应对M蛋白干扰，有新招！

点评专家：谭延国

单位：首都医科大学附属复兴医院

单克隆免疫球蛋白又称为M蛋白或副蛋白，是浆细胞单克隆产生的无功能免疫球蛋白或其轻链或重链片段，多见于多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)、巨球蛋白血症(macroglobulinemia，WM)和意义不明的单克隆丙种球蛋白血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)^[1-2]。其可能通过浊度变化、与试剂组分反应、超高粘度和巨酶等机制对多个生化项目的检测产生干扰^[3]。尤其以肌酐在文献报道中最为多见。

经验较为丰富的检验人员通过分析反应曲线、肾功能联检项目或者免疫球蛋白定量结果可以在报告审核中识别M蛋白对肌酐产生的干扰，然后通过稀释重测来解决。

除此之外，我们近期接触到一种新的方法，仪器基于M蛋白干扰肌酐的特征，自动识别受干扰的结果，结合系统算法，对干扰过程进行适当校正，提供研究结果供参考，大大提高了干扰识别和解决效率。下面我们通过一个案例去了解一下具体情况。

前段时间，我们在审核报告过程中发现一例血清样本检测肌酐结果为693μmol/L（图1），该结果显著升高（参考区间：57-111μmol/L）。查看UREA结果为8.73mmol/L（参考区间：3.6-9.5mmol/L） ，在正常范围内。两者的变化不同步且肌酐升高显著，这一结果引起了我们的怀疑。于是我们针对肌酐结果展开了分析。

图1a 该样本原始测定结果

首先分析反应曲线，我们找了一个肌酐浓度相近（681.6μmol/L）的以往发过报告的正常反应曲线（图2a），再查看本案例的原始反应曲线（图2b），发现在浓度差不多的情况下，该案例的反应度（纵坐标）数值明显大于正常曲线的反应度，主波长和次波长都存在异常抬高的现象。推测该样本可能存在干扰肌酐的因素。

图2a 历史样本(681.6μmol/L)反应曲线     

图2b 该案例(693μmol/L)原始反应曲线

接着，查阅患者的病历信息得知，这是一个转诊病人。患者于3周前无明显诱因出现乏力，于当地查血示血红蛋白明显降低，后进一步住院查。

HGB 58g/L；血IgM 31.43g/L；SIFE:IgM-λ型M蛋白。骨髓流式：23.02%的单克隆B淋巴细胞，表型为CD34-CD19+CD20+CD5-CD10部分+FMC7少量+CD22+CD79b+Ki67-，胞膜入轻链限制性表达。基因：MYD88L265P、CXCR4K331*阳性。FISH：未见t(14;18)。活检：造血面积95%；MF-2级。IHC:CD3散在少+，CD20散在+，E-cad多丛+，CD138少+，CD30-，CD10少+，MUM-1-，Ki6750%+。意见：B细胞略易见(约占30%)，浆细胞散在少数(约占3%)，符合B细胞淋巴瘤伴纤维化。当地诊为巨球蛋白血症，给予输血等对症治疗。现患者为求进一步诊治来我院就诊。

从患者的病历信息可以知道，这是一个淋巴浆细胞淋巴瘤的病人，血清中单克隆免疫球蛋白为IgM-λ型，且浓度高达31.43g/L。M蛋白对生化项目的干扰并不少见，尤其是对肌酐。在排除校准、质控、检测系统和样本外观等因素后，我们初步认为M蛋白正是隐藏在该案例中的干扰因素。

我们随即用生理盐水对样本进行10倍手工稀释，得到的结果为108μmol/L，反应曲线（图3）显示反应度的数值回归正常，但反应前阶段的反应曲线出现新的异常表现：加入样本后，反应度瞬间抬升，后逐渐下降。且反应阶段的最终曲线（主波长-次波长，橙色线）几乎与反应前阶段成一条直线，得到的结果不应该接近于0吗？让我们对这个稀释后结果的准确性还是产生了怀疑。

图3 生理盐水稀释后反应曲线

于是，我们把该案例反馈给仪器厂家（型号：BS-2800M，厂家：深圳迈瑞）。厂家技术人员分析认为反应前阶段，反应度瞬间抬升，后逐渐下降的原因是样本中存在M蛋白，手工加入生理盐水后，溶液离子强度发生改变，M蛋白发生沉淀，此时样本应该是浑浊的，但可能上机前忘记离心了（后续确认证实），所以反应度瞬间抬升。但由于有R1存在，样本加入后被稀释了，因此反应度逐渐下降。而反应阶段的曲线与反应前阶段几乎持平的问题，实际上是因为该样本被手工稀释了10倍，肌酐浓度本身就很低，只有10.8μmol/L左右（108μmol/L除以稀释倍数）。

另外，终点法的计算公式中有个体积因子，仪器计算结果时并非直接用31-33测光点的反应度减去14-1测光点的反应度的 ，因为这中间加了R2，反应体系的溶液体积变大了，就算吸光度没有变化，也会因为稀释的原因，吸光度降低，所以我们会用31-33 的吸光度减去 14-16 的吸光度后再乘以体积因子： （R1+S）/（R1+S+R2），才是最终的结果。

因此该曲线表现是正常的，得到一个合理的低浓度结果（10.8μmol/L）。

此外，厂家技术支持人员向我们介绍了一种解决M蛋白干扰肌酐的新方法。名为“全景动态测光技术（PDR）”。其原理为：测试过程中，仪器对反应体系进行全波长（340~850nm）扫描，收集反应体系的全貌数据，基于大数据学习的副蛋白干扰酶法肌酐的反应曲线波动特征，启用系统算法扣除干扰引起的异常曲线波动，最终输出修正后的结果,该过程由仪器自动完成，无需人工处理。具体特点如下：

传统的双波长特定时间点测光技术出现次波长异常抬升时，无法马上锁定M蛋白干扰，因为在脂血、凝块等干扰情况下，也会出现。而PDR技术提供的全波长全周期监控，可以针对M蛋白干扰的特征性波长变化进行识别，并报警提示用户。

通过特定的集成算法，对干扰物所造成异常曲线波动进行空白扣除，得到一个相对准确的研究结果，给用户做参考。但由于该技术仍需要大量验证，因此仪器会保留旧参数的原始结果，新参数的研究结果仅供参考。

在技术人员的指导下，我们升级了这一参数。为了验证研究结果的准确性，我们对患者多日监测的样本同步启用了该新参数，得到的M蛋白浓度、肌酐原始结果和PDR研究结果随监测日期的变化见图4。发现随着治疗的进行，M蛋白浓度逐渐降低，肌酐原始结果也逐渐降低，说明受干扰程度逐渐减轻，而PDR研究结果一直维持在正常水平，说明未受M蛋白干扰或者干扰已得到纠正。

图4 患者多日监测结果

1、如何有效识别M蛋白干扰的存在？

存在M蛋白干扰时，样本外观通常是正常的，肉眼不易察觉出干扰物的存在。通过查看肌酐反应曲线（次波长异常抬升）、联检项目之间的逻辑关系（UREA、CYSC等项目的结果是否升高）、患者的病史资料（有无浆细胞病相关病史）和其他相关的检查结果（球蛋白、血清免疫球蛋白定量、电泳分型等）可以识别。

2、肌酐是双波长试剂，为什么不能消除M蛋白的干扰？

因为M蛋白对肌酐的干扰，在不同的反应阶段（图4a）和不同的波长（图4b）的干扰程度不同。图4a显示，反应前阶段受到的干扰小于反应阶段，即△1<△2。主波长受到的干扰大于次波长，即△3>△4。因此无法通过样本空白或双波长消除干扰。

图 4a干扰对不同反应阶段的影响

  

图 4b干扰对不同波长的影响

3、PDR技术是否值得尝试？

近年来，检验领域的研究热点主要在分子诊断、临床质谱、精准医疗等领域。鲜有看到在生化这么成熟的领域中有新的突破，其实生化中也存在很多“老大难”的问题亟待解决，比如重新抽血后仍然溶血的样本检测、错综复杂的药物干扰等，PDR技术的出现令人眼前一亮，自动识别干扰的同时，还能直接提供一个较为准确的结果供参考。大大提升了我们排查异常结果的效率。在经过大量验证，确保其准确性的前提下，值得我们去尝试。

【参考文献】

[1]Andrew J Cowan, Damian J Green, Mary Kwok ,et al.Diagnosis and management of multiple myeloma: a review[J]. JAMA,2022,327(5):464-477.

[2]Ola Landgren.Advances in MGUS diagnosis, risk strati‐fication, and management: introducing myeloma‐defining genomic events[J]. Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2021 Dec,2021(1):662-672.

[3]Richard I Kingr, Christopher M Florkowski .How paraproteins can affect laboratory assays: spurious results and biological effects[J].Pathology,2010,42(5):397-401.