揭开隐藏在流式细胞术身上黄色的面纱

健康   2024-12-15 11:11   山东  


作者:郑春梅

单位:汉中市中心医院检验科



流式细胞术(Flow Cytometry)是一种用来分析并测量单个细胞特征的技术。它是指制备成单细胞悬液的标本或单个微粒在上样前进行荧光染色。


流式细胞仪检测到上样管后,产生一定的气体压力将待测样本压入流动池。同时鞘液(不含细胞或微粒的缓冲液)在仪器产生的高压作用下从黯液管喷出,鞘液管入口方向与样本流形成一定的角度,形成一个圆形的鞠液流,包围着细胞或微粒高速流动,使待测细胞在鞘液的包裹下单行排列,逐个地通过流式细胞仪的激光聚焦区(流动池),从而被检测到,并发出散射光及荧光等多种光学信号。光学信号通过光电信号转换器及电子信号处理系统采集及分析后,最后以图形的形式将数据结果显示在电脑屏幕上。


流式细胞术(flow cytometry, FCM)已在检验医学领域被广泛应用,其检测结果受样本采集、抗体选择、红细胞裂解方法等多种因素的影响。


机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导,体液免疫由 B 细胞 ( CD3-CD19+ ) 介导,非特异性免疫以NK细胞 ( CD3-/CD56+16+)。T淋巴细胞进一步分为辅助性T淋巴细胞(Th,CD3/CD4)和细胞毒性/抑制性T淋巴细胞(Tc/Ts,CD3/CD8)。流式细胞术广泛的应用于细胞免疫功能。



案例介绍




某日,检验人员在使用流式细胞仪检测标本时,一例标本时引起了大家的注意,原本CD3%的值应该=CD4%+CD8%,而此标本CD3%、CD4%、CD8%却傻傻分不清楚。

 
为什么会出现这种情况呢?工作人员首先考虑是否是试剂或者仪器导致的错误呢?随即检查当日质控标本在控,其他标本分类较好,根据检查结果可以排除试剂与仪器的原因。工作人员又考虑是否是在制备此标本悬液时发生操作错误,从而导致标本未彻底裂解,细胞不分类,为寻求真相,工作人员重新制备悬液,再次检测。重新检测之后,细胞仍未分类。工作人员又尝试调式电压,利用电压将细胞分开,结果再次失败。

再经历几次失败之后,工作人员怀疑是病人自身疾病干扰了本次实验。查看其他检查结果:病人男,77岁,临床诊断为胆总管结石。

 
此病人总胆红素为201.4μmol/L,直接胆红素为170.6μmol/L,此时考虑可能为黄疸对结果产生了干扰,为排除干扰,采用染色-裂解-洗涤法:将样本进行染色-裂解-洗涤处理,在经染色-裂解免洗方法处理的干扰样本中加入1 mL磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline,PBS)震荡混匀,震荡混匀,350×g离心5 min,轻轻吸取1mL上清,弃去。剩余样本采用FCM检测。

 

此时可以揭开隐藏在流式细胞术身上黄色的面纱——高胆红素血症。


高胆红素样本中异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的CD3 +细胞群与CD3- 细胞群荧光表达分界不清,进而影响设门的情况,直接影响了FCM检测结果的准确性。


究其原因是因为DBil是经过肝脏加工后的胆红素,其实质为胆红素分子与1个或2个葡萄糖醛酸分子单独酯化形成的结构,易溶于血浆和样本处理所用的裂解液,因此可能对FITC荧光信号的干扰较大。


研究显示,DBil≥200μmol/L对FCM检测的干扰较大,采用染色-裂解-洗涤法处理可最大程度地消除DBil的干扰。检验人员在做流式细胞检测时可以先查看标本胆红素结果,然后进行下一步操作,这样可以在繁忙的检验工作中提高检测速度,保证检测结果的准确性。


【参考文献】
[1] 薛燕,许俐,党利亨,王朝,等.高浓度胆红素对流式细胞术外周血淋巴细胞亚群检测的干扰和消除方法[J].检验医学杂志.2022,37(12).
[2] 姚林娟,方卉,何世波,吴俊男.异常样本状态对TBNK淋巴细胞亚群检测干扰与处理方法[J].中国卫生检验杂志.2022,32(11)
[3] 屈晨雪,王建中. 流式细胞分析的规范化和标准化[J]. 中华检验医学杂志.2021,44(12):1105-1108.
[4] 史晓敏,任娜,孙悦,等. 新生儿高胆红素血症对血清乙肝病毒表面抗原化学发光法检测的影响及消除方法初探[J]. 中华检验医学杂志.2019,42(1):51-56.
 

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编辑:yeah  审校:小冉

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