化并发现,下调PARP1可降低p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K的表达水平,而总蛋白水平无明显变化。此外,细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6、cyclin D和cyclin E的表达也随之降低。

为进一步验证该通路的作用机制,研究者使用PI3K激活剂740Y-P处理PARP1下调的细胞。结果显示,740Y-P不仅可逆转PARP1下调导致的细胞增殖抑制和EGFR-TKI敏感性增加,还可恢复PI3K/AKT/mTOR/P70S6K通路的活化,并同时上调CDK4、CDK6、cyclin D和cyclin E的表达(图4C,D)。

图4 PARP1通过PI3K/AKT/mTOR/P70S6K通路诱导EGFR-TKI耐药



体内实验验证PARP1通过PI3K/AKT/mTOR/P70S6K通路调控EGFR-TKI耐药

为验证PARP1在体内的作用,研究者建立了裸鼠移植瘤模型。将PC9-ER-NC、sh1PARP1-PC9-ER和sh2PARP1-PC9-ER细胞分别接种到BALB/c裸鼠皮下,30天后测量肿瘤体积和重量。结果显示,下调PARP1显著抑制了肿瘤生长,PARP1敲低组的肿瘤体积和重量均显著低于对照组(图6A-D)。

Western blot分析表明,PARP1下调组肿瘤组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K的表达水平显著降低(图6E)。这些结果进一步证实了下调PARP1可通过PI3K/AKT/mTOR/P70S6K通路提高肺癌对EGFR-TKI的治疗敏感性。

图5 体内研究证实PARP1通过 调节PI3K/AKT/mTOR/P70S6K通路诱导EGFR-TKI耐药

结语:

PARP1作为一种新的耐药调控因子,其抑制剂有望成为克服EGFR-TKI耐药的有效策略。未来,PARP1抑制剂联合EGFR-TKI治疗或将为NSCLC患者,特别是EGFR-TKI耐药患者提供更好的治疗选择。

然而,该项研究因主要集中在体外细胞实验和裸鼠模型而存在一定的局限性。PARP1通过调控PI3K/AKT/mTOR/P70S6K信号通路促进NSCLC EGFR-TKI耐药的分子机制未来需要进行更多的临床验证。总体而言,该研究为EGFR-TKI耐药机制研究提供了新的见解,并为克服EGFR-TKI耐药开辟了新的思路。

本材料由阿斯利康提供,仅供医疗卫生专业人士参考

审批编号:CN-141884

参考文献

Xu, X., et al., PARP1 promotes EGFR-TKI drug-resistance via PI3K/AKT pathway in non-small-cell lung cancer. Cancer Chemother Pharmacol, 2024.

责任编辑:肿瘤资讯-Yuno
排版编辑:肿瘤资讯-liguo.zhu

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