使用超长效重组胰岛素治疗猫糖尿病效果研究

1 简介
糖尿病 (DM) 是猫常见的内分泌疾病，估计患病率为 0.5% 至 2%。目前，猫的糖尿病治疗依赖于皮下注射胰岛素，通常每天两次，同时调整饮食。对于大多数猫来说，胰岛素治疗是终生的。即使对于那些获得缓解的猫，在诊断后至少几周内也需要胰岛素治疗。对于许多猫主人来说，每天两次注射和相关的喂养时间表对他们的生活质量和宠物的健康状况有显着影响；据估计，30% 的受影响猫在诊断后一年内被安乐死。主人经常将胰岛素相关问题视为焦虑的主要原因，包括担心低血糖事件和无法让其他人照顾猫。

胰岛素是一种由 51 个氨基酸组成的肽，容易形成六聚体，尤其是在有锌存在的情况下。注射到 SC 组织后，锌从 SC 库中扩散出来，六聚体分解成二聚体和单体，然后自由扩散到脉管系统中。一旦进入血液，胰岛素就会迅速到达目标器官。胰岛素与靶细胞膜上的受体结合后，胰岛素受体复合物发生内吞作用，然后胰岛素被胰岛素降解酶降解。为了延长作用持续时间，传统胰岛素制剂依赖于控制 SC 储库中六聚体解离速率来减缓胰岛素吸收到血液中。此外，降低胰岛素与其受体的亲和力也会延长作用持续时间。通过控制吸收率和受体亲和力，目前可用的胰岛素制剂具有适合用作每日一次或两次皮下注射的时间作用曲线。

在这里，我们提供了一种新型超长效胰岛素制剂 (AKS-267c) 的数据，该制剂每周给猫给药一次。该制剂中的活性分子是合成胰岛素和免疫球蛋白猫科片段可结晶 (Fc) 区域的融合蛋白。这种非免疫原性融合蛋白是胰岛素受体的配体，但也与宿主新生儿 Fc 受体 (FcRn) 结合。与 FcRn 的结合导致胰岛素融合分子在细胞内循环，与天然胰岛素相比，大大延长了其半衰期。来自健康实验室猫的初步数据表明，该分子的半衰期允许每周给药一次，从而具有延长的降血糖作用。我们假设，在患有天然糖尿病的猫中，这种 Fc-胰岛素融合蛋白可以通过每周注射一次来控制临床症状、体重和血糖浓度 (BG)。我们的研究是一项剂量递增试点研究，目的是评估每周注射一次 AKS-267c 维持或改善先前使用传统的每日两次胰岛素给药治疗的糖尿病猫的血糖控制的能力。

2 材料与方法
猫是从加州大学戴维斯兽医医学教学医院和当地兽医诊所招募的。如果猫之前被诊断患有自然发生的 DM（根据兽医内分泌学项目协议语言 [ALIVE] 对 DM 诊断的定义），并且已接受过任何胰岛素制剂（每次注射 ≤ 4 U）治疗至少入学前2个月。猫需要有中等到良好的血糖控制，定义为最小的临床症状和稳定的血清果糖胺浓度（至少相隔 3 周测量的 2 个血清果糖胺浓度，彼此相差在 100 mmol/L 以内）。纳入后，还通过在第一周内连续测量间质葡萄糖浓度（IG）来评估血糖控制程度（图 1和图2）。体重要求在3至8公斤之间，并且近期体重没有变化（定义为过去3个月内<5%）。最后，猫在研究登记时必须喂养一致的饮食，并期望每只猫在整个研究期间保持饮食类型和喂养方案的一致性。入境时没有要求喂养特定的饮食或特定的碳水化合物含量。

图1
用 AKS-267c 治疗一次的 5 只猫的 AKS-267c 剂量、血清 AKS-267c 浓度、平均间质葡萄糖（IG；前一周）和葡萄糖变异百分比（GVP；前一周）的中位数和四分位数范围每周。所有猫均在第 0 周接受甘精胰岛素治疗，并在第 1 周接受第一剂研究胰岛素 (AKS-267c)

图2
每日两次甘精胰岛素治疗的 5 只猫（左图：基线）和每周一次的 7 剂 AKS-267c 胰岛素治疗后（右图：第 8 周）的间质葡萄糖浓度。每个时间点代表 6 天测量的平均值±SD，x 轴代表 24 小时

排除标准包括不受控制的甲状腺功能亢进、既往每次注射胰岛素剂量>4 U、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 浓度高于参考区间 (12-92 nmol/L)、临床相关的并发疾病（可能排除跟踪患者 > 3 个月，这可能会影响胰岛素需求）、尿培养阳性、无法耐受快速血糖监测仪（见下文）以及过去 2 个月内有糖尿病酮症酸中毒史。

纳入研究后，获得了所有业主的知情同意。该研究方案得到了加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的批准（方案#19844）。第 1 次访视时，在加州大学戴维斯分校临床病理实验室进行了 CBC、血清生化检查、血清甲状腺素浓度、IGF-1 浓度、膀胱穿刺尿液分析、需氧细菌尿培养和尿蛋白：肌酐比值。在整个研究过程中使用了经验证可用于猫的快速血糖监测系统（FGMS；FreeStyle Libre，Abbott）。如前所述，将 FGMS 传感器应用到背外侧颈部的皮肤上。该 FGMS 每分钟测量一次 IG，并记录 15 分钟的 IG 平均值，持续时间长达 14 天。通过频繁扫描传感器可以获得每分钟的测量结果。本次访视后，猫出院 10 至 14 天，继续每天两次接受研究前胰岛素治疗，并确保患者遵守 FGMS。

第2次访视时，测量了血清果糖胺浓度，并进行了胸部X光检查和腹部超声检查。如果不满足排除标准，则应用新的 FGMS 传感器，并且猫接受第一次注射约 1 nmol/kg SC 的 AKS-267c。该剂量是根据健康专门饲养的猫的初步数据选择的，旨在接近 0.3 U/kg/d 的常规胰岛素剂量。预计在该剂量下不太可能出现低血糖，并且需要在接下来的几周内逐步增加胰岛素剂量以维持血糖控制。同样基于健康专门饲养的猫的初步数据，AKS-267c 的效果预计在注射后 24 至 36 小时内达到峰值。由于 AKS-267c 在患有天然糖尿病的猫中的效力尚未完全阐明，为了尽量减少低血糖的风险，猫在第一次注射后住院监测 48 小时。如果没有观察到低血糖，猫会在 48 小时后出院。除非研究人员另有指示，否则主人在家中不会注射胰岛素。

第 2 次访视后，每周对猫进行一次全面体检、收集药物浓度血清样本、更换 FGMS 传感器以及施用 AKS-267c 进行评估。根据 FGMS 数据、体重和临床反应（研究期间研究人员无法获得药物浓度数据），根据需要每周调整 AKS-267c 的剂量。总共，猫接受了 AKS-267c 7 次治疗（即 49 天）。在最后一次访视时，即第七次注射后 1 周，再次收集样本进行 CBC、血清生化检查、血清果糖胺浓度、尿液分析和膀胱穿刺尿培养，以及尿蛋白：肌酐比值，以评估潜在的药物不良反应。

AKS-267c 的浓度使用 Akston Biosciences 为本研究专门开发的夹心 ELISA 进行测量。简而言之，微量滴定板涂有纯化的抗胰岛素抗体，以捕获样品中的 AKS-267c 治疗分子，然后使用山羊抗猫 IgG-Fc-辣根过氧化物酶 (HRP) 检测抗体对捕获的 AKS-267c 进行定量然后是四甲基联苯胺底物系统。当四甲基联苯胺底物与与检测抗体缀合的 HRP 反应时，它会变色。通过添加终止试剂(1% H 2 SO 4 )来终止酶底物反应，并在酶标仪中在450 nm处测量颜色强度。

2.1 统计分析
所有变量的描述性统计均按中位数（范围）计算，并且由于研究中的猫数量较少，所有比较均使用非参数检验进行。 Wilcoxon 配对符号秩检验用于比较基线（第 0 周，第一次 AKS-267c 注射之前）和第 7 周（最后一次 AKS-267c 注射后 1 周）的组中值。所有统计检验均以 2 尾检验进行，P 值 ≤ 0.05 被认为是显着的。从 Libre CSV 文件中提取的原始 IG 数据是从基线开始的研究每周和随后的每周编译的，对应于研究胰岛素注射 1 至 7 次。对于每周，IG 数据包括从注射后第二天午夜开始的数据。传感器放置到 AKS-267c 注射前一天晚上的午夜（总共 6 天，不包括每周去医院就诊以尽量减少压力引起的高血糖影响的 24 小时）。这些数据用于计算一周的平均 IG 以及 SD、一周内各天之间的变异系数 (CV) 以及葡萄糖变异百分比 (GVP)，其计算方法如前所述。10简而言之，GVP 方法通过使用数据的三角分析来计算连续数据的线长度，并用作日内 BG 变异性的高级指标。10与 CV 和 SD 相比，它是一种更全面的变异性测量方法，因为它可以捕获幅度和频率的波动。将数据绘制成图表以表示每次访问当天获得的测量结果。因此，平均 IG 和 GVP 对应于就诊前一周（例如，第 1 周平均 IG 代表第一次注射 AKS-267c [基线]前一周期间使用标准胰岛素治疗，第 8 周平均 IG 代表第 7 周注射后一周）。

3 个结果
对 8 只猫进行了入组筛选，其中 3 只因以下原因被排除： 1 只猫患有不受控制的甲状腺功能亢进； 1 只猫患有不受控制的甲状腺功能亢进症和肝脏肿块；一只猫的糖尿病正在缓解。

在参与这项研究的 5 只猫中，2 只是绝育的雌性，3 只是绝育的雄性。其中有3只家养短毛猫和2只阿比西尼亚猫。中位年龄（范围）为 10（7-16）岁。中位体重为 6.6 (4.9-7.9) 公斤。身体状况评分中位数为 6 分（满分 9 分）（5-8 分，满分 9 分）。其中一只猫在研究开始时被喂食处方低碳水化合物饮食 (Purina Feline DM)，而其他 4 只猫则被喂食各种商业猫粮；在整个研究期间没有进行饮食改变。猫在入组前平均 11 (2-28) 个月被诊断患有自发性 DM，并且在入组时所有猫的 IGF-1 浓度均正常。通过全血细胞计数、血清生化检查、血清甲状腺素浓度、尿液分析、尿培养和胸部X光检查，未检测到临床相关合并症。一只猫的 FIV 呈阳性。这只猫在腹部超声检查中也有轻度肠系膜淋巴结肿大，但当时这些都不被认为是排除的原因，因为猫没有相关的胃肠道症状。在入组前，所有猫均接受甘精胰岛素治疗，中位剂量为 0.5 (0.4-0.6) U/kg，并根据家中最小或无临床症状、稳定的体重和稳定的血清果糖胺浓度被认为受到控制。基线时，中位血清果糖胺浓度为 556 (318-628) μmol/L，基线时的周平均 IG 为 314 (247-327) mg/dL。

AKS-267c 的起始剂量为 0.83 (0.72-1.53) nmol/kg。周平均 IG 在第 2 周趋于增加，但随后随着研究胰岛素剂量的调整而在整个研究过程中下降（图 1）。 5 只猫中的 4 只在第 2 周增加了胰岛素剂量（增加了 27%-55%），这 4 只猫中的 3 只在第 3 周增加了胰岛素剂量（增加了 17%-21%）。此后，这 4 只猫的 AKS-267c 剂量每周减少或保持不变，直到研究结束。在第 5 只猫中，剂量在第 2 周没有变化，但在整个第 6 周逐渐增加。在第 7 周，5 只猫中 AKS-267c 的中位最终剂量为 1.11 (0.46-2.92) nmol/kg。

在最后一次访视（第 8 周）时，周平均 IG 的中位数（范围）与基线（148 [76-355] mg/dL；P  = .3）、血清果糖胺浓度（454 [290-641] µmol/L）与基线没有差异（P  = .6；图 3），业主报告临床症状得到良好控制，体重与基线几乎相同（6.5 [5.0-7.8] kg；P  = .5；图 4 ).血糖变异性在第 1 周时相对于基线呈下降趋势，并且这种趋势在整个第 7 周持续（GVP = 158% [107-268] vs 75% [50-159]；P  = .09；图 1和图2）。基线和治疗最后一周之间，CV 或 SD 没有观察到显着变化（数据未显示）。

图3
5 只糖尿病猫在基线（每日使用甘精胰岛素治疗）和第 8 周（每周使用 AKS-267c 治疗一次，持续 7 周）时的血清果糖胺浓度。

图4
5 只糖尿病猫在基线（每天接受甘精胰岛素治疗）和第 8 周（每周一次 AKS-267c 治疗，持续 7 周）时的体重

大约 40 ng/mL 的血清 AKS-267c 浓度相当于良好的血糖控制（以平均 IG < 200 mg/dL 表示）。第 3 次注射后，4 只猫达到了这些浓度。尽管剂量稳定，但血清胰岛素浓度在接下来的两周内继续增加，表明药物蓄积。第 8 周（最后一次给药后一周）的药物浓度表明 AKS-267c 在糖尿病猫中的半衰期约为 2 周。

在整个研究过程中，两只猫的 IG 结果均未低于 70 mg/dL。与基线相比，其他 3 只猫在治疗最后一周出现低 IG 的情况更为频繁。在这 3 只猫中，基线时 IG < 70 mg/dL 的总时间为 0%、4% 和 5%，第 7 周时分别为 12%、9% 和 52%。基线时 IG < 40 mg/dL 分别为 0%、0% 和 1%，第 7 周时，所有 3 只猫的 IG < 40 mg/dL 分别为 4%。没有任何猫报告出现临床低血糖。根据每周体检以及研究结束时的血液和尿液检测评估，整个研究期间没有报告局部注射部位或全身不良事件。

在 1 只猫中，由于缺乏 DM 临床症状、血清果糖胺浓度正常且第 7 周期间平均 IG = 76 mg/dL，研究完成后停止胰岛素治疗，该猫目前处于缓解状态（12 个月后） 。这只猫在入组前 4 个月被诊断出患有 DM。它是最后加入该研究的，并根据之前 4 只猫的经验，在第 1 周接受了最高剂量的 AKS-267c (1.53 nmol/kg)。这只猫的周平均 IG 从基线时的 247 mg/dL 降至第 3 周的 121 mg/dL，并且剂量从第 3 周到第 7 周逐渐减少。猫的 GVP 基线时为 157%（等于组中位数），但第 3 周下降至 56%，并且从第 3 周到第 7 周一直是该组中最低的（范围从 37% 到 76%）。

在其他 4 只猫中，应主人的要求，研究结束后继续使用 AKS-267c。研究结论两个月后，FIV 阳性的猫被诊断患有胃肠道大细胞淋巴瘤并被安乐死。其他 3 只猫在服用 AKS-267c 后 5 和 18 个月内继续得到良好控制，没有报告不良事件。

4 讨论
在我们的研究中，5 只患有天然糖尿病的猫从每日两次胰岛素注射转变为新型超长效融合胰岛素配方。治疗 7 周后，每周一次的制剂在控制临床症状、体重和血糖方面同样有效。这些积极成果是在没有临床低血糖证据和不良事件的情况下实现的。每周一次和每天两次的血糖控制没有什么不同，前者为猫和宠物主人提供了相当大的好处。

对于人类来说，增加任何药物的给药频率都会降低对治疗方案的依从性。对于糖尿病患者来说，注射胰岛素的疼痛加剧了依从性差。人类患者认为胰岛素注射是一种严重的负担，并且对生活质量产生负面影响。虽然尚未对给猫注射胰岛素的人的依从性进行研究，但预计人类患者所注意到的问题将因对猫进行重复注射的身体和情感挑战而变得更加复杂。目前尚不清楚注入行为本身如何影响合规性以及业主的短期和长期治疗决策。尽管并非完全与这些问题相关，但可以合理地假设，糖尿病诊断后不久的高安乐死率 (30%) 与依从性问题有关。每周一次注射可能会最大限度地减少这些障碍，从而取得更大的治疗成功，改善宠物和主人的生活质量，并提高患者的生存率。在这种情况下，不仅要考虑治疗选择本身，还要考虑它如何影响监测强度和成本也很重要。与变异性较大的制剂相比，导致日内和日间变异性较小的胰岛素可能需要更简单的监测方案。导致胰岛素剂量日间变化的主要因素之一是大小和形状各异的胰岛素晶体吸收不稳定。相反，AKS-267c不会在SC组织中沉淀，而是在SC细胞中再循环，从而延长作用持续时间。再加上 AKS-267c 可能会在治疗几周内达到稳定状态，可能有利于减少日间变异，使兽医和客户更容易长期监测 AKS-267c。

在整个研究过程中，与基线胰岛素相比，研究胰岛素的血糖变异性较低。在施用研究胰岛素后第一周观察到这种变异性差异，即使平均 IG 正在增加。考虑到最近的证据表明猫的葡萄糖变异性降低与糖尿病缓解频率增加相关，降低葡萄糖变异性可能很重要。在那项研究中很难辨别葡萄糖变异性降低是否是血糖正常化的原因或影响，但本文介绍的猫的事件顺序表明，血糖正常化并不是 GVP 降低的原因。在研究结束时实现糖尿病缓解的 1 只猫开始时血糖变异性不显着（即 GVP 等于组中位数），但在使用研究胰岛素后，该猫的血糖变异性迅速下降，并且始终是该组中最低的。第 3 周以后。从第 3 周开始，与其他 4 只猫相比，该猫每周观察到的最低 GVP 相当于最低的平均 IG。

血糖变异性不仅受到胰岛素浓度波动的影响，还受到压力和膳食碳水化合物等其他因素的影响。在这里，猫的膳食碳水化合物含量没有标准化，但在基线测量期间和接受研究胰岛素时，每只猫都按照相同的饮食和相同的时间表喂食。因此，饮食不太可能导致基线和第 8 周之间 GVP 的差异。然而，从食物中吸收碳水化合物很可能导致整体 IG 的日内波动。

由于我们的研究是第一项评估这种新型超长效胰岛素制剂对糖尿病猫的疗效的研究，因此我们只招募了控制良好的患者，目的是将新型胰岛素制剂与标准胰岛素制剂进行比较。我们没有包括新诊断的猫，因为最初担心血糖控制可能需要比平时更长的时间才能实现，从而使新诊断的猫面临酮症酸中毒的风险。因为我们正在观察对这种新型胰岛素制剂的血糖反应，所以我们倾向于更快地增加胰岛素剂量，并最终对后续参与者开始更高剂量的治疗。然而，考虑到药物随时间的积累（由于半衰期延长>1周而导致），未来仍建议保守的起始剂量和较低的剂量增加率。这种方法对于新诊断的患者尤其重要，因为糖脂毒性的解决可能会导致胰岛素敏感性增加、β细胞功能改善以及对外源性胰岛素的需求迅速减少。尽管与短效制剂的治疗没有什么不同，但在使用超长效制剂时，特别是在接近正常血糖和即将糖尿病缓解时，建议在这方面更加谨慎。

与新诊断患者的情况相反，根据这些患者之前对甘精胰岛素治疗的反应，我们还估计了目标胰岛素剂量。作为最大限度降低低血糖风险的预防措施，我们的初始起始剂量约为 0.3 U/kg/d（或 2.1 U/kg/周），而 1 U/kg/d（或 7 U/kg/周），猫已经受到控制的甘精胰岛素剂量。每单位甘精胰岛素含有 6 nmol 胰岛素。出乎意料的是，在研究结束时，控制血糖和临床体征的 AKS-267c 剂量仅为 1.1 nmol/kg/周，而甘精胰岛素每周总剂量为 42 nmol/kg。与甘精胰岛素相比，AKS-267c 的效力相对较高，这可能是由于甘精胰岛素在 SC 储库中的停留时间增加，使其暴露于组织蛋白酶的降解，并有效降低最终扩散到血液中的完整胰岛素的剂量。与其他 SC 制剂相比，AKS-267c 的作用持续时间延长并不依赖于减慢 SC 组织对胰岛素的吸收，而是依赖于细胞内循环。 AKS-267c 可以自由地从 SC 组织扩散到血液中，并分布到全身。 FcRn普遍表达于上皮、内皮、造血来源的细胞和其他细胞中。与 FcRn 结合后，AKS-267c 会经历胞饮作用并最终发生胞吐作用。在细胞内，AKS-267c 与 FcRn 的其他配体类似，受到保护免受蛋白水解。

在大多数胰岛素制剂中，SC 储库吸收的延迟依赖于胰岛素六聚体的形成，该过程是胰岛素浓度和胰岛素与其他分子（例如锌、鱼精蛋白或间甲酚）的精确比例的函数和局部组织的pH值。这明显限制了改变胰岛素制剂浓度的能力，也是过去稀释制剂未能维持较长作用持续时间的原因。由于 AKS-267c 的长作用持续时间不依赖于减慢 SC 组织对胰岛素的吸收，因此它可以配制为任何浓度，使其在小动物中使用极其方便。

在整个研究过程中连续测量间质葡萄糖浓度，但这些数据主要用于帮助剂量调整，其次用作结果测量。尽管猫的最佳 IG 目标尚不清楚，但猫的最佳 BG 目标也尚未确定。此外，虽然有更多关于 BG 目标的数据，但可以认为在调整胰岛素剂量时依赖 IG 会更安全，因为 IG 更好地反映了组织对胰岛素的生理需求，并且因为它们提供了更广泛的趋势视角而不仅仅是单个时间点。在识别亚临床低血糖事件方面，使用连续血糖监测系统 (CGM) 尤其重要。我们研究中使用的 CGM 最近经过验证可用于猫，显示 BG 和 IG 之间具有良好的相关性。然而，与其他用于人类的血糖仪一样，该 CGM 低估了猫的葡萄糖浓度 23.3 ± 18.1 mg/dL。虽然这种 CGM 的性能在低血糖范围内没有得到很好的研究，但这种偏差很可能在某种程度上也延伸到了该范围。这种可能性意味着我们研究中低 IG 事件的频率可能高估了真正低血糖事件的频率，这可能解释了为什么我们没有观察到临床低血糖。未来，开发猫科动物特异性 CGM 系统、IG 目标和监测方案将非常重要，以优化每周一次的胰岛素制剂的使用。

总之，AKS-267c 是一种很有前途的制剂，每周只需注射 1 次，即可临床控制猫的 DM。尽管之前缺乏该制剂的任何临床经验，但使用 CGM 数据在几周内实现了血糖控制，没有发生临床低血糖事件。每周一次 AKS-267c 足以维持体重和血清果糖胺浓度。未来的临床试验应检查以更低频率的 AKS-267c 给药控制猫的糖尿病的能力，并制定将其安全引入新诊断的糖尿病猫的方案以及如何从标准胰岛素制剂过渡到它。