勃林格殷格翰科学家和英国邓迪大学Alessio Ciulli教授合作开发了一种双功能靶向嵌合体（PROTAC）降解剂ACBI3，通过靶向KRAS蛋白的非共价配体和E3连接酶von Hippel-Lindau（VHL）来降解致癌KRAS突变。该药物可选择性降解17种常见KRAS突变体中的13种，比抑制更有效，并在实验模型中诱导肿瘤消退。这项研究为开发利用ProTAC诱导靶向蛋白质降解（TPD）的新型抗癌药物提供了重要里程碑，未来研究和临床试验有望验证其治疗潜力。
01
背景
KRAS是人类癌症中最常见的突变致癌基因，突变通常发生在甘氨酸位置12或谷氨酰胺位置61，导致活性GTP负载的KRAS增加，增强了RAF-MEK-ERK(MAPK)信号通路，推动肿瘤生长。现有治疗策略多依赖于针对特定KRAS突变的共价或可逆抑制剂，但这些方法局限于单一突变。小分子异双功能降解剂(PROTAC)正在为肿瘤学药物开发带来变革，已开发出针对KRASG12C的共价结合PROTAC，但缺乏降解剂的催化优势。为克服这一挑战，研究开发了基于非共价结合的KRAS降解剂，尤其是KRASG12D降解剂已进入临床试验。在本研究中，科学家通过结构引导设计开发了小分子ACBI3，能够选择性降解13种最常见的KRAS突变体，展示了在KRAS突变小鼠模型中显著调节信号通路并诱导肿瘤消退。这一研究为开发广泛靶向KRAS突变的新型降解剂提供了潜在的临床应用前景。
02
VHL型KRAS降解剂的确定
这项研究通过结构引导设计，开发了一种新型基于非共价KRAS结合剂的VHL型KRAS降解剂。首先，研究团队选择了高亲和力KRAS开关II口袋配体作为起点，并通过共晶结构分析确定了H95、E62和D92形成的暴露于溶剂的亚口袋作为PROTAC接头的安装位置（图1A）。通过维持该区域的碱性中心，研究开发了化合物1，其在表面等离子体共振（SPR）实验中表现出较好的亲和力（Kd = 25 nM）。进一步的筛选测试表明，化合物2能够有效诱导KRASG12D与VHL的三元复合物形成，表现出极高的协同性（α = 479）和较长的解离半衰期（图1B-D）。在细胞实验中，化合物2有效降解了GP5d细胞中的KRASG12D，并在SW620细胞中降解了KRASG12V（图1E）。
为了优化化合物的降解效力，研究团队通过将接头中的氧原子替换为亚甲基，合成了化合物3。该化合物在保持高协同性和三元复合物稳定性的同时，显著提高了对KRASG12D（DC50 = 32 nM, Dmax = 99%）和KRASG12V（DC50 = 278 nM, Dmax = 88%）的降解效力（图1C-E）。蛋白质印迹法的结果进一步验证了这些降解效力。此外，通过靶向蛋白质组学分析，化合物3表现出对KRAS的选择性降解，而对HRAS和NRAS无显著影响（图1G）。这种选择性与设计中的KRAS配体结构相关，使其能够优先靶向KRAS突变体。
最后，通过X射线晶体学解析，研究揭示了化合物3与VHL和KRASG12V形成的三元复合物的共晶体结构（图1H），展示了“fishhook”构象的结合模式。这一结构为进一步优化KRAS降解剂提供了分子基础。尽管化合物3在KRASG12D和KRASG12V中的降解效果显著，但对KRASG12C的降解效率较低，这提示未来的研究应继续优化以扩大降解剂的适用范围。这项研究展示了基于非共价KRAS结合剂的降解剂在癌症治疗中的潜力，并为进一步开发广泛靶向KRAS突变体的治疗方案奠定了基础。
图 1. 可逆的 KRAS 选择性降解剂的确定
03
pan-KRAS降解剂的确定
随后通过结构引导设计优化了KRAS降解剂，以提高其对多种KRAS突变体的效力和选择性。研究团队首先利用化合物3的三元共晶体结构，分析其在与VHL结合中的相互作用。为增强三元复合物的稳定性，研究将VHL配体中的酰胺换成异恶唑，开发出化合物4。晶体结构显示化合物4成功参与了VHL的关键相互作用（图2A-B），延长了复合物的解离半衰期（t1/2 = 230 s），并显著改善了KRASG12D和KRASG12V的降解效力（图2C-D）。
为了更全面地评估KRAS突变体的降解效果，研究团队建立了表达多种KRAS突变体的同源细胞系，并评估了化合物4的效力。结果显示，化合物4以个位数纳摩尔效力有效降解了17种最常见KRAS突变体中的13种，以及KRASWT（图2E-F）。一些KRAS突变体，如KRASG12R和KRASQ61L/K/R，由于GTPase活性的丧失，降解效力较低。这些数据表明，化合物4对残留GTPase活性较高的KRAS突变体具有更强的降解能力（图2G）。
最后，研究通过无偏质谱技术评估了化合物4在细胞中的选择性，结果表明KRAS是唯一被显著降解的蛋白质，而NRAS水平无明显变化（图2H）。进一步的对照实验也证实了化合物4的VHL依赖性降解机制。总的来说，化合物4展示了高选择性的KRAS降解效果，能够有效作用于广泛的KRAS突变体，为癌症治疗提供了新的潜在策略。
04
KRAS 降解有效抑制致癌信号传导和增殖
接下来测试了化合物4对不同KRAS突变体驱动的癌细胞中致癌信号传导和增殖的选择性抑制能力。化合物4成功降解了KRAS依赖性细胞（如GP2d、SW620、NCI-H358）中的KRAS蛋白，而对KRAS非依赖性细胞（如A-375、HEK293）无明显影响。相比之下，VHL结合缺陷型的化合物5虽能与KRAS结合，但无法诱导KRAS降解。结果表明，化合物4在抑制MAPK信号传导方面的效力远高于化合物5，且在KRAS依赖性细胞中诱导了更显著的增殖抑制，效力可提高10倍以上（图3A-C）。
进一步的实验显示，KRAS降解不仅抑制了MAPK信号，还显著延缓了KRASG12D的恢复时间，导致更持久的通路抑制。相比之下，KRAS抑制剂的作用更为短暂。在300个癌细胞系中，化合物4在多种KRAS突变体（如KRASG12C、KRASG12D）中表现出强效的抗增殖作用，而在KRAS非依赖性细胞中则较为不敏感。高通量抗增殖分析还表明，化合物4的效力高于KRAS抑制剂BI-2493，并且在某些KRASQ61K突变体中的活性较弱（图3D-E）。
最后，通过磷酸化蛋白质组学分析，研究揭示了化合物4对MAPK通路的广泛调控作用。与化合物5相比，化合物4显著调节了更多磷酸化事件，尤其是与细胞周期相关的通路。总的来说，化合物4通过靶向KRAS降解，提供了比传统抑制剂更强效且持久的通路抑制，特别是在KRAS依赖性细胞中，有效阻断了致癌信号传导并抑制了细胞增殖。
05
体内 KRAS 降解导致 KRAS 突变肿瘤
小鼠的肿瘤消退
接下来评估KRAS降解剂在体内的潜在优势，并探索如何优化其药代动力学（PK）和药效动力学（PD）特性。分析显示，化合物4的体内暴露量不足，无论是静脉注射还是皮下给药，血浆浓度均未达到预测的体内DC50。进一步测试表明，化合物4在10%小鼠血清中的降解效力显著降低，因此，研究团队通过结构优化，开发了新一代KRAS降解剂ACBI3。ACBI3通过将异恶唑换为三唑，并在VHL结合位点引入羟甲基，提升了溶解度和VHL结合的稳定性。与化合物4相比，ACBI3的三元复合物解离常数（Kd）降低了四倍，显示出更强的结合稳定性和KRAS降解效力。
为了验证ACBI3的抗肿瘤活性，研究团队进行了体内药效测试。ACBI3在皮下注射后，血浆浓度覆盖了预测的体内DC50约6小时，且在小鼠GP2d肿瘤模型中观察到KRASG12D的显著降解。尽管药物暴露量在6小时后显著下降，但KRASG12D的水平未明显恢复，这表明KRAS降解的效应超出了药物在体内的存在时间。抗肿瘤功效实验显示，每天皮下注射30 mg/kg的ACBI3持续14天，导致肿瘤明显消退，肿瘤生长抑制率达到127%，显著抑制了KRAS驱动的肿瘤生长。
为进一步优化ACBI3的体内使用，研究团队开发了一种纳米研磨悬浮液，并通过腹腔内给药提高了ACBI3的体内耐受性和暴露时间。在KRASG12V突变的RKN异种移植模型中，ACBI3成功诱导肿瘤消退，证明了其在多种KRAS突变体中的广泛抗肿瘤活性。相比之下，KRAS抑制剂BI-2493也显示出一定的抗肿瘤效果，但ACBI3的降解机制提供了更持久的KRAS抑制效应。尽管ACBI3在小鼠中表现出良好的系统耐受性，但在皮下给药研究中观察到轻微的皮肤病变，因此未来的研究将更倾向于使用腹腔内给药或其他更优的给药途径。
总体而言，ACBI3在体内和体外均表现出对KRAS的强效降解和选择性，并且其抗肿瘤活性已在多种KRAS突变模型中得到验证。这些研究结果为KRAS驱动肿瘤的治疗提供了临床前概念验证，表明泛KRAS降解剂具有成为有效抗癌药物的潜力。
06
总结
KRAS激活突变在多种实体瘤中非常常见，约35%的肺癌、45%的结直肠癌和高达90%的胰腺癌与KRAS突变相关，导致每年美国约有15万新发病例。KRAS突变范围广泛，开发能够广泛靶向多种KRAS变异的小分子药物一直是药物研发的挑战。ACBI3是一种基于结构优化的广谱KRAS降解剂，能够有效靶向大多数常见的KRAS突变体，显著抑制KRAS驱动的肿瘤细胞增殖。与传统抑制剂相比，ACBI3通过招募泛素连接酶，实现对KRAS的高效降解，MAPK信号传导的抑制效力比抑制剂提高10倍以上，持久抑制致癌信号。此外，ACBI3在体内表现出显著的抗肿瘤活性，能够延长药效并导致肿瘤消退。研究还表明，ACBI3能够克服与KRAS突变相关的耐药性问题。该分子的成功开发为具有高度未满足医疗需求的KRAS突变型恶性肿瘤提供了新的治疗方案，展示了靶向蛋白质降解剂的潜力。
DOI: 10.1126/science.adm8684
