作者：刘俊龙
单位：湖南省中西医结合医院
体内的胆红素主要来源于红细胞中血红蛋白的分解代谢。血红蛋白在酶的作用下被分解成珠蛋白和血红素，随后血红素在微粒体血红素氧化酶的作用下转变为胆绿素，胆绿素再经过还原酶的作用进一步转化为胆红素。总胆红素是由间接胆红素（IBIL）和直接胆红素（DBIL）两部分组成的，其中直接胆红素是由间接胆红素进入肝脏后，在肝内葡萄糖醛酸基转移酶的作用下与葡萄糖醛酸结合生成的。在临床上，胆红素指标是评估肝脏和胆道功能的重要参考依据。
某患者，男性，56岁，临床诊断：急性肝功能衰竭。2024年11月19进行肝功能检查，结果发现，直接胆红素高于总胆红素，间接胆红素为负数，违反了审核规则。怀疑信息传输问题，笔者查看原始结果，证实的确为仪器做出的真实结果：总胆红素110.85μmol/L，直接胆红素119.12μmol/L。经过检查，仪器无报警，两个项目的反应曲线正常。当天的质控都在控，当日其他标本结果未出现此类情况。为排除偶然误差，随即进行标本复测，但结果同前。
本实验室有两台生化仪，于是又在仪器二上复查了该标本。奇怪的是仪器二复查的结果显示：总胆红素120.00μmol/L，直接胆红素96.50μmol/L。
本案例中是什么原因导致两台仪器检查结果差别这么大？存在干扰？抑或是检测系统或方法学等原因导致的检验误差？接下来我们进行了以下探究。
1、病史资料
患者以“全身皮肤及巩膜黄染6月余，言语不清2天”为主诉，入院查总胆红素653.48μmol/L，直接胆红素503.42μmol/L，间接胆红素150.06μmol/L，谷丙转氨酶166.3U/L，谷草转氨酶501.6U/L，肌酐559.40μmol/L。以“肝功能衰竭”收入ICU。由此可见，患者肝功能严重受损，胆红素严重异常，入院后予以抗感染、抗氧化、护肝、补充蛋白等治疗，且配合行人工肝及血液净化治疗后，胆红素也逐日下降。结合患者用药记录，未发现药物干扰的明确证据。
2、直接胆红素和总胆红素的方法学
两台全自动生化分析仪的总胆红素和直接胆红素试剂均采用钒酸盐氧化法。原理如下：在PH3.0附近标本与钒酸相互作用，直接胆红素被氧化成胆绿素从而导致吸光度变化。
而直接胆红素和总胆红素差别在于后者需要加入表面活性剂来促进胆红素反应，因此推测表面活性剂可能对实验产生了干扰。此外钒酸盐法极易对仪器造成污染，影响结果的准确性；且众多复杂成分对氧化反应也有不同程度干扰。对比试剂说明书，仪器一试剂说明书标注可能受以下因素干扰：溶血(>5g/L)、乳糜血(>2%)、抗坏血酸(>50mg/dL)和抗凝剂过量使用。注意到该标本使用肝素锂管采集，改用无抗凝剂的红管标本在仪器一上进行检测，检测发现结果直接胆红素依旧大于总胆红素，因此排除了抗凝剂的干扰。
3、大分子蛋白的干扰
有文献报道[1,2]，多发性骨髓瘤患者血清中大量的单克隆免疫球蛋白可错误地增加DBIL的测量，而不影响TBIL的检测。稀释后干扰物质浓度降低，DBIL的假性升高数值也会大大降低。此外用聚乙二醇沉降后可排除此类干扰，于是采用聚乙二醇沉降后复测，同时采用增量、减量、稀释5倍、稀释10倍模式进行检测，如下图：
结果显示，直接胆红素仍大于总胆红素，且患者总蛋白、白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白均正常，故排除大分子蛋白的干扰。
4、检测系统
通过分析两台生化仪的结果，笔者考虑问题可能在检测系统上面，据报道[3]，在美国临床病理学会（CAP）的全球室间质量调查中，历年来，胆红素结果是最差的。只有强调在同检测系统的比较下，完全相同的检测系统内的CV可能较小。于是将该标本送至具有相同仪器和试剂的实验室进行比较，最后发现总胆红素120.93μmol/L，直接胆红素110.25μmol/L，总胆红素大于直接胆红素，这一结果与我们仪器二是接近的。那么问题肯定出在仪器一上面。
回顾LIS系统查询前几天的胆红素检查结果，发现18号也出现类似情况，回溯仪器一的校准记录，发现仪器一在17号的时候对部分项目使用新的校准品，重新进行了校准，其中就有总胆红素。下图是总胆红素定标前后的结果，发现总胆红素k值下降了7058，这就是导致直接胆红素大于总胆红素的症结所在。为什么其他标本没有出现此情况呢？笔者考虑本院患者标本高值标本少，且低值标本差异不明显，而高值标本受定标误差的影响更为明显。更换定标品并重新定标后，最后结果总胆红素大于直接胆红素，与仪器二和比对实验室的结果相吻合。
综合分析，本例直接胆红素大于总胆红素的异常现象主要是由仪器一的校准问题导致的。通过排查病史资料、大分子蛋白干扰、抗凝剂影响、方法学差异和偶然误差等情况所导致的因素，最终确认校准品存在问题。诚然，胆红素校准品的使用很有争议[3,4]，其一胆红素本身不稳定，不易保存，特别是直接胆红素制备困难；其二由于国内目前没有统一的标准品供应，造成胆红素标准品的标准化问题得不到解决。
目前市场上销售的胆红素标准品多为各种胆红素的混合物（或异构体），不适于作为直接胆红素测定的标准物。临床实验室检验流程包含检验前、中、后三个环节，涉及人、机、料、法、环等要素，每个环节的规范操作是检验结果质量保证的必要条件。同时，定标、质控、异常结果排查等又是日常工作中要面对的问题，只有确保保证有效的质量管理，才能让检验系统的检验结果在规定的报告范围内保持稳定。
【参考文献】
1.Song L, Kelly KA, Butch AW. Monoclonal and polyclonal immunoglobulin interference in a conjugated bilirubin assay. Arch Pathol Lab Med 2014;138:9504.
2.PantanowitzL, HorowitzGL, UpalakalinJN, BeckwithBA. Artifactual hyperbilirubinemia due to paraprotein interference. Arch Pathol Lab Med 2003;127:559.
3.J A Lott, B T Doumas, "Direct" andbilirubin tests: contemporary problems, Clinical Chemistry,Volume39,Issue4,1April1993,Pages641–647, https://doi.org/10.1093/clinchem/39.4.641.
4.邵燕，胡滨，孙慧颖，等. 血清总胆红素常规系统量值传递路径的比较［J］. 临床检验杂志，2016，34（12）：947-950.
