读博记 第2篇
上期回顾：
上篇讲到，我硕士没有做过细胞方面的研究，而接下去的研究必须要使用这些技术，所以读博之后，我比其他同学多上了半年的课，以学习细胞和分子生物学、免疫学、色谱分析、生物信息学等诸多后面研究中需要用到的技术。
这意味着在课题进度上我就已经晚了半年。
这一年的课非常辛苦。学校是早上8点上课，因为交通非常拥堵，我初期是开车往返，但每天在路上浪费两个多小时实在太吃不消，于是后来改成了公交。
但这个公交线路非常绕，间隔15分钟才一趟，我必须赶上清早5点50分那班车，否则的话就会迟到，所以我必须在5点20分左右起床。
在公交车上干啥呢？审稿。
这就是2018年出版的《药妆品》中文第三版（参见旧文《记<药妆品>中文第3版出版》：https://weibo.com/ttarticle/p/show?id=2309404237071849015127）。
课程很密集，王老师见我迟迟未进医院实验室，学制又是三年，所以就开始担心我能不能毕业，可算是操碎了心🤣
当时，我做完一些微生物的预实验后，需要完成的第一个任务就是分离培养人的皮脂腺细胞和外毛根鞘细胞，这是痤疮发生过程中的两种关键细胞。
上篇已经提及：没有这两种细胞，就无法确定微生物与痤疮病理过程的因果性。
这项工作从2018年6月开始准备，经历了近30次失败，终于在2018年11月首次实现了连续传代培养，2019年2月14日完成了细胞鉴定（相关过程我在2019年2月18作过介绍，只是那时候刚刚分离成功细胞，还没有发表，所以当时没有透露细胞的具体名称，而是用字母O和S代指。关于这部分工作的详情参见旧文：六个月的磨难换一个开心情人节值不值？）。
虽然我分离的细胞生长得很好，但作为原代细胞，传代生长一段时间后就会走向衰亡，因此导师王秀丽教授希望我把这个原代皮脂腺细胞做成永生化的细胞系，这样就可以获得遗传背景、性状一致的细胞，并且永远不会衰亡。
于是我又开始钻研永生化技术，最后选定hTERT路线进行永生化，带着我的一位小师妹一起，忙到2019年10月，前后花了9个月的时间，反复试验了不知多少次，都没有成功。
后来经测序发现，是我委托包装慢病毒的公司忽悠了我：我们需要的基因根本没有被包装进去。
但是我们医院的实验室又没有病毒操作条件，一时，陷入僵局。
幸运的是师妹在学校上课期间得知徐国彤教授实验室在这方面非常专业，王老师遂联系到同济大学医学院的徐国彤教授，在他实验室欧庆健博士的帮助下，重新进行了质粒包装，我的小师妹刘佳就被派去徐教授实验室完成后续的工作了（后续工作也非常繁杂，因为要对细胞进行不间断地传代培养，一直要培养到超过50代才能被视为永生化，一般3-4天传一代，光这项工作就要半年多，然后才能进入后续的鉴定）。
2020年，皮脂腺细胞的永生化终于成功了。该细胞系成为全世界第一个用hTERT做成的永生化皮脂腺细胞系，而且是来自中国人的hTERT永生化细胞系。
该细胞的发明专利于2023年得到授权，2024年6月，论文最终得以发表（参见旧文：6年了，这件事终于可以和大家说了！），此时距我开始进行原代细胞分离培养时已达6年。
实际上，假如我的课题定为《痤疮患者粉刺皮损毛囊内微生物组和脂质组的研究》，我把微生物组和脂质组工作做完，也应该可以博士毕业了；
又假如，我的课题定为《hTERT永生化人类皮脂腺细胞系的构建》，那么2020年再做一些工作，也可以按期博士毕业了。
但这些只是我课题中的一部分基础工作，相对于我的研究目标来说，是远远不够的。
所以在小师妹在进入到徐国彤教授实验室继续永生化工作后，我就开始了上篇讲的1-3项工作（微生物组取样方法验证、取样和样本处理等），并且为进一步的细胞实验作准备。
天雷轰顶：我竟没地方做实验了！
按正常计划，当知道了哪些微生物与痤疮相关，且已经从痤疮皮损中分离、培养、鉴定了这些微生物，那么我就可以展开实验了，而且这些实验看起来并不困难：
把定量好的微生物配成菌液，加入到正在生长的细胞里，隔一段时间再收集细胞进行基因或者蛋白层面的分析。
基因的表达我们用实时荧光定量技术（RT-PCR）完成，蛋白层面的分析用酶联免疫吸附法（ELISA）来做，这些都是看起来常规的方法。
前面因为上课和细胞分离、永生多花了一年，现在看起来我2020年把实验做完，延期一年，2021年总可以毕业的吧！
No big deal, right？
事实上，是我太天真了。
首先在2020年准备开始进行预实验时，我就遇到了第一个障碍：我们课题组和医院中心实验室细胞室不允许我带微生物进去处理（之前的微生物实验都是在我自己实验室里完成的），因为是共用实验室，很多人都在一起养细胞，万一这些微生物把别人的细胞给污染了，那……不能毕业的可就不是我一个人了！
虽然我仔细考虑，认为我处理的微生物都是安全的，不会通过空气传播，会灭活，不会污染到别人的细胞，但出于安全起见，我的申请还是未能被允许。
这个消息犹如五雷轰顶，我一瞬间就懵了：这可怎么办呢？一时间浑身冒汗，脑中急速开始运转，思考对策。
我前后想了七八个备选方案，也有朋友愿意借实验室给我用，或者我单独买一台细胞培养箱放到别人的实验室，但一番考察和讨论下来，感觉我来来去去不方便，人家也不方便，所以只剩下最后一条路：
自己建个细胞实验室。
天无绝人之路，我2020年7月份得知养鱼大学的两个师妹创业做CRO，其中一位师妹以前就在一家CRO实验室做实验，她们俩主要承接一些肿瘤方面的基础研究课题。
经深入交流和探讨后，我们达成一致，成立一个基础联合实验室，我可以再投入一些资金和资源把皮肤这部分健全起来，这样除了肿瘤方向之外，还可以做许多皮肤领域的基础研究，这样我自己的课题也就有地方做了，没准未来还可以承接别人的研究项目呢。
随后，经过了相当长时间的磨合，又添置若干仪器设备，皮肤这块的基础研究工作终于慢慢上了轨道。从细胞培养到QPCR、ELISA、Western、CoIP，到IF、IHC、光细胞生物学装置等等，都全乎了。
图1 冰寒护肤基础联合实验室一角
既然有了实验室，那就开始做实验吧！
没想到，更困难的事在前面等着我……（未完待续，明日继续推送）
☑ 节点回顾
1. 2017年秋考入同济读博，恶补各项课程，直到2018年夏天才完成了学校课程，7月份才到课题组实验室开展工作；
2. 2018年我的博士确定选题，在正式研究开始之前，我需要解决数个基础问题，每一个问题都需要大量精力，特别是需要分离培养用于实验的两种关键细胞；
3. 2018年11月我们首次实现了连续传代培养人的皮脂腺细胞和外毛根鞘细胞，2019年2月14日完成了细胞鉴定，之后开始钻研永生化技术，一直到2020年才成功;
4. 在2020年准备开始进行预实验时，我们课题组出于对其他同学实验进程的保护，不允许我带微生物进去处理，我陷入了两难境地；
5. 2020年7月份我得知养鱼大学的两个师妹创业做CRO，与她们主动交流，经过长时间的磨合，我的个人基础联合实验室终于创立。
作者简介：
理性护肤运动发起人，同济大学皮肤学博士，英语高级口译译员，创办中国第一个私人非盈利性皮肤学实验室，专注于美容皮肤学、皮肤和化妆品的关系研究。
著作：《素颜女神：听肌肤的话》、《享瘦之门》、《听肌肤的话2：问题肌肤护理全书》；
译作：《药妆品》(Cosmeceuticals)第3版、《防晒与光防护临床指南》、《美国皮肤学会痤疮治疗和护理指南(2016版)》、《黑素与黑素小体》、《瘙痒》中文第2版；
第一作者和通讯作者论文发表于Experimental Dermatology、Journal of Cosmetic and Laser Therapy、Dermatology、Skin Research & Technology、Photodiagnosis and Photodynamic Therapy、Biomedical Signal Processing and Control、《临床皮肤科杂志》、《中国皮肤性病学杂志》、《中国美容医学》、《中华皮肤科杂志》等。
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