肽基脯氨酰顺反异构酶(PIN1)是肽基脯氨酰异构酶parvulin家族的一员，它通过特异性识别和异构化蛋白质中的磷酸化Ser/Thr−Pro基序，对蛋白质的功能、稳定性和细胞定位产生重要影响。这一过程在多种生物过程中扮演着关键角色。研究发现，PIN1在多种人类癌症中表达量异常升高，因此成为了抗癌研究的潜在靶点。最近成都先导和科伦博泰在PIN1靶点的研发上取得了重要进展，为该领域的研究提供了重要的启示。
背景
PIN1是一种在癌症中具有重要作用的酶，既能被致癌基因如HER2、KRAS激活，也能被肿瘤抑制基因如RB1、DAPK1抑制。它通过调节相关基因的活性影响癌症进程。研究PIN1在癌症中的作用及其抑制剂的开发是当前的研究热点。传统的PIN1抑制剂设计通常模仿其天然磷酸盐底物的结构，通过引入羧酸或磷酸基团来实现。然而，这种方法存在一定的局限性。酸性基团可能会降低抑制剂的透膜性，从而影响其在细胞水平上的活性。此外，酸性基团还可能导致化学或代谢上的不稳定性，这限制了这些抑制剂的实用性和有效性。因此探索新的设计策略和分子实体来克服这些挑战，并开发出更有效、更稳定的PIN1抑制剂将显得尤为重要。
结果与讨论
新的先导化合物的筛选和优化
在这些重合成的化合物中，化合物A0表现出了良好的PIN1抑制活性（KD=430 nM, IC50=420 nM），并且该化合物是具有不含酸性基团的新颖化学结构。之后基于DEL筛选数据，研究团队对A0进行了系统性的结构优化，设计并合成了41个相关小分子化合物。其中，化合物C10展现出了最强的PIN1结合亲和力和酶学活性（KD=25 nM, IC50=150 nM）。
PIN1 抑制剂和PROTACs的抗增殖活性
在多种癌症类型中，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、食管癌、肝癌和鼻咽癌，PIN1蛋白的高表达与患者的不良预后密切相关。为了探究PIN1在癌症治疗中的潜在作用，研究者们选用了MDA-MB-468乳腺癌细胞系、PANC-1胰腺癌细胞系和Huh-7肝癌细胞系，对四个优选化合物的细胞活性进行了评估。尽管这些化合物在分子属性（如分子量和ClogP）方面表现良好，但它们在抑制细胞增殖方面的效果并不显著，这可能是由于它们的透膜性不足所致。
鉴于靶向嵌合体蛋白水解（PROTAC）分子的催化机制对透膜性的要求相对较低，并且能够促进细胞内PIN1蛋白的降解，这为癌症治疗提供了一种新策略。因此，研究者们选择了溶解性和代谢稳定性更佳的化合物A6作为POI配体，以及沙利度胺作为CRBN配体，合成了针对PIN1的PROTAC分子。尽管这些设计的PROTAC分子在降解活性上表现出色（DC50小于20 nM，Dmax超过90%），但令人遗憾的是，它们在MDA-MB-468、PANC-1和Huh-7细胞系上的抗增殖活性仍然较弱，这一点在表中有所体现。
PIN1 PROTAC和PIN1基因的机制研究
为了深入理解为何PROTAC分子能够有效降解PIN1蛋白，但在细胞活性方面表现不佳，研究人员对这一靶点的制剂进行了深入研究。如图A所示，PROTAC分子D4在剂量依赖性实验中显示出对PIN1蛋白的降解作用。进一步实验中，研究人员分别添加了1和5 μM的共价PIN1抑制剂Sulfopin（PIN1的抑制常数Ki为17 nM），结果显示，预先使用Sulfopin处理细胞能够显著减弱D4对PIN1蛋白的降解效果。这一发现证实了D4能够与PIN1结合，并诱导其降解。图B展示了使用50 nM的PIN1 siRNA处理MDA-MB-468细胞后，PIN1蛋白几乎被完全敲除，显示出siRNA能够特异性且高效地抑制PIN1基因的表达。然而，尽管PIN1蛋白的表达受到了抑制，其对细胞增殖的影响却相对有限。如图C所示，即使将PIN1 siRNA的浓度提高到100 nM，细胞增殖的抑制率也不足50%。这些结果表明，PIN1可能并非癌症的致死性驱动基因，而PIN1抑制剂在细胞活性方面的表现可能依赖于其他关键的驱动基因。综上所述，尽管PROTAC分子在分子层面上能够有效降解PIN1蛋白，但其在细胞层面的活性可能受到多种因素的影响，包括但不限于PIN1在癌症发展中的作用机制以及与其他驱动基因的相互作用。这些发现为未来的研究提供了新的视角，提示在开发针对PIN1的癌症治疗策略时，需要考虑更广泛的生物学背景和潜在的协同作用机制。
联合治疗
尽管研究发现单独使用PIN类抑制剂和降解分子未能展现出显著的细胞活性，但研究者们提出了一种可能的解决方案：通过联合用药策略来增强抗细胞增殖的效果。如图所示，研究者们发现，单独使用Sulfopin和奥拉帕尼对肿瘤细胞的生长有一定的抑制作用，但当这两种药物联合使用时，其抗增殖活性至少提高了10倍。为了进一步探索这种联合用药的效果，研究者们采用了五种不同的药物配比（Sulfopin与奥拉帕尼的比例分别为1:4.5, 1:1.5, 2:1, 6:1, 18:1），并观察到这些不同的配比均能产生相似的抗增殖效果。重要的是，这些实验结果表明，联合用药的抑制效果随着剂量的增加而增强，最终能够实现接近100%的细胞增殖抑制。这一发现表明，通过精心设计的联合用药策略，即使是单独效果有限的药物也有可能通过协同作用显著提高其治疗效果。这种策略不仅为PIN1抑制剂和降解分子的应用提供了新的视角，也为未来的癌症治疗研究开辟了新的方向。通过优化药物组合和剂量，可能实现更有效的抗肿瘤效果，为患者带来更大的治疗希望。
晶体学与分子对接
为了探求为什么新的小分子没有酸性基团，仍然有良好的结合能力，作者通过共晶结构研究揭示了小分子化合物C3与PIN1蛋白结合的机制。研究发现，PIN1蛋白二聚化形成共享结合口袋，容纳两个小分子配体，并通过水分子和硫酸离子与配体相互作用以增强稳定性。化合物C3与特定残基形成多个氢键，包括ARG68、ARG69、SER114、GLN129、MET130和GLN131。此外，在C3和HIS157之间观察到了Pi-Pi相互作用。关键的氢键作用于配体的四元环上羟基与蛋白ARG69残基。将最有效的化合物C10与C3复合物的PIN1晶体结构进行分子对接，结果表明C10的结合模式和关键相互作用与共晶体结构中C3的结合模式和关键相互作用相同。两个关键的结构修饰增强了C10的结合亲和力。这些修饰可改善C10与靶标的相互作用，适度增强其生物活性。
总结
在对HitGen的1万亿DEL化合物库进行深入筛选后，研究团队成功鉴定出一种新型且高效的中性PIN1抑制剂A0。这一发现不仅证实了利用大规模DEL化合物库发掘非酸性PIN1抑制剂的可行性，而且为针对这一具有挑战性的靶点开发更高效化合物提供了宝贵的手段。基于A0的结构，研究者进一步设计并合成了一系列衍生物，以增强其生物活性。在这些衍生物中，化合物C10以其出色的结合亲和力（KD = 25 nM）和酶抑制活性（IC50 = 150 nM）脱颖而出。通过解析PIN1与C3复合物的X射线晶体结构，研究揭示了该蛋白与新型抑制剂之间的关键相互作用，为后续化合物的优化提供了明确的指导。为了拓宽这类抑制剂的应用前景，研究团队设计并合成了PIN1 PROTACs，并对其降解能力进行了评估。结果显示，PROTAC D4展现出了卓越的降解活性（DC50 = 18 nM, Dmax = 92.52%）。尽管如此，PIN1抑制剂和PROTACs在MDA-MB-468细胞株上的抗增殖活性并不显著。通过使用PIN1 siRNA进行的生物学功能研究进一步表明，PIN1基因的敲低对MDA-MB-468细胞系的增殖影响有限，这暗示了PIN1可能不是一个理想的单一靶点用于癌症治疗。然而，研究也发现，PIN1抑制剂与PARP抑制剂联合使用时，对BRCA1-WT乳腺癌细胞具有显著的协同杀伤效应。综上所述，本研究不仅为中性PIN1抑制剂的发现奠定了坚实的基础，而且明确指出了PIN1作为单一靶点在癌症治疗中的局限性。未来的研究将探索PIN1与其他靶点联合治疗癌症的新策略。
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