读博记 第1篇
去年，我终于博士毕业了，7月25日答辩，10月25日领取了学位证。
一直想着写一篇读博记，系统记录一下这段堪称曲折的岁月，也和大家分享一些那些在实验室内不为人知的内情。
然而领取学位证后仅仅五天，我就住院了，身体一直在缓慢恢复，终于于最近才又有点精力把这篇文章写了。
图1 2023年7月25日博士论文答辩留影
我这个博士读得并不容易，可谓是一波三折。本来学制是3年，结果硬是读了6年才毕业。为了研究痤疮（痘痘）的原因、寻找解决方法，这中间经历的困难与曲折实在太多了。
从最初观察到一个现象，再提出一个推测（假说），然后去验证并寻找解决方法，前后加起来花了10年。
到底是什么原因让我花了这么久的时间呢？
一个偶然的发现，
让我想做一个“自不量力”的研究
我的研究花费了这么多时间，主要原因之一我希望做的课题比较大。
多年前关注我的资深读者都知道2012年我决定去读硕，研究皮肤，主要目的是想探索痤疮——也就是痘痘背后的秘密。
很幸运地，在硕士期间我发现了一些与教科书上非常不同的事情，简单来说，就是：100多年来人们一直认为痤疮丙酸杆菌是痤疮的首要相关微生物。此菌有一个特点，就是在长波紫外线下发出红色荧光，且红色荧光的强度与其数量呈线性相关。
图2 不同微生物在可见光和紫外荧光下的照片: a2示痤疮丙酸杆菌发出红色荧光（引自冰寒硕士学位论文）
但我在观察痤疮患者皮肤的时候发现，绝大部分长痤疮的毛囊中没有什么红色荧光，而绝大部分未长痤疮的毛囊内却以红色荧光为主（图3）。
图3 痤疮患者皮肤的紫外荧光和可见光显微图像：示发生痤疮的毛囊（蓝色圈）基本无红色荧光（引自论文[1]）
这促使我开始怀疑痤疮丙酸杆菌与痤疮的关系，以及推测其它微生物与痤疮是不是也可能有关。通过对皮肤荧光的研究，我在国际上首次提出“痤疮可能不是一种单的疾病，而可能是与多种微生物相关的毛囊炎系列”。这篇论文在2016年发表于Experimental Dermatology，引起了相当大的争议（详见旧文：
世界会为理想让路-https://zhuanlan.zhihu.com/p/21307909）。
100多年以来，学界谈论痤疮与微生物的关系时，主要都聚焦在痤疮丙酸杆菌上，但我在进行系统的文献回顾后，结合自己的研究实践，认为痤疮丙酸杆菌已经成为痤疮与微生物学研究事实上的透明天花板，提出研究不应当仅仅局限于该菌，而应该把目光放得更广一些，应当考虑多种微生物在痤疮中的作用。
但是，痤疮与其它微生物到底有没有关系？有怎样的关系？我也没有证据。所以我计划在博士期间就此展开研究。
这个课题并不被看好。我据此写的本子申请某竞争很激烈的基金，被否了，其中一位评委的评语与其说是评论，不如说是侮辱。但是我决定不惜代价，哪怕自己花钱也要把这个课题做下去。
但要完成这样一个课题是非常困难的，因为工作量异常庞大。
大到什么程度呢？
2018年我博士论文开题的时候，有位辅导专家比较尖锐地说：“你有没有感觉自己（作为一个博士生）的课题太大了？一个博士生想要完成这么大的一个课题，工作量这么大，你的工作时间够不够，而且，经费需要得很多，你经费从哪里来？”我感觉他有一句没好意思直接说出来，就是——
“你未免太自不量力了”。
听了这话我内心是有一点不爽的。做都还没有做，凭什么就觉得我没有这个能力做出来呢？所以我有点赌气地说：“是的，我知道工作量非常大。但我不着急毕业，我做完为止。关于经费，我已经和夫人商量过了，她同意支持我的研究，已经准备好一笔钱给我做研究用，不够了再追加。”
然后……大家也都没话讲了。最后，课题还是按我自己的构想开干了。
研究不是你想做就能做
数个基础问题要先解决
回到前面的问题：到底有没有其它微生物与痤疮有关？
首先我们需要知道痤疮患者皮肤上的微生物数量与结构（也就是微生物组）与健康皮肤有什么样的差别。
由于痤疮是一种毛囊为中心的问题，因此我们猜测需要重点关注毛囊内的微生物组。如何获取毛囊内的微生物组呢？这又是一个问题。
之所以提出这个问题，是因为过去谈到皮肤的微生物组，多数是用拭子、刮擦之类的方法在一个皮肤区域上取样，这样很便利，但带来的问题是无法区分健康毛囊和长痤疮的毛囊，也不能区分皮肤表层和毛囊内部的微生物，获得的样本是混杂的，因此对于病因学研究来说，结果可能不够准确。
但是，过去并没有人按这种思路去研究过毛囊内的微生物组，所以在正式研究开始之前，我至少需要完成三件事：
1、要证明一种采样方法，可以完整获取毛囊内的微生物组（如果方法都不合适，数据就肯定不可靠）。
「这项工作于2018年完成，发明了一种新的组织包埋方法被命名为“The Ice Method”，证明单个粉刺毛囊精确取样方法可以完整地获得毛囊内的组织并保持微生物于原位，因而适合于痤疮皮损毛囊内的采样。该方法的发明专利已授权，论文2022年发表于Skin Research & Technology。详情可参见旧文：我花了不到1000块做研究发了篇SCI论文，结果。。。。」
2、要证明精确获取痤疮皮损毛囊内的微生物组这种采样方法对于痤疮研究有否必要，那就需要使用多种方法对患者的皮肤微生物组进行取样和分析，并进行比较。
「这项工作于2021年完成，论文正在投稿中。简单地说，就是我们发现不同取样方法对同一患者的皮肤进行微生物组取样，使用同样的扩增、测序、分析方法，最后得到的结果差异甚大，因此确有必要在痤疮研究中，采用单个皮损精确采样方法」
3、对痤疮患者皮损毛囊内和健康皮肤毛囊内的微生物组进行定量分析，并比较差异。（差异的部分，就是可能影响痤疮关键过程的部分）
我希望研究结果尽可能可靠，所以设定的样本数量较大，痤疮组和健康皮肤组各40人（为了确保40人入组，我实际上要取到45人以上）。
由于样本比较珍贵，所以我同时又对样本规划了脂质组、荧光光谱等研究，而这背后都是更大的工作量、更长的工作时间、更多的烧钱。
到2020年11月，我完成了痤疮患者皮损毛囊内的样本取样，接下来就是要一边对完美皮肤取样，一边穿叉处理这些样本了。此时遇到两个较大的困难：
一是健康皮肤（完美皮肤）志愿者十分难找。我在微博等渠道多次招募，先后走遍上海（宝山、松江、闵行、金山）、苏州、武汉、北京、郑州、西安、长沙计10地，在各方老师和朋友们的帮助下，才终于2021年1月27日取够了45人的样本。
图4 2020年12月2日发布的志愿者招募启事
2021年1月7日我曾记录：“碰巧认识了一位完美皮肤的姑娘，介绍了我的研究，并请她做我的志愿者。她非常热心，和我说他们办公室有很多很多皮肤都非常好的姑娘，于是带着我到办公室去看，有没有合适参与的志愿者。结果看了一圈，没有一位符合要求。”
是的，完美皮肤志愿者就是难找到这种程度。
二是当时疫情严重地影响了工作，学校和医院方面也很谨慎，我要去外地必须打报告，签责任书、承诺书，导师直到主管副院长签字批准。形势一紧张我就哪儿也不能去了，只能断断续续采样。
为了获得背景干净、尽可能无掺杂的样本，我还需要对每一位志愿者进行严格筛选，确保皮肤是“完美”状态。为此，我在江浙沪地区取样时，都是自己带着显微镜和Visia，对报名前来的志愿者逐一检查，这样又会淘汰掉至少50%的自认为皮肤完美、且我们通过照片也认为比较完善的人群。
在江浙沪以外采样时，尽量借用当地老师或朋友的实验室，我自己扛着显微镜过去。
图4 2021年1月7日带着Visia在苏州取样
样本取下来后，必须用干冰冷冻运回上海，冻存之后再统一处理。
完美皮肤样本的处理十分麻烦。因为我们要获取的是毛囊内的样本，因此采用的是粘取法——用胶膜把毛囊里的汗毛拔一些出来，这些汗毛十分细小，一个样本中最少有2-3万根。
图6 从完美皮肤上获取得毛囊内样本，镜下一个视野中有437根汗毛
而我要做的事就是把这一根根汗毛从胶膜界面上截断（如图7红色位置所示），从而获取汗毛上的那一点点显微镜下才能看得出来的样品（如图7黄色箭头所示）。
图7 实际取样点
这是一项极其耗费时间和体力的工作，必须全神贯注地进行，所有操作都在显微镜下利用显微手术器械完成，并且样本一旦从冰箱拿出来后需要一次处理完，不能做不完再冻回去下次再拿出来处理，每个样本要耗费6-8小时，我总是在晚饭后（4-6点）开始工作（这样中间就不会被吃饭或其它事情中断），至凌晨2-3点结束，经常累得腰都直不起来。
完美皮肤的样本采集和处理从2020年8月24日开始交叉进行。夜晚的实验室是如此孤独，以至于我后来每天晚上在B站开着直播做实验，对着镜头默默地处理样本，偶尔和网友聊两句。
到2021年2月，终于完成了所有样本的处理工作，送测序实验室进行测序。
你以为这些工作做完就完了？并没有。
上面说的只是开胃菜
更多的工作在此之外
通过微生物组的高通量测序数据，我们可以对完美皮肤和痤疮皮肤的微生物组进行差异分析，那些差异比较大的，可能就是和痤疮发生关系更密切的，我把它们称为“痤疮相关关键微生物”。
假如我们怀疑一些微生物对痤疮的病理可能有影响，那么我们就必须把这些微生物分离培养鉴定出来，然后，再用这些微生物作用于细胞模型，看看到底有没有影响，以及有何影响。
不幸的是，我们组并没有我研究需要的细胞，这就导致我必须自己从人体皮肤中去分离和培养痤疮发生相关的细胞，特别是皮脂腺细胞。
更不幸的是，我在硕士期间做过细胞相关的研究。
皮脂腺细胞是一种特殊的细胞，需要非常精细的显微手术操作才能从皮肤中把皮脂腺分离出来，而后进行培养。
假如没有细胞作后面的功能验证，则前面的微生物组学研究的实际意义就要打折扣了——因为它们顶多只能证明相关性，但不能证明因果性。
因此，2017年秋入学后，我首先根据自己的课题需要的知识和技能把各项相关课程选满，超出学分上限要求的没有办法选了，就根据课表去旁听。
对于医学基础研究的几门重要的课程：细胞和组化技术、分子生物学实验技术、现代免疫学、仪器色谱分析、生物信息学这些，我全都选上了，大部分时间在学校上课，课业之余就阅读文献、翻译著作、写书、完成一些小的课题，作一些方法学上的准备。
这样做的后果是：大部分同学只要上一学期的课，2017年底就可以入实验室开展课题工作，而我2018年夏天才完成了学校课程，7月份才到课题组实验室开展工作。
这时，我的导师开始担心了……（未完待续，明日推送）
参考文献
[1] De-Tian Xu, Xian-Long Qi, Yong Cui, Wei Liu. Absence or low density of Propionibacterium acnes in comedonal lesions of acne patients? A surface to inside study of skin fluorescence[J]. Experimental Dermatology, 2016, 25(9): 721-722.
☑ 节点回顾
1. 2013年-2016年读硕期间，我提出“痤疮可能是与多种微生物相关的毛囊炎系列”，该论文于2016年发表；
2.2017年秋考入同济读博，一直恶补各项课程，一直到2018年夏天才完成了学校课程，7月份才到课题组实验室开展工作；
3.2018年我的博士确定选题，在正式研究开始之前，我需要解决数个基础问题，每一个问题都需要大量精力，特别是需要分离培养用于实验的两种关键细胞；
4.2020年11月，我终于完成了痤疮患者皮损毛囊内的样本取样，2020年8月24日到2021年年初，辗转数10个城市，成功取到45人的完美皮肤样本，取样工作和处理样本工作交替进行，直到2021年2月才完成样本处理。
作者简介：
理性护肤运动发起人，同济大学皮肤学博士，英语高级口译译员，创办中国第一个私人非盈利性皮肤学实验室，专注于美容皮肤学、皮肤和化妆品的关系研究。
著作：《素颜女神：听肌肤的话》、《享瘦之门》、《听肌肤的话2：问题肌肤护理全书》；
译作：《药妆品》(Cosmeceuticals)第3版、《防晒与光防护临床指南》、《美国皮肤学会痤疮治疗和护理指南(2016版)》、《黑素与黑素小体》、《瘙痒》中文第2版；
第一作者和通讯作者论文发表于Experimental Dermatology、Journal of Cosmetic and Laser Therapy、Dermatology、Skin Research & Technology、Photodiagnosis and Photodynamic Therapy、Biomedical Signal Processing and Control、《临床皮肤科杂志》、《中国皮肤性病学杂志》、《中国美容医学》、《中华皮肤科杂志》等。
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