读博记 第3篇
往期回顾：
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细胞，它死了
进入细胞实验阶段，有了自己的细胞实验室，想想没什么特别困难的了，都是通用技术嘛！中篇提到：就我这个实验而言，微生物有了，细胞有了，把微生物加到细胞里，隔段时间收样，再做测试就可以了。
于是开始进入预实验，我在皮肤实验室把菌液制备好，师妹在那边把细胞准备好，菌液拿过去按设定的浓度一加，隔了一晚上看细胞状态……不对，细胞呢？？？
满眼都是黑乎乎的东西……细胞一看就都死掉了。这是怎么回事呢？
图1 隔夜观察细胞，满眼都是“乌云”
原来我们加进去的是活菌，这是参考了早年的几篇文献作出的决定。
简单来说，以前有人用加热或甲醛灭活的细菌去处理细胞，其结果与活菌处理的结果并不一致。
我分析后认为应当用活菌，因为加热或甲醛灭活可能会影响微生物的免疫原性（引起免疫反应的特性），那么就参考另一篇文章用活菌来处理细胞。
培养细胞的培养基营养非常丰富，是无菌的，为了防止在培养过程中有其它微生物在培养基中生长，通常都会添加两到三种抗生素的组合（被称为双抗或三抗），理论上，这些抗生素能阻止大多数微生物的生长，那么我们加入活菌的话，按常理，它在里面就不能生长了。
然而，我没有想到的是从痤疮中分离得到的某些微生物异常强大，培养基中添加的通用种类和水平的双抗或三抗不能阻止其生长。
于是，它们15-30分钟分裂一次，一个晚上下来，就能占据整个培养皿，而细胞在它们强大的攻势面前，就只有死亡一条路了，也就是图1中的场面。
因此，用这种样本做出来的ELISA和QPCR结果是完全不准的。
随后，我们尝试了超声灭活、反复冻融、紫外照射等等不影响免疫原性的方法，都无法做到完全灭活某些微生物。
这时，我想到或许可以用其它抗生素来灭活，因为抗生素的作用原理是抑制微生物自身关键成分（如蛋白或核酸）的合成，从而使之细胞壁穿孔死亡或者生长停滞，但对已经存在的微生物成分的结构、性质并不会产生影响，也就是说：不会影响免疫原性。
巧的是，因为我硕士期间就对不同痤疮来源的微生物做过抗菌谱筛选试验，很多种抗生素对哪个菌有用，我是有数据的（图2）。
图2 12种抗生素对8种微生物的抑制能力雷达图（冰寒实验室，未发表数据）：不同颜色的线代表抗生素，各轴代表微生物，线在轴上的位置代表抑菌能力大小
既然如此，我们在培养基中加入其他抗生素，只要该抗生素既能抑制这些微生物，又不会对细胞的活力造成影响就可以了嘛！那么，就需要获得三种数据：
一是：哪种抗生素可以抑制这些微生物？
二是：该抗生素多大浓度可以抑制这些微生物？
三是：抑制微生物的这个浓度会否影响细胞的活力？
关于第一个问题，我是有答案的，图2中那条粉红色线就是（出于避免误导的原因，这里就不提具体名字了）。
于是我们展开实验，确定余下的两个数据。最理想的情况是抑制微生物的浓度刚好低于影响细胞活力的浓度，我们很期望得到这样的结果。
然而，实验的结果恰恰相反：
该抗生素完全抑制微生物的浓度是300μg/ml，但超过100μg/ml就会抑制细胞的活力，这可怎么办呢？（人的细胞为什么这么娇弱？！）
大家读到这儿，可以停一下，想一想，该怎么办。
图3 用低于影响细胞活力的某抗生素浓度（<100μg/ml）处理微生物，结果微生物仍能茁壮成长
(想想)
(再想想？)
或许是我脑子轴住了，冥思苦想了好几天，终于想到了解决办法——那就是分两步处理：
第一步是先配制高浓度的菌液（比如10倍于最终添加的浓度，也就是10×母液），在母液中添加300μg/ml的抗生素，置于4℃中放置一夜（低温下微生物不会繁殖，这样定量就可以保持准确，同时抗生素又可以起作用）；
然后在把灭活好的母液加入细胞培养基中，菌的浓度就被稀释了，同时，培养基中抗生素的浓度也就远低于100μg/ml了。
经过预实验验证，这个方法完全可行。现在回看起来这个做法非常简单、非常容易，但那时候确实非常困扰我。
当得到这些数据和方法的时候，已经是2021年11月下旬了，所以2021年毕业已经是不可能了。
当然，2021年所做的工作非常多，主要是大量的预实验，得到了很多有用的数据，比如：
1）确定处理细胞的阳性对照物应该用什么？国际上有人用脂多糖（LPS），也有人用肽聚糖（PGN），哪个更好？阳性对照物用什么浓度好？
2）基因表达实验，到底应该在什么时间去收样？（最后我们发现角质形成细胞[KC]和皮脂腺细胞[SC]对相同刺激因素的反应时间不一样，因此不能在同一时间收样测试）。
3）微生物组和脂质组的预实验和正式实验，这中间涉及到大量的处理方法，包括用什么样的DNA提取试剂盒？用什么测序方法？16S全长测序和非全长测序结果哪个更可靠？用什么把脂类分离出来等等。
工作的繁杂程度，现在我回想起来都感到头皮发麻。
好在2021年9月，脂质组和微生物组的数据都出来了，接下来是要做各种分析。幸得我们组有一位生物信息学分析高手，严国荣博士，我希望尽可能多地从多个维度（荧光光谱、脂质组、微生物组、性别、年龄、皮损类型）去分析这些数据，看看是否可能建立某些关联，因此要考虑的因素和分析的工作量非常大。
我不断找严师兄讨论方案，然后他通过代码来实现，这些数据最终在2023年3月才全部分析完。
当前面所述的1）、2）项预实验都完成，已经是快过年了。我想，虽然2021年没能申请毕业，但现在这些准备工作都已经做完了。
那么，过完年，就只剩下个尾巴了，也就是微生物处理细胞的正式实验，包括基因表达和蛋白测试两部分。按理说，干上三个月应该就能结束了，那2022不是刚刚好能赶上毕业？
2022年，准备甩开膀子大干！
带着这种憧憬和2021年这一年辛苦解决的各种关键问题的答案——以及因解决这些问题而来的满满的收获感，我这个年过得不错，想着假期养精蓄锐一番，开年就能开足马力大干快上了。
天有不测之风云，谁能想到知道2022年3月会发生什么？2月份和刘玮老师在杭州开了个会，很多人在夸上海管理得好，很精准。刘老师慢悠悠地说了句：“我觉得上海是没有报出来”，当时我们都当是开玩笑。
结果回上海后没两周，上海的形势骤然紧张，才开始是徐汇区，而后是北蔡，再后来是整个浦东。
然后从4月1日起，漫长的两个多月。。。。你们都知道发生了啥。实验室？做实验？想都别想啦，连门不能出，每天核酸，然后回家呆着。
那一段时间我是焦虑的，时常担心未来会怎么样，白头发都出来了。
家里也开始不太平。主要是长时间上网课(而且还很不可思议，什么体育劳动美术音乐全都一节不落，实际上毫无效果，完全形式主义)，冰宝的学习和行为习惯急剧变差，开始迷恋电脑、手机、聊天，甚至偷偷通宵在网上看小说。
为此和她斗智头勇，家里隔三岔五山崩地裂、火花四射。这日子简直不堪回首，至于网课的教学质量，必然惨不忍睹。
我一边整理之前的实验结果，把已有的结果先写到论文里，一边陪“公主”读书。实在也做不了其他事，就在家里审校《黑素与黑素小体》的稿子。
终于等到6月28日，孩子放暑假，我们也可以出门了。我迅速带着孩子离开了上海，前往广州呆了半个月，然后往重庆和三峡，最后回到老家，直到8月17日才回到上海。为什么要这么做呢？
因为我看到孩子变成那个样子，有时实在感到有些万念俱灰。但同时我也在想，为什么会这样？
我想原因更多的是长期封闭性的环境和禁足，使得她生活中没有了乐趣和接触其它事物的机会（别说是孩子，当我走出小区的那一刻，都感到世界非常不真实）。
我想如果这样发展下去，别说成绩一落千丈，可能连基本的心理和生理健康都保不住。所以我想带着她去感受这个世界。
读书是重要，但有个健全的心理和身体更重要，对她如此，我也一样。至于我的实验，相比起孩子一生的身心健康，也要往后面排一排了。
图4 2022年7月26日，冰宝在老家的山溪里玩小鱼，这是她第一次见到这么清澈的小溪和接触这么小的鱼秧
现在回过头来看，我当初的这一决定是正确的。我们听风、看水，去田野、爬高山，游大江、涉小溪，见不同的人、吃不同的美食。在这个过程中，我们有了许多与以往不同的共同体验，而这些又成为加深亲子感情的纽带。
长时间地旅行和相处，又是放下手机、深入交流的机会。经过这段时间之后，她的心性逐渐又回到正常的轨道，现在已经彻底放下了手机。
时间到2022年下半年了，孩子慢慢回归正轨，我也该继续课题的工作了。
然而，一个又一个坑纷至沓来。
那一刻，我真想拎起刀子去厦门！
我们开始做ELISA和QPCR实验，我想年前还有几个月总可以完成工作了吧，但我总感觉ELISA的预实验结果不对劲，因为结果重复不出来，一定是哪里有问题。QPCR实验的结果也不太对劲，因为数据跳动总是很厉害。
就这样来来去去排查各种原因，就是没找到，一晃就又过年了。此时我内心已经有些着急了，因为到2023年，就是我读博的第六年了。
虽然按以前的规定还可以再延期，但确实已经读得太久了，之前比我低两届的师妹当初还是我带着她养细胞呢，结果她都已经博士毕业了，我还在这儿。
2023年3月份，基础实验室的小师妹在排查原因时，突然发现：我们用的厦门某公司出的ELISA试剂盒竟然是作假的！因为把这个试剂滴到蒸馏水里，它也能显色！
我要简要解释一下ELISA显色的事情。简单地说，就是我们检测某个样本里是否有某种蛋白，就用针对这种蛋白的ELISA试剂盒让它显色，颜色越深，代表浓度越高；反过来，如果没有这种蛋白，就不会显色。
但蒸馏水它也能显色，意味着什么？就是说没有蛋白它也能给你“测”出“蛋白”来，这结果不可能是真实的！
图5 2023年3月发的朋友圈
也就是说，这家公司的假试剂，白白浪费了我们起码大半年的时间、上十万元费用以及与之对应的精力与劳动。
那一刻，我真地想拎起刀子去厦门。我知道学界有假试剂的问题，但没想到这事儿会真实地发生在我身上！
问了一下我认识的另外一个试剂销售商，他跟我说这家厦门的ELISA板子卖得到处都是，也就是说，受害者甚众！
而究其原因，一是它比进口板子便宜（进口板子每块要几千至一两万，这家厦门公司的仅售一千多），二是大家并不知道它作假。
图6 进口ELISA试剂盒的一般价格
（便宜的五六千，贵的一两万）
但我不可能真去捅人的。遇到这样的事情，我只能想接下来怎么做去解决核心问题。
我一边让师妹去和这家公司的代理商交涉，要求退款和赔偿。人家脸皮那么厚怎么可能赔偿呢？但是在铁证面前，他们无法抵赖，只答应把我们采购的板子退款掉。
图7 2023年3月30日，无良试剂公司退款了
一边咬紧牙，重新订购国外知名公司的ELISA试剂盒，一百多个板子，数十万元支出……
但我苦苦追寻研究了10年，好不容易做到这个阶段，绝对不能接受一个假的结果，哪怕再贵，也要把真实的结果做出来！
那时，疫情管制刚放开不久，国际物流还没有完全恢复顺畅，这些试剂（板子）国内也不一定有现货，需要从国外分批运回，等全部到齐要到6月下旬了，那也没有办法，我们只能等。在此期间，那就先继续做基因表达实验吧。
这部分的预实验是已经做过多次的，但这一次是第一次用12孔板做，以前都是比较大的皿。但是换成小板之后做，发现数据跳点就很多（可以理解为波动很大）。
我在实验室观察了好几天，最后觉得可能是细胞生长不均匀造成的。但我明明接种细胞时，把它摇得很均匀呀，为什么第二天再看，就发现有的地方长得堆起来，有的地方很稀疏呢？这在以前养其它细胞上从来没有出现过。
图8 镜下可见细胞分布由均匀变得不均匀，而且无法控制
我经过多天、多时段的观察，反复接种尝试，最终发现是因为不均匀受热后对流引起的。于是开始设计和定制新的装置，最终成功地解决了这个问题，细胞生长变得非常均匀，再去测QPCR数据，就很稳定了。
这也是一个额外收获，因此后续的QPCR实验就进行得很顺利。
同济大学的博士答辩季一年有四次，所以我想如果等6月底ELISA试剂盒到，花两个月做完实验，到秋季提交论文，应该是可以赶上2023年第四季度毕业的。
结果，6月12日，我收到科教科老师的通知，说学校排查了延期毕业的学生，我已经是最后一年了，今年必须在6月中旬送论文盲审，8月15日前答辩，否则就只能结业。
图9 2023年6月12日，来自科教科老师的最后通牒
可是我的ELISA数据还没有出来啊，疫情对进度造成了影响，还遭遇了假试剂，是不是可以申请再延毕半年呢？
得到的回答是否定的，学校不知何故，突然不允许超过最长修读年限的学生再继续申请延期了，只说如果赶不上，可先领取结业证，结业后两年内，论文通过盲审和答辩，可以凭结业证再去换毕业证——这，我是无法接受的。
那么，我又该怎么办呢？（未完待续，明日继续推送，敬请期待！）
☑ 节点回顾
1. 2017年秋考入同济读博，一直恶补各项课程，一直到2018年夏天才完成了学校课程，7月份才到课题组实验室开展工作；
2. 2018年我的博士确定选题，在正式研究开始之前，我需要解决数个基础问题，每一个问题都需要大量精力，特别是需要分离培养用于实验的两种关键细胞；
3. 2018年11月我们首次实现了连续传代培养人的皮脂腺细胞和外毛根鞘细胞，2019年2月14日完成了细胞鉴定，之后开始钻研永生化技术，一直到2020年才成功;
4. 因为课题组不允许我带微生物进学校实验室处理，2020年7月，我联系养鱼大学的师妹，成立基础联合实验室；
5. 2020年下半年到2021年2月，辗转数10个城市，我终于完成了痤疮患者皮损毛囊内的样本以及完美皮肤样本取样，正式开始实验；
6. 2021年9月，在经过无数次失败实验后，脂质组和微生物组的数据终于出来了，而这些数据最终在2023年3月才全部分析完；
7. 2022年4月，上海经历了长达两个多月疫情封控，后来为了冰宝的身心健康，我短暂搁置了实验，陪她四处旅行看世界；
8. 2022年下半年到2023年3月，我一直在做ELISA和QPCR实验，结果却被告知无良商家的ELISA试剂盒竟然是作假的，这大半年的心血全都白废；
9. 我不得已重新采购了进口的国外知名公司的ELISA试剂盒，大约要到2023年6月底才能到齐，谁曾想我在6月12日就收到了学校的最后通牒。
作者简介：
理性护肤运动发起人，同济大学皮肤学博士，英语高级口译译员，创办中国第一个私人非盈利性皮肤学实验室，专注于美容皮肤学、皮肤和化妆品的关系研究。
著作：《素颜女神：听肌肤的话》、《享瘦之门》、《听肌肤的话2：问题肌肤护理全书》；
译作：《药妆品》(Cosmeceuticals)第3版、《防晒与光防护临床指南》、《美国皮肤学会痤疮治疗和护理指南(2016版)》、《黑素与黑素小体》、《瘙痒》中文第2版；
第一作者和通讯作者论文发表于Experimental Dermatology、Journal of Cosmetic and Laser Therapy、Dermatology、Skin Research & Technology、Photodiagnosis and Photodynamic Therapy、Biomedical Signal Processing and Control、《临床皮肤科杂志》、《中国皮肤性病学杂志》、《中国美容医学》、《中华皮肤科杂志》等。
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