不同试剂检测抗凝蛋白性能验证

健康   2024-12-31 15:01   山东  


作者:卢琴  谭惠霞  代冰  苏洁琼  唐春燕  杨琦  易玉姣
单位:长沙金域医学检验实验室有限公司
 

在医学检验领域,抗凝蛋白检测扮演着举足轻重的角色。它不仅是许多疾病诊断的重要依据,也是治疗过程中不可或缺的监测手段。本文将探讨一款国产试剂——A品牌试剂在抗凝蛋白检测中的表现,以及它与进口B品牌试剂的差异。

为了解答这个问题,我们研究人员进行了一系列严谨的验证。采用国家卫健委临检中心提供的样本,通过进口B品牌试剂来确保仪器的准确性,使用BE凝血仪进行51份样本蛋白C、蛋白S和抗凝血酶III的检测,比较了国产A品牌试剂和进口B品牌试剂的结果。

结果显示,国产A品牌试剂在BE凝血仪上的检测结果均通过验证,但普遍高于靶值。与进口B品牌试剂比较,蛋白C的阴阳性符合率为100%,偏倚通过率为92%;抗凝血酶III的阴阳性符合率为94%,偏倚通过率为92%;蛋白S的阴阳性符合率为84%,偏倚通过率为80%。除了蛋白S结果在BE凝血仪上较进口B品牌仪器偏低,其余项目均通过验证。
 
国产A品牌试剂在抗凝蛋白检测中表现出较高的准确性和一致性,尤其在蛋白C和抗凝血酶III的检测中表现优异,在蛋白S的检测中结果偏低。

  


抗凝蛋白是一组在维持血液凝固和纤溶系统平衡中起关键作用的蛋白质,主要包括蛋白C、蛋白S和抗凝血酶III(Antithrombin III, AT-III)。这些抗凝蛋白在正常情况下通过维生素K依赖的途径合成[1,2],参与凝血途径的抑制和纤溶系统的激活,从而确保血液在体内保持适当的流动性,防止异常的血栓形成。

蛋白C是一种由肝脏合成的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶原,它在血液凝固过程中发挥抑制作用。蛋白C系统由血栓调节蛋白(Thrombomodulin, TM)、蛋白S、内皮细胞蛋白C受体(Endothelial Protein C Receptor, EPCR)和活化蛋白C抑制物(Activated Protein C Inhibitor, APCI)组成。蛋白C以无活性形式存在,通过与血管内皮表面的TM结合,由凝血酶(Thrombin)激活,形成活化蛋白C(Activated Protei, APC)。

APC主要通过灭活凝血因子Va和VIIIa来发挥抗凝作用[3]。这两个因子是凝血酶生成的共同因子,其灭活可有效减少凝血酶的生成。APC还具有抗炎和细胞保护作用[4],可以减少组织损伤和炎症反应。蛋白S通常以辅因子的形式与活化蛋白C结合,稳定APC,并提高其对凝血因子Va和VIIIa的灭活效率,从而抑制凝血级联反应,防止血栓形成,此外,蛋白S也可以直接结合到凝血因子上,具有一些独立的抗凝活性,但主要是通过与APC的协同作用实现抗凝。

蛋白S也是一种维生素K依赖性蛋白,作为蛋白C的辅因子发挥功能[5],与活化蛋白C协同作用,增强APC对凝血因子Va和VIIIa的降解能力。蛋白S的缺乏或功能异常会导致蛋白C系统的抗凝活性减弱,增加血栓形成的风险。

蛋白C、蛋白S、血栓调节蛋白相互作用灭活凝血因子机制

抗凝血酶III(AT-III)是一种主要由肝脏合成的肝素依赖性丝氨酸蛋白酶抑制剂。AT-III能够抑制多种凝血因子,包括凝血酶(Thrombin)、凝血因子Xa、IXa、XIa和XIIa。AT-III与肝素结合后,其抗凝活性大大增强,从而有效地防止血栓形成。

AT-III缺乏症是导致静脉血栓形成的常见遗传性原因之一,表现为患者易于形成血栓且血栓再发率高。因此,对于存在血栓前状态或易栓症风险的患者,监测这些抗凝蛋白的活性是非常重要的,以便及时采取预防措施。

本研究旨在评估国产A品牌试剂检测抗凝蛋白性能的有效性,并与进口B品牌试剂进行对比,明确国产A品牌试剂是否能够满足临床对血栓患者的检测需求。通过比较不同试剂在检测蛋白C、蛋白S和抗凝血酶III方面的表现,我们希望找出更为准确/可靠的检测方法,以便更好地指导临床实践,预防和管理血栓相关疾病。



材料与方法


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材料


Thrombolyer XRS全自动凝血分析仪:抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒(发色底物法),MRX Protein C试剂盒,Protein S试剂盒以及校准品、质控品均由湖南赛新生物科技有限公司提供。

STARMAX全自动凝血分析仪:抗凝血酶III测定试剂盒(发色底物法),蛋白C活性测定试剂盒(发色底物法),蛋白S活性测定试剂盒(凝固法)以及校准品、质控品均由进口B品牌诊断技术有限公司提供。


质量控制


实验前对仪器进行常规维护与保养, 并对抗凝血酶III、蛋白S、蛋白C项目进行质控检测。



统计方法


我们通过Graphpad Prism软件进行t检验以及相关性分析,验证两种仪器之间的数据是否具有显著差异以及两种仪器数据是否具有线性相关性。

通过R语言进行数据的回归分析,我们分别进行了简单线性回归以及多项线性回归,每组数据得到两种回归方程,有机会在后续实验中验证数据的可靠性。


结果


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精密度验证


精密度的验证结果见下表。通过4次重复检查,判断批内与批间方差与变异系数,检查执行两次水平实验。其中抗凝血酶III两次水平实验的批内方差为0.045与0.275,批内标准差为0.211与0.524,批间标准差为0.247与0.299,批间方差为0.061与0.089。蛋白C两次水平实验的批内方差为0.004与0.004,批内标准差为0.063与0.063,批间标准差为0.11与0.082,批间方差为0.012与0.007。蛋白S两次水平实验的批内方差为0.018与0.015,批内标准差为0.134与0.124,批间标准差为0.339与0.481,批间方差为0.115与0.232。

抗凝血酶III精密度验证实验结果

蛋白C精密度验证实验结果

蛋白S精密度验证实验

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差异及相关性分析


我们在Thrombolyer XRS全自动凝血分析仪与STARMAX全自动凝血分析仪上分别进行51个样本的蛋白C、蛋白S以及抗凝血酶III测试,分别进行配对t检验,三个指标同时具有显著性差异(<0.0001)。同时进行回归分析,三个指标都具有很强的正相关性(<0.0001),其中针对蛋白C的回归模型具有最好的解释能力。

通过Graphpad Prism进行t检验与回归分析以查看相关性。A:展示了蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III在不同仪器中的监测数据具有显著差异;B:展示三种检测指标在两种仪器上的数据呈显著正相关。

我们接下来展示回归方程,分别采用线性回归与二次多项式回归进行,我们观察到二者高度重合,其中蛋白C的线性回归系数为0.79,蛋白S的线性回归系数为1.02,抗凝血酶III的线性回归系数为0.61。其中蛋白S的偏倚似乎是最小的。综上结果,两台仪器针对不同指标表现出不同的偏倚方向。

通过R语言进行数据拟合并展示回归方程。A、B、C:通过简单线性回归与多项式回归,我们针对不同的指标构建出两种仪器的拟合方程。


一致性分析


我们通过绘制差值热图展现数据的偏倚方向,我们发现不同的指标会展现出不同的偏倚模式。也就是说,仪器带来的偏倚可能是实验指标特异性的,即我们可能需要针对不同的指标产生不同的校正模式。虽然在本次实验中两台实验仪器均达到了国家标准,但其中固定的偏倚模式提示我们仪器的高稳定性以及可能存在校正空间。

通过Bland-Altman图片展示数据的一致性,上下虚线代表95%的一致性限度,我们观察到每一组数据都存在系统偏差,三组数据大多数结果都能够在一致性限度以内。

通过Graphpad Prism进行数据的可视化,使用热图与Bland-Altman展示数据之间的一致性。A:通过热图观察,我们发现即便是同一种仪器在面对不同的指标时也展示出了不同的偏倚方向,即面对不同指标可能会出现不同的偏倚模式;B:通过Bland-Altman图形展示了数据的一致性,我们发现大多数数据都能够在一致性界限以内。


讨论



蛋白C抗凝途径是控制血栓形成、限制炎症反应并可能减少炎症细胞因子和缺血引起的内皮细胞凋亡的主要系统[3],主要组成部分包括凝血酶、血栓调节蛋白、内皮细胞蛋白C受体。蛋白C和蛋白S血栓调节蛋白与凝血酶结合,直接抑制其凝血和细胞活化潜力,同时增强蛋白C的激活。蛋白质C缺乏会导致微血管血栓形成(暴发性紫癜)[6]


在严重脓毒症期间[7],蛋白C消耗、蛋白S失活以及氧化导致的活化复合物活性降低、细胞因子介导的下调以及活化成分的蛋白水解释放等因素共同作用,形成了有利于获得性缺陷的运动条件。


本次实验,我们通过对比不同凝血仪对蛋白C、蛋白S和抗凝血酶III的检测性能,尤其突出蛋白S的高度一致性,同时发现针对不同试验指标存在稳定的系统误差。在实验研究中,检测蛋白C、蛋白S和抗凝血酶III的活性对于评估凝血功能具有重要意义。不同的凝血分析仪器可能在检测结果上表现出系统性误差,因此在进行检测时需要对结果进行比较和校正。特别是对于蛋白S的检测,其一致性在不同的分析系统中表现良好。然而,针对不同的检测指标,稳定的系统误差仍然存在,提示在临床实践中应根据具体的检测方法进行标准化处理。


蛋白C和蛋白S在凝血和炎症调节中发挥着不可或缺的作用:其抗凝功能通过精细调控凝血因子的活性,防止过度凝血和血栓形成;而其抗炎和细胞保护特性则在感染和缺血性损伤中维护组织功能的完整性。随着研究的深入,对蛋白C和蛋白S功能的更深入理解将为医学领域提供更广泛的应用前景。


【参考文献】

[1] Ageno W, Gallus AS, Wittkowsky A, Crowther M, Hylek EM, Palareti G. Oral anticoagulant therapy: Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. Chest. 2012;141(2 Suppl):e44S-e88S.

[2] Jerrold H. Levy MD, F.A.H.A., F.C.C.M., James Douketis, M.D., Thorsten Steiner, M.D., Joshua N. Goldstein, M.D., Ph.D., Truman J. Milling, M.D. Prothrombin Complex Concentrates for Perioperative Vitamin K Antagonist and Non–vitamin K Anticoagulant Reversal. Anesthesiology. 2018;129(6):13.

[3] Charles T. Esmon P. The Protein C Pathway. Chest. 2003;124(3):6.

[4] Seol JW, Lee YJ, Jackson CJ, Sambrook PN, Park SY. Activated protein C inhibits bisphosphonate-induced endothelial cell death via the endothelial protein C receptor and nuclear factor-kappaB pathways. Int J Mol Med. 2011;27(6):835-40.

[5] Suleiman L, Negrier C, Boukerche H. Protein S: A multifunctional anticoagulant vitamin K-dependent protein at the crossroads of coagulation, inflammation, angiogenesis, and cancer. Crit Rev Oncol Hematol. 2013;88(3):637-54.

[5] M Dreyfus JFM, F Bridey, H P Schwarz, C Planché, M Dehan, G Tchernia. Treatment of homozygous protein C deficiency and neonatal purpura fulminans with a purified protein C concentrate. N Engl J Med. 1991;325(22).

[7] Eliwan H, Omer M, McKenna E, Kelly LA, Nolan B, Regan I, et al. Protein C Pathway in Paediatric and Neonatal Sepsis. Front Pediatr. 2021;9:562495.

 

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编辑:yeah  审校:小冉

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