混合谱系蛋白激酶 3 (MLK3) 是丝氨酸/苏氨酸激酶 MLK 家族的一员，属于丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶 (MAP3K) 的成员，主要通过磷酸化 MAP2K MKK4/7 和 MKK3/6 激活 JNK 和 p38 MAPK 通路，此外还直接激活 ERK MAPK 通路。MLK3 在癌细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用，并在乳腺癌中显示出双重功能：在三阴性乳腺癌 (TNBC) 中促进细胞迁移和扩散，而在雌激素受体 (ER) 阳性和 HER2 阳性乳腺癌中则促进细胞凋亡。由于其作用复杂，靶向 MLK3 的药物开发面临挑战，目前的 MLK3 抑制剂如 CEP1347 由于特异性低而效果有限。
蛋白质降解靶向 (TPD) 技术，尤其是蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)，为选择性靶向癌症中的蛋白激酶提供了新的可能。PROTAC 通过结合目标蛋白和 E3 连接酶，促进目标蛋白的泛素化和降解。波兰科学院Anna A. Marusiak团队报道了一种新型 PROTAC，基于 MLK 抑制剂 CEP1347 和 E3 连接酶 von Hippel-Lindau (VHL) 配体，靶向 MLK3 进行降解。该 PROTAC 成功地在癌细胞系模型中特异性降解 MLK3，且显著降低 TNBC 细胞的致瘤潜力。
作者基于 MLK3 抑制剂 CEP1347 设计了不同的 PROTAC，并与不同的 E3-泛素连接酶配体连接（图 1）。此外，还合成了 8 种 PROTAC，由 CEP1347 和 von Hippel-Lindau E3 泛素连接酶 (VHL) 的配体与各种接头偶联而成（CEP1347-VHL-01-CEP1347-VHL-08）。我们还获得了 CEP1347 与凋亡蛋白 (IAP) 抑制剂配体 (CEP1347-IAP-01) 和 cereblon (CRBN) 配体 (CEP1347-CRBN-01) 连接的化合物。作者评估了基于 VHL 的 PROTAC 化合物在 MLK3 降解中的效果，通过使用强力霉素 (DOX) 诱导的 MLK3 过表达细胞系 A375_MLK3 和 HCC1806_MLK3 进行免疫印迹实验来进行研究。为了确定最佳连接子长度，研究了八种不同的 PROTAC 组合，分别标记为 CEP1347-VHL-01 至 CEP1347-VHL-08，处理 A375_MLK3 细胞 24 小时，浓度范围从 0.1 到 5 μM（图 2A）。在 HCC1806_MLK3 细胞系中，进一步测试了三种基于 VHL 的 PROTAC（CEP1347-VHL-01、CEP1347-VHL-02 和 CEP1347-VHL-03）（图 2B）。结果显示，CEP1347-VHL-02 在两种细胞系中以最低浓度实现了 MLK3 的有效降解。接着，作者评估了 CEP1347-VHL-02 在 HCC1806_MLK3 细胞系中对 MLK3 降解的动态过程。结果表明，该 PROTAC 在处理 2 小时后降低了 MLK3 水平，并在 24 小时内几乎完全降解（图 2C）。同时，CEP1347-VHL-02 的无活性顺式差向异构体未能降低 MLK3 水平，说明 MLK3 的降解是 VHL 依赖性的（图 2D）。此外，通过使用蛋白酶体抑制剂卡非佐米处理 HCC1806_MLK3 细胞，发现 CEP1347-VHL-02 对 MLK3 的降解被抑制，这确认了 MLK3 是通过泛素-蛋白酶体系统被降解的（图 2E）。随后，作者检验了 CEP1347-VHL-02 的选择性。在三种由 A375 黑色素瘤细胞生成的细胞系中，分别过表达 MLK1、MLK2 和 MLK4（即 A375_MLK1、A375_MLK2 和 A375_MLK4），发现 CEP1347-VHL-02 治疗后，这些细胞系中 MLK1、MLK2 和 MLK4 水平没有发生显著变化，表明 CEP1347-VHL-02 具有选择性地靶向 MLK3，而不影响其他 MLK 家族成员（图 2F）。图 2 A375_MLK3 和 HCC1806_MLK3 细胞中基于 CEP1347-VHL 的 PROTAC 降解 MLK3为验证 CEP1347-VHL-02 的选择性，作者对 DOX 诱导的 MLK3 过表达 HCC1806_MLK3 细胞处理后进行散弹枪蛋白质组学分析（图 3A，B）。MLK3 是唯一被 CEP1347-VHL-02 显著降解的激酶（图 3B，黑色箭头）。此外，PROTAC 处理后另有 11 种蛋白质水平下降（图 3B，蓝色方框），其中 10 种因 MLK3 过表达而上调（图 3A，黄色方框）。这表明 CEP1347-VHL-02 的作用间接减少了依赖 MLK3 的蛋白质表达。免疫印迹分析进一步确认了 CEP1347-VHL-02 在这些样本中有效降解 MLK3（图 3D）。为验证 CEP1347-VHL-02 在乳腺癌细胞系中的效果，作者在 MCF-7（ER+）和 MDA-MB-468（TNBC）细胞系中评估了其对内源性 MLK3 的降解。结果显示，CEP1347-VHL-02 能在两种细胞系中迅速降解 MLK3，其中 MCF-7 的半衰期 (t1/2) 为 2.5 小时，MDA-MB-468 为 4 小时（图 4A）。PROTAC 在 MCF-7 细胞中的半最大降解浓度 (DC50) 为 50 nM，最大降解水平 (Dmax) 为 77%；在 MDA-MB-468 细胞中的 DC50 为 300 nM，Dmax 为 63%（图 4B）。使用卡非佐米抑制剂证明 CEP1347-VHL-02 通过泛素-蛋白酶体途径降解 MLK3（图 4C）。在 MDA-MB-468 和 MCF-7 细胞中测试的其他基于 VHL 的 PROTAC 也证实了 CEP1347-VHL-02 的最佳降解效力（图 4A ）。图4 CEP1347-VHL-02 PROTAC 在 MCF-7 和 MDA-MB-468 细胞系中降解内源性 MLK3。为了评估 CEP1347-VHL-02 对癌细胞增殖和存活的影响，作者对 MCF-7和 MDA-MB-468细胞系进行了分析。图 5A 显示，CEP1347-VHL-02 处理显著降低了 MDA-MB-468 细胞的克隆形成潜力，而 MCF-7 细胞未受影响。流式细胞术分析（图 5B）显示，CEP1347-VHL-02 处理的 MDA-MB-468 细胞在 G2/M 期发生了细胞周期停滞，并且细胞凋亡增加（图 5C）。迁移分析（图 5D）表明，CEP1347-VHL-02 处理后 MDA-MB-468 细胞的迁移减少，而 MCF-7 细胞的迁移未受影响。这些结果表明，MLK3 降解选择性地降低了 TNBC 细胞的致瘤性和侵袭性，其中 MLK3 起着致瘤作用。图 5 CEP1347-VHL-02 化合物降解内源性 MLK3 降低了 MDA-MB-468 细胞的致瘤潜力，但没有降低 MCF-7 细胞的致瘤潜力波兰科学院Anna A. Marusiak团队报道了一种first-in-class PROTAC CEP1347-VHL-02，可诱导癌细胞系中 MLK3 的快速和选择性降解。CEP1347-VHL-02基于泛 MLK 抑制剂 CEP1347 和 E3 连接酶 von Hippel-Lindau (VHL) 的配体，采用蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 技术。其在几种细胞系模型中通过泛素-蛋白酶体系统有效地靶向 MLK3 进行降解，但不会降解其他 MLK 家族成员。此外，CEP1347-VHL-02 可有效降解 MLK3 并抑制其在 TNBC 中的致癌活性，测量指标为克隆形成和迁移潜力的降低、细胞周期停滞以及 MDA-MB-468 细胞凋亡的诱导。CEP1347-VHL-02是一种有前景的靶向 TNBC 中 MLK3 的新策略。"本公众号发布内容重在分享，仅代表作者个人观点，如涉及侵权，请联系公众号助手我们将第一时间删除，谢谢!"
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