PROTAC中常用的E3连接酶VHL和CRBN仅在少数肿瘤中高表达，从而限制了PROTAC药物的应用范围和疗效。近日清华大学李景虹院士报道了ClickRNA-PROTAC，通过mRNA转染表达E3泛素连接酶SIAH1和SNAPTag的融合蛋白， 并通过生物正交点击化学招募目标蛋白质。该策略只需更换弹头分子即可有效降解BRD4、KRAS和NFκB等多种蛋白质。该工作发表在近期的JACS（doi: 10.1021/jacs.4c06402）
背景
大多数进入临床II期或目前处于临床阶段的PROTAC药物都是利用E3连接酶VHL和CRBN来介导靶蛋白的泛素化，然而E3泛素连接酶在不同肿瘤中的表达水平存在差异，限制了PROTAC药物在癌症治疗中的应用范围和疗效。此外，PROTAC分子缺乏肿瘤特异性，会导致正常细胞中靶蛋白的降解， 对正常细胞造成伤害，并产生毒副作用。迫切需要开发不依赖内源性E3连接酶的肿瘤选择性PROTAC药物。
ClickRNA-PROTAC
ClickRNA-PROTAC通过mRNA转染在活细胞中表达共价标签与E3泛素连接酶的融合蛋白，并通过二苯基环辛炔（DBCO）修饰的配体使融合蛋白功能化，再通过生物正交点击化学将叠氮化物偶联的POI配体连接到融合蛋白上，诱导POIs泛素化降解。同时，利用基于UAG终止密码子的AI碱基编辑的肿瘤特异性mRNA 响应翻译调控策略，ClickRNA-PROTAC可选择性地降解肿瘤细胞中的POIs。
设计
合成的mRNA由5′感知区和3′蛋白质编码区组成，中间有一个UAG终止密码子，以防止初始状态下3′蛋白质编码区翻译。在肿瘤细胞中，5′传感区与肿瘤特异性mRNA杂交，形成AC错配的双链RNA，从而激活ADAR介导的A到I碱基编辑，将UAG终止密码子变为UIG密码子。这样，3′蛋白质编码区的翻译就被重新激活，随后T2A自切割肽发生自我切割，释放出效应蛋白。由于正常细胞中缺乏肿瘤特异性mRNA，无法形成含有A－C错配的双链RNA，无法激活A－I碱基编辑，使UAG终止密码子保持完整。
Tag-E3融合蛋白及叠氮共轭配体的构建与优化
作者基于13种具有代表性的不同家族的E3泛素连接酶和2种广泛使用的共价SNAPTag和HaloTag构建了52种不同的Tag-E3 融合蛋白。52种融合蛋白的质粒分别转染到HEK293FT细胞中，并通过WB分析验证52种融合蛋白的表达水平。 其中有16 种表达良好的融合蛋白，包括NEDD4L-SC、SIAH1-SN、 NEDD4L-HN等。
随后，选择BRD4蛋白作为POI，用WB分析 BRD4的相对表达水平。观察到一些Tag-E3融合蛋白成功降解了BRD4蛋白，证明了ClickRNA-PROTAC系统的可行性。其中，SIAH1-SN、VHL-HC和PARKIN-HN表现出最好的降解能力，降解了约74％的BRD4。
SIAH1-SN虽然有效，但仍然不能完全降解目标蛋白。在PROTAC分子中，连接子的长度直接影响POI与E3泛素连接酶的相互作用，进而影响 Dmax。因此优化了叠氮基和POI配体分子之间的链长，以增加Dmax。WB结果表明JQ1-N3-C10是最佳的叠氮共轭配体。此外，蛋白酶体抑制剂MG-132或bortezomib可以有效抑制BRD4蛋白的降解，从而证实了ClickRNA-PROTAC系统依赖于蛋白酶体的降解机制。
ClickRNA-PROTAC靶向蛋白降解能力
在获得最佳融合蛋白SIAH1-SN和最佳叠氮化物共轭配体JQ1-N3-C10后，验证以mRNA形式递送ClickRNA-PROTAC系统的性能。在400 ng SIAH1-SN mRNA和1 μM BG-DBCO条件下，测得JQ1-N3-C10 的IC50为300 nM。在相同条件下，ClickRNA-PROTAC对BRD4的降解表现出JQ1-N3-C10剂量依赖性，DC50约为77.2 nM。WB结果证实ClickRNA-PROTAC可用于降解KRAS和p65蛋白。此外，蛋白质组学结果进一步阐明了ClickRNA-PROTAC对BRD4、KRAS和p65的靶蛋白降解能力。这些结果表明，不同的小分子或ODN弹头可用于ClickRNA-PROTAC并具有良好的性能。
靶向肾上腺皮质癌的ClickRNA=PROTAC
基于肿瘤特异性mRNA应答翻译调控策略，设计并筛选出能够特异性激活肾上腺皮质癌效应蛋白（ACC）翻译的肿瘤特异性mRNA传感区序列。合成mRNA的5′设计mCherry荧光蛋白的编码序列，使mCherry持续翻译，通过荧光成像监测转染效率。传感序列IGF2-4可以特异性地诱导肾上腺皮质癌SW-13细胞系中的效应蛋白翻译，而正常肾上腺皮质HACC细胞中IGF2 mRNA表达量很低，信号差异达156倍。临床数据和来自TCGA的大量mRNA-seq数据表明，BRD4高表达的ACC患者生存率明显较差，表明BRD4是治疗ACC的潜在靶点。BRD4降解和细胞活力实验表明，ClickRNA-PROTAC可以特异性地降解SW-13细胞系中的BRD4并杀死SW-13细胞，而正常的HACC细胞由于无法表达SIAH1-SN而不受影响。
ClickRNA-PROTAC体内肾上腺皮质癌的靶向治疗
将SW-13细胞悬浮液注射到雌性Balb/c裸鼠体内，并在植入后9天开始给药，每 5天给药一次，共三个周期，在15天内监测小鼠的状态。对肿瘤体积的观察显示ClickRNA-PROTAC显着抑制了肿瘤生长。与传统的dBET1 PROTAC 相比，ClickRNA-PROTAC表现出优越的抗肿瘤作用。肿瘤裂解物的WB分析证实了肿瘤组织中BRD4的降解和细胞凋亡的诱导。抗肿瘤实验结束后，小鼠主要脏器（如心脏、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏）进行H&E染色检查，未发现明显组织损伤。因此，ClickRNA-PROTAC可以选择性地杀死肿瘤，且没有明显的副作用，显示出其在ACC临床治疗中的潜力。
总结
ClickRNA-PROTAC 首先克服了不同肿瘤之间E3泛素连接酶表达水平差异的限制，扩大了PROTAC技术的应用范围；其次，ClickRNA-PROTAC的肿瘤靶向性减少了副作用；第三是可修改的，可以通过更换弹头来降解不同的POI，为PROTAC药物的开发和临床使用提供了新的思路。
参考文献doi: 10.1021/jacs.4c06402
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