论文标题：Reversing the Enantioselectivity of Enzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations in the Synthesis of Fused Lactones 期刊名称：ACS Catalysis (IF: 11.3) 论文DOI号：10.1021/acscatal.4c05196 第一作者：四川大学 施明亮 通讯作者：四川大学 王娜 副教授
稠环内酯的合成可以通过羧酸化合物的选择性羟基化得到（图1A(1)）。此外，也可以使用手性金属催化剂不对称还原 γ-酮酸获得（图1A(2)）。然而，立体发散性合成稠环内酯受限于手性金属催化剂的结构差异，且反应条件较为苛刻。因此，开发新的生物催化平台用于不对称合成这类体积大、具有多手性中心的稠环内酯类化合物具有一定的挑战性。为了构建更加高效简易的稠环内酯生物合成路径，并实现其构型的精确调控，我们在本课题工作中对羰基还原酶 ChKRED20 进行了蛋白质工程改造，以突变体 ChKRED20-M2（Q97L/S153L）为母本，成功地在活性空腔附近定位了两个重要氨基酸 Y188 和 H145。通过对这两个氨基酸的组合突变，实现了 20 种芳基三稠环内酯的立体发散性生物合成（图1B）。
图2. ChKRED20 不同突变株对还原反应的影响
随后我们考察了该反应体系的底物范围，使用了五种优良突变株 M3C2、M3C3、M3C4、M3C5、M4A1 和 M4B1 并研究其对 20 种芳基 γ-酮酸酯的还原（图3）。M4B1 主要生成顺式的消旋体稠环内酯 e，M3C2、M3C3、M3C4 和 M3C5 生成以 (3aR, 9bS) 为构型的稠环内酯，而 M4A1 则能生成以 (3aS, 9bR) 为主要构型的稠环内酯。其中 16e 在 M3C3 和 M4A1 中实现了完全的手性翻转（从 >99:1 e.r. 到 <1:99 e.r.）。此外，取代基团在芳环的第 8 位上（11e-14e）对还原反应的影响比在第 6 和第 7 位上的影响要大。芳环或脂肪环中具有杂原子的底物也能够在这 5 种突变株中被还原并生成相应的具有高对映和非对映选择性的稠环内酯（17e-21e）。同时对 16e、17e、19e、20e 和 21e 进行了放大反应实验，以百毫克级实现了 (3aR,9bS)-17e 的合成，证明了该生物催化平台在替代传统手性金属催化法以实现稠环内酯立体发散性合成的应用潜力。
模板底物 2a 在反应过程中均遵循动力学拆分反应过程（如在突变株 M3C3 中，R-2a 全部被还原，而剩余的 S-2a 则难以被还原，内酯理论产率 <50%），得到的产物均为顺势构型（cis-），而反式构型（trans-）产物无法检测到。在图4a-3和图4a-4展示，若要得到反式构型产物时底物在活性位点中最合理的结合模式，推测在这两种结合模式中底物羰基 α-位的侧链基团具有位阻效应，因此亲核进攻距离（NADH 上氢原子到底物羰基碳的距离）要比图4a-1和图4a-2中的亲核进攻距离更远（图4b-1中的 4.0 Å，图4b-2中的 6.2 Å），导致反式构型的产物无法在 ChKRED20 的活性空腔中得到。
在底物普适性研究的过程中，有几种稠环内酯能够以超过 50% 的产率获得且具有高对映选择性和非对映选择性（>99% e.e.，>99% d.e.，3e、15e、16e、17e、18e、19e）。如图5右所示，与模板底物 2a 不同，消旋体 18a 在 48 h 内全部消耗完并生成单一构型的 (3aS,9bS)-18e，因此我们猜测 R-18a 在还原反应过程中发生了消旋化。此外，β-酮酸酯发生烯醇互变异构化所需能量较低，而 γ-酮酸酯的烯醇形式通常具有不稳定的共轭结构，导致 γ-酮酸酯发生烯醇互变异构化所需的能量更高。我们认为，由于底物结构不同，酶能够在催化还原过程中通过质子化-去质子化的过程介导部分底物（如 3e、15e、16e、17e、18e、19e）的烯醇互变异构化（图6a）。因此该反应体系中存在动力学拆分-不对称还原（KR-AR）和动态动力学不对称转化（DyKAT）两种反应历程，二者的差异取决于非优势反应构型的底物在酶中发生烯醇互变的能垒高低。
图5. 不同时间段监测 2a 和 18a 在突变株 M3C4 中还原反应的成分组成
综上所述，本研究开发了一个高效简易的酶催化平台用于立体发散性合成稠环内酯，阐述了在该体系中存在的动力学拆分和动态动力学不对称转化两种不同反应历程的反应机制。同时成功实现了稠环内酯的百毫克级合成，证明了该平台在应用于更大规模制备稠环内酯中的潜力。
第一作者信息：
施明亮，四川大学化学学院 2022 级博士研究生，主要研究方向为羰基还原酶的（半）理性设计与生物催化不对称合成。
供稿：施明亮 编辑：韦运洁 审核：姚瑶 范馨月
