造血祖细胞激酶 1 (HPK1、MAP4K1) 是 MAP4K 家族的成员，可作为丝氨酸/苏氨酸激酶发挥作用。HPK1 功能的缺失可抑制肿瘤生长，为癌症免疫治疗提供了一种有吸引力的策略。近日华东医药公开了临床前化合物DD205-291的开发（doi: 10.1021/acs.jmedchem.4c01906）。
背景
目前，已经开发了三种不同的策略来调节HPK1的功能：（1）使用CRISPR / Cas9基因编辑系统下调HPK1的CAR-T疗法（2）激酶抑制，利用小分子抑制剂抑制HPK1的激酶功能（3）使用PROTACs技术化学诱导蛋白质降解。目前有10多种HPK1抑制剂处于临床评估中。由百济神州开发的化合物BGB-15025目前处于I期临床试验（NCT04649385）。化合物DD203-1是一种有效的HPK1抑制剂，由Treadwell在专利（WO2016205942A1）中披露。PROTAC 诱导整个靶蛋白降解，消除 T 细胞受体 (TCR) 中 HPK1 的激酶依赖性和支架信号传导，从而具有卓越的疗效和选择性的潜力。SS44和B1是目前报道的HPK1 PROTAC。
PROTAC 的 HPK1 降解剂的设计
化合物DD203是一种有效的 HPK1 抑制剂，由内部库开发，其 HPK1 和 GLK IC50值分别为 2.67 nM 和 63.6 nM（WO2023131271A1）。DD203被对接到 HPK1 的活性位点，部分分别与残基 Glu92 和 Cys94 建立了两个氢键。此外， DD203的四氢吡喃部分从活性位点延伸到溶剂可及区域，使其成为 PROTAC 设计的理想连接点。选择吡咯侧取代作为连接 PROTAC 的出口载体，CRBN 配体为口服生物可利用 PROTAC提供了合适的“口服药物样”。
SAR
将弹头连接到CRBN上，合成了具有线性烷基的化合物A1，具有中等强度的HPK1降解能力， DC50值为55.0 nM， Dmax为86％。亚甲基连接的二哌嗪化合物（A2）表现出最强的降解活性， IC50为1.2 nM， Dmax为93％。哌嗪（A3）替换哌啶时，降解活性可以保持。增加连接环（A4）的尺寸时，降解活性显着下降。当将接头中的亚甲基替换为氧（A6、 A7、 A8）时，降解活性略有下降。通过在接头中引入额外的甲基或氟取代（A5、 A10和A11），观察到 HPK1 降解活性降低。
A2的R1中除去乙基，得到化合物B13。与 A2 相比，化合物B13降解 HPK1 的能力降低了 15 倍。引入甲基使化合物B2的降解活性提高至9.3 nM。在R1取代基处对较大功能基团的耐受性较低，当该位置被甲基或乙基取代时，降解活性最佳。氟取代 R1表现出良好的降解活性。
PK评价
A2、 B2、 DD205-291和B10的体内口服药代动力学如下。口服 10 mg/kg，降解剂DD205-291半衰期(T1/2)为 2.55 小时，血浆峰浓度（Cmax）为14700 ng / mL，面积曲线下面积（AUC）为 57823 ng/mL·h。给药时DD205-291静脉注射2 mg/kg 后， T1/2 2.34 h，AUC 为 55748 ng/mL·h，口服生物利用度为 20.7%。
ADME
DD205-291表现出低渗透性，表观渗透性(Papp)为 0.160 × 10－6 cm/s，无流出现象，流出比值为 0.70。血浆蛋白结合试验表明， DD205-291与不同物种的血浆蛋白的结合率较高，且物种间无明显差异。此外， DD205-291对 CYP酶没有可逆的抑制作用，表明候选化合物发生 CYP 抑制介导的药物相互作用的风险较低。此外，在肝微粒体和肝细胞稳定性测定中， DD205-291在微粒体和肝细胞中表现出良好的代谢稳定性，在五种物种（小鼠、大鼠、狗、猴子和人类）中具有中等至缓慢的内在清除率。
体外hERG
化合物DD205-291对hERG的抑制作用较小，具体表现为浓度为3μM时抑制率为4.36% 。更重要的是，化合物DD205-291不影响兔浦肯野纤维的动作电位，表明DD205-291具有较低的心脏毒性风险。
对比实验
DD205-291与抗 PD1 联用与BGB-15025 （百济神州的 HPK1 抑制剂）和DD203-1对比，实验结果表明， DD205-291在与抗 PD1 联合使用，剂量为 0.5 mg/kg，达到最好的治疗效果。此外BGB-15025单一疗法表现出较弱的活性，剂量为 1 mg/kg，与抗 PD1 联合使用时表现出显著的协同抗肿瘤活性，但并未优于DD205-291（76.3% vs 91.0%)。DD205-291 0.5 mg/kg 与抗 PD1 联合治疗的疗效显著优于DD203-1。整个研究过程中没有观察到明显的体重异常，这表明剂量是安全和可耐受的。
总结
该研究开发的化合物DD205-291的化学结构非常新颖，弹头和E3配体结构都有明显不同。化合物DD205-291对HPK1表现出选择性降解活性， DC50为8.8 nM， Dmax达到93.8％。进一步的体外活性评估表明化合物DD205-291抑制SLP76磷酸化，EC50为22.98 nM。此外，化合物DD205-291对免疫调节因子表现出显著的刺激活性， IL2 刺激的EC50值为 34.68 nM，IFNγ刺激的 EC50 值为 32.6 nM。此外，化合物DD205-291在体外和体内均表现出良好的 PKPD 特性，包括良好的代谢稳定性、口服暴露和生物利用度。安全性实验表明化合物DD205-291具有较低的心脏毒性风险，并具有广泛的治疗安全窗口。最重要的是，化合物DD205-291表现出了显著的体内抗肿瘤活性，有效口服剂量为0.4 mg/kg。在0.5 mg/kg剂量下，它显著增强了抗PD1疗法的抗肿瘤反应，表现出明显的协同抗肿瘤活性，肿瘤生长抑制率（TGI）为91.0%。目前，该系列代表化合物已完成所有临床前研究，并正在申请新药临床试验申请。
参考文献doi: 10.1021/acs.jmedchem.4c01906
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