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前言
Journal of the American Chemical Society
粪肠球菌(E. faecium)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)、肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(A. baumannii)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和肠杆菌属(Enterobacter species)被统称为ESKAPE，是最具威胁的的细菌病原体。其中肠杆菌科和鲍曼不动杆菌被CDC(疾病预防控制中心)列为最高威胁级别。但当前开发的抗生素中预计只有 38% 能够有效对抗 ESKAPE 病原体。
万古霉素是一种强效的糖肽类抗生素，通过静脉注射作为一线疗法，用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)皮肤和软组织感染、MRSA菌血症和艰难梭菌感染。然而其对生物膜相关的金黄色葡萄球菌无效。万古霉素也能抑制分枝杆菌的肽聚糖合成，但其对分枝杆菌的 MIC 较高，疗效较差，主要是因为万古霉素无法穿透含有肽聚糖层以外的阿拉伯半乳聚糖和菌酸的复杂细胞壁。同时万古霉素对革兰氏阴性菌的 MIC 较高，因此对这些菌株无效，对万古霉素的这种耐药性是因为革兰氏阴性菌的外膜，其阻止抗生素在周质中积累，抗生素不能抑制肽聚糖的合成。
单双胍和多双胍类药物已单独用作抗生素和膜通透剂，双胍类药物与万古霉素共同使用时，可通过膜破坏使病原体对抗生素蓄积敏感。据此，斯坦福Paul A. Wender小组报道了一系列新型双胍-万古霉素结合物的合成和活性，这些结合物对活跃生长和生物膜相关的 ESKAPE 病原体和分枝杆菌均具有广谱活性。
图 1 新型双胍-万古霉素结合物
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双胍-万古霉素结合物的设计和合成
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作者使用双胍功能团作为抗生素活性阳离子增强剂。双胍和胍功能团具有一些共同的特性，例如在生理条件下具有相似的 pKa 值并且能够与阴离子和中性氢键接受底物包括细胞表面阴离子(磷酸盐、硫酸盐和羧酸盐，图 2A)进行静电阳离子-阴离子和氢键相互作用。作者选择六亚甲基连接物，通过氨基双胍与万古霉素结合，得到双胍-抗生素结合物(图 3)。六亚甲基连接物（类似于双双胍类抗生素阿莱西定和氯己定中的六亚甲基连接物）可通过肽键将万古霉素的 C 端与双胍部分结合(图 2)。
图 2 双胍-万古霉素结合物的设计
图 3 双胍-万古霉素结合物的合成
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先导化合物 5e 的作用方式表征
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作者通过一列筛选最终确定了先导化合物V–C6–Bg-PhCl(5e)。并研究了其作用方式，自溶酶的活性降解外层细胞壁，最终消除细胞活力，这一过程需要时间来积累有缺陷的细胞壁，因而万古霉素的杀灭动力学上缓慢。作者采用了一种传统的时间分辨活力测定法，该测定法基于抗生素处理后每毫升 (mL)菌落形成单位(CFU)中活细胞的计数，以评估 5e在每个参考菌株中的杀灭动力学是否与万古霉素相似(图 4)。在金黄色葡萄球菌中，5e显示出与万古霉素相似的杀灭动力学。在万古霉素在临床相关浓度下无效的大肠杆菌中，MIC 评估显示5e的有效性约为万古霉素(vancomycin，V)的16倍，并且在此处显示的 16 μM 杀灭动力学与高剂量的V(256 μM)相当(图 4B)。与万古霉素样作用模式相似，5e也通过抑制细胞壁合成起作用，这导致其相对较慢的杀灭曲线。
图 4 5e与万古霉素(V)动力学实验对比
万古霉素与脂质II的结合可阻止细胞壁合成并导致可溶性细胞内肽聚糖前体(也称为 Park 核苷酸)的积累。为了能够在三种参考菌株中对肽聚糖前体进行分子检测，作者进行了一系列实验，在金黄色葡萄球菌中，用万古霉素处理和用5e处理后UDP-MurNAc 五肽的积累相当(图 5A)。在用5e(16 μM) 处理的大肠杆菌时，UDP-MurNAc 五肽的积累量明显高于用 16 倍浓度万古霉素(256 μM)处理的大肠杆菌(图 5B)。对于 M. smegmatis，用5e处理后细胞壁前体的积累量略多，但总体上相当，与用万古霉素处理的细胞相比 (图 5C)。这三种菌株的总体结果强调5e通过类似万古霉素的机制抑制细胞壁合成。
图 5 5e与万古霉素 (V)作用机制研究
荧光探针碘化丙啶(PI)不会在健康的活细胞中积累，但如果膜完整性受到干扰，PI 可以进入细胞质并与 DNA 结合，从而导致荧光增强。用双胍5e处理金黄色葡萄球菌时，荧光探针碘化丙啶(PI)荧光增加(图 6A)，而用万古霉素处理时，荧光没有增加。这证明胍基转运蛋白本身不具有抗菌活性，但当与万古霉素缀合时，缀合物可以促进与细胞表面的磷壁酸磷酸盐和脂质 II 焦磷酸盐的相互作用。
1-N-苯基萘胺(NPN)是一种敏感的报告基因，在进入并掺入外膜磷脂内叶的疏水环境时会发出荧光。NPN 积累通常表明 LPS 不稳定和膜通透性增加。用 80 μM(10× MIC)的5e处理大肠杆菌25922导致 NPN 荧光增加，与外膜不稳定一致(图 6B)，而用万古霉素处理则未显示荧光增加。这表明在分子水平上，局部膜扰动而不是整体膜损伤或破裂，与万古霉素样杀灭动力学相一致。
在分枝杆菌中，溴化乙啶(EtBr)主要通过孔蛋白 MspA和MspC进入细胞，并与 DNA 结合时发出荧光。为了测定5e对M. smegmatis的影响，用 8 μM (1× MIC)的5e或万古霉素处理 M. smegmatis 不会影响 EtBr 荧光(图 6C)。因此，对于本测定中的 M. smegmatis，5e的活性并不表示对膜完整性或通透性的伴随影响。
图 6 5e治疗后细菌膜通透性的评估
最后，作者用相同浓度的荧光素结合万古霉素(Fl-V)或5e 衍生物(Fl-5e)处理金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和 M. smegmatis ，在相同的激发光强度和曝光时间下均表现出明显更高的荧光(图 7)。荧光显微镜观察到的Fl-V和Fl-5e细胞结合之间的差异得到了荧光激活细胞分选的支持，该分选以每个细胞为基础量化荧光(FACS，图 7)。在每个生物体中Fl-5e表现出比Fl-V更强的细胞结合。与细胞表面的脂质II和/或膜相比，Fl-5e在革兰氏阳性菌中，和磷壁酸磷酸盐的总体结合更强。Fl-5e在分枝杆菌中表现出增强的肽聚糖识别，并且与外膜的结合增强，以促进和增强Fl-5e进入周质的运输，以进入革兰氏阴性菌中的细胞内靶标。
图 7 荧光结合物对 5e进行细胞定位
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总结
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双胍-万古霉素结合物是有效的广谱抗生素，可对抗活跃生长和生物膜相关的革兰氏阳性和革兰氏阴性 ESKAPE 病原体和分枝杆菌 提高现有抗生素疗效和/或扩大其活性范围的策略为临床解决日益严重的抗生素耐药性感染危机提供了一条潜在的快速途径。斯坦福Paul A. Wender小组报告了一类新型双胍-抗生素结合物V–C6–Bg-PhCl的合成、抗菌功效和机械活性。可诱导高效细胞杀灭，与母体化合物万古霉素相比，对万古霉素耐药肠球菌的杀灭效果提高了2个数量级。V–C6–Bg-PhCl 还表现出能增强对分枝杆菌和 ESKAPE 病原体(包括革兰氏阴性菌(的抗菌活性。此外，其对生物膜相关革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，以及临床使用的抗生素(如奥利万星)未观察到的分枝杆菌的广谱杀灭活性。作用方式研究表明，万古霉素样细胞壁合成抑制的疗效提高归因于通过双胍与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的相关细胞表面阴离子结合，增强了万古霉素结合位点的结合。由于其效力强、活性范围广且无急性哺乳动物细胞毒性，V–C6–Bg-PhCl是治疗抗生素耐药性感染及生长缓慢且抗生素耐受细菌(与慢性且通常无法治愈的感染有关)的候选药物。总的来说，这项研究提供了一种增强抗生素活性和促进临床进入的新策略(双胍化)。
参考文献：10.1021/jacs.4c06520
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